王慧蓮，展俊平，苗喜云，孟慶良，馬俊福

河南省中醫(yī)院風(fēng)濕病科，鄭州 450000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以炎性細(xì)胞浸潤為特征的，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和骨發(fā)生退變的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]，其中滑膜炎癥是最主要的病理表現(xiàn)[2]?；こ衫w維細(xì)胞是滑膜的主要組成細(xì)胞，在RA發(fā)生發(fā)展過程中異常增生，并通過分泌炎性介質(zhì)進(jìn)一步導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨損傷，是RA治療的重要靶細(xì)胞之一[3-4]。目前臨床上多采用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、青霉胺等藥物治療RA，但易引發(fā)惡心、嘔吐、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等不良反應(yīng)，嚴(yán)重危害患者的健康[5]。近年來，中藥因來源廣、毒性小和藥效高等特點(diǎn)，成為RA治療的研究熱點(diǎn)[6-7]。中藥丹參常用于心血管疾病、糖尿病、皮膚病和關(guān)節(jié)炎等的治療中[8]，其主要活性成分丹酚酸B(salvianolic acid B)具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎等功效[9]。但目前丹酚酸B對RA的治療作用及其機(jī)制尚未明確。本研究探討了丹酚酸B對人RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制，以期為丹酚酸B在RA中的應(yīng)用和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 丹酚酸B(純度98%)購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒購自美國Abcam公司；caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和β-actin蛋白一抗及二抗購自美國Santa Cruz公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自美國Sigma公司。流式細(xì)胞儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人R A 滑膜成纖維細(xì)胞M H 7 A(JNO171-925)購自廣州吉妮歐生物有限公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。丹酚酸B用DMEM培養(yǎng)基配制為100 μmol/L的母液。取對數(shù)生長期MH7A細(xì)胞，接種于96孔板(2×103個/孔)進(jìn)行藥物處理和分組培養(yǎng)。

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 MH7A細(xì)胞分別加入含終濃度為0、1、10、20、30、40和50 μmol/L丹酚酸B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，隨后加入終濃度為5 mg/ml的MTT，37 ℃孵育4 h；棄上清，加入150 μl DMSO，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組－OD空白組)/OD空白組×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 MH7A細(xì)胞分別加入含終濃度為0、30、40和50 μmol/L丹酚酸B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，隨后加入0.5%胰蛋白酶進(jìn)行消化；離心重懸后，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3 細(xì)胞分組及處理 取對數(shù)生長期MH7A細(xì)胞，接種于96孔板(2×103個/孔)中，設(shè)置對照組、丹酚酸B組與丹酚酸B+3-MA組。對照組正常培養(yǎng)，丹酚酸B組加入終濃度為50 μmol/L的丹酚酸B培養(yǎng)，丹酚酸B+3-MA組加入50 μmol/L丹酚酸B和5 mmol/L自噬抑制劑3-MA共同培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，檢測各組細(xì)胞增殖和凋亡情況，caspase-3mRNA和蛋白的表達(dá)情況，以及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的表達(dá)情況。

1.3.1 各組細(xì)胞增殖和凋亡情況檢測 按照1.2.1和1.2.2方法檢測各組細(xì)胞增殖和凋亡情況。

1.3.2 qRT-PCR檢測capase-3mRNA相對表達(dá)水平

按Trizol試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA并測定其濃度。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45個循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物由上海生工生物工程有限公司合成。Caspase-3：正義鏈5'-GAATCCACGAGCAGAGTCAA-3'，反義鏈5'-TAGCCTTCAACAAGCCAACC-3'；β-actin：正義鏈5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反義鏈5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。以β-actin為內(nèi)參，采用2–ΔΔCt法計(jì)算caspase-3mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3.3 Western blotting檢測caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的相對表達(dá)水平

加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)模1 h，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和β-actin蛋白一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜；漂洗后加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。采用X線膠片曝光，用Image-Pro Plus 7.0軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹酚酸B 對M H 7 A 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 M T T 法 檢 測 結(jié) 果 顯 示，與0 μ m o l/L 組 比較，1、10和20 μmol/L丹酚酸B處理對MH7A細(xì)胞增殖沒有明顯影響(P>0.05)，而30、40、50 μmol/L丹酚酸B組MH7A細(xì)胞增殖率明顯降低(75.71%±5.36%、67.33%±6.32%、53.34%±2.73%vs.89.24%±3.10%)，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖1A)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，30、40和50 μmol/L丹酚酸B組細(xì)胞凋亡率明顯升高(15.7%±0.5%、22.5%±1.7%、30.1%±1.5%vs.11.2%±1.3%，P<0.05，圖1B)。據(jù)此選擇50 μmol/L丹酚酸B進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 丹酚酸B對MH7A細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.1 Effect of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.2 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，丹酚酸B組細(xì)胞增殖率明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與丹酚酸B組比較，加入自噬抑制劑3-MA處理的MH7A細(xì)胞增殖率明顯升高(63.47%±1.94%vs. 51.33%±4.67%)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(21.4%±1.8%vs. 30.4%±0.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis of MH7A cells by regulating autophagy

2.3 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細(xì)胞中caspase-3mR NA和蛋白以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blotting和qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，丹酚酸B組MH7A細(xì)胞中caspase-3mRNA(1.27±0.15vs. 0.61±0.03)和蛋白(1.10±0.09vs.0.42±0.07)相對表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與丹酚酸B組比較，丹酚酸B+3-MA組MH7A細(xì)胞中caspase-3mRNA(0.83±0.06)和蛋白(0.64±0.05)相對表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A、B)。

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，丹酚酸B組MH7A細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(1.23±0.21vs. 0.23±0.03)、Beclin-1(1.05±0.08vs.0.22±0.04)蛋白相對表達(dá)水平升高，p62(0.20±0.02vs.1.38±0.08)蛋白相對表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與丹酚酸B組比較，丹酚酸B+3-MA組MH7A細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(0.29±0.07)、Beclin-1(0.36±0.05)蛋白相對表達(dá)水平降低，p62(0.97±0.06)蛋白相對表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3C)。

圖3 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細(xì)胞中caspase-3及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of salvianolic acid B on the expressions of caspase-3 and autophagy related protein in MH7A cells by regulating autophagy

3 討 論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，臨床上該病患者的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞和畸變，關(guān)節(jié)功能受到影響，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[10]。RA滑膜成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡失衡是引起滑膜增生和關(guān)節(jié)炎癥的主要原因[11]。一方面，滑膜成纖維細(xì)胞增生對軟骨和骨關(guān)節(jié)等組織進(jìn)行直接的浸潤和破壞；另一方面，滑膜成纖維細(xì)胞可通過募集免疫細(xì)胞并與其相互作用促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，間接破壞骨關(guān)節(jié)[12]。因此，調(diào)控滑膜成纖維細(xì)胞是藥物治療RA的重要機(jī)制之一。

丹酚酸B是丹參的主要活性成分[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B具有抑制細(xì)胞異常增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[14]。但目前關(guān)于丹酚酸B對RA滑膜成纖維細(xì)胞作用的研究較少。本研究采用不同濃度的丹酚酸B作用于MH7A細(xì)胞，結(jié)果顯示，低濃度(1、10、20 μmol/L)的丹酚酸B對MH7A細(xì)胞增殖沒有明顯影響，而30～50 μmol/L的丹酚酸B可呈濃度依賴性的抑制MH7A細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步檢測有效濃度的丹酚酸B對MH7A細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，丹酚酸B可明顯促進(jìn)MH7A細(xì)胞凋亡。由此可見，丹酚酸B能夠有效抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，提示丹酚酸B可能對RA有治療作用。

目前RA的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬是RA進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一[15]。自噬又稱為Ⅱ型程序性死亡，是可溶性大分子或細(xì)胞器等被運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解的過程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生存方面發(fā)揮著重要作用[16]。Beclin-1(又稱Atg6)是自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子之一，可與其他Atg蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)自噬體的形成，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬過程[17]。LC3是檢測自噬活性的標(biāo)志蛋白[18]。在自噬過程中，胞質(zhì)內(nèi)的Ⅰ型LC3蛋白經(jīng)過泛素樣加工修飾后，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成Ⅱ型LC3蛋白。LC3-Ⅱ蛋白特異性地結(jié)合至自噬泡膜表面，并在自噬體形成過程中發(fā)揮重要作用，因此常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值評估自噬水平[19]。銜接蛋白p62可與LC3相互結(jié)合，是自噬受體和自噬的選擇性底物[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬減緩腎炎、腎纖維化、帕金森病、結(jié)直腸癌等疾病的發(fā)展[21-24]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，丹酚酸B組MH7A細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表達(dá)上調(diào)，p62表達(dá)下調(diào)，表明丹酚酸B可促進(jìn)RA滑膜成纖維細(xì)胞的自噬過程。

自噬廣泛參與心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[25]。許珂等[26]發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而促進(jìn)RA滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡，提高RA的治療效果。范紫微等[27]研究發(fā)現(xiàn)，五味子木脂素可通過促進(jìn)自噬而抑制關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)。本研究采用自噬抑制劑3-MA和丹酚酸B共處理MH7A細(xì)胞，結(jié)果顯示，MH7A細(xì)胞增殖率明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，表明丹酚酸B對RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用可能是通過促進(jìn)自噬產(chǎn)生的。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。但本研究未在RA動物模型中探索丹酚酸B的藥物毒性和適用濃度，后續(xù)研究可在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中驗(yàn)證丹酚酸B的作用，并探索其衍生物和適用劑型，為丹酚酸B在臨床RA治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。