涂東，于杰，蔡文科，羅小迪，高陽，陳瑜，余冰玉，羅國軍

解放軍聯(lián)勤保障部隊第920醫(yī)院心胸外科，昆明 650032

胰腺癌是一種高侵襲性、高致命性的惡性腫瘤[1]，全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年胰腺癌新發(fā)病例495 773例，死亡466 003例，死亡病例占新發(fā)病例的90%以上，在全球癌癥死亡原因中居第8位[2]，在中國居第6位[3]，在美國居第3位[4]，預(yù)計2030年在美國將升至第2位[5]。目前胰腺癌仍缺乏較好的檢測和治療手段，超過90%的胰腺癌患者確診時已是晚期并發(fā)生轉(zhuǎn)移，生存期不超過1年，5年生存率僅7%[6]；其主要治療手段仍是手術(shù)切除結(jié)合輔助療法[7]，但僅20%的患者適合手術(shù)，且術(shù)后80%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)并最終死亡[8]。嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)免疫療法是一種過繼T細(xì)胞療法，首先從患者血液中分離T細(xì)胞，然后通過基因工程手段使T細(xì)胞可以識別腫瘤細(xì)胞上的抗原并殺死腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為是一種安全可靠的免疫療法。目前CAR-T療法已在血液系統(tǒng)腫瘤治療中取得巨大成功，靶向CD19的CAR-T對耐藥性B細(xì)胞惡性腫瘤展示出持久的緩解效果[9-11]，對于復(fù)發(fā)和難治的急性B淋巴細(xì)胞白血病患者治愈率達(dá)80%～90%[12]；目前已有4項靶向CD19、1項靶向B細(xì)胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)的CAR-T產(chǎn)品被美國FDA批準(zhǔn)上市，分別用于治療B細(xì)胞型急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)[13]和復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤，這標(biāo)志著腫瘤免疫治療進(jìn)入了新時代。CAR-T療法在血液系統(tǒng)腫瘤治療中的成功也為實體瘤的治療帶來了希望，目前已發(fā)現(xiàn)一系列實體瘤CAR-T細(xì)胞靶抗原，并用于早期臨床試驗[14]，如間皮素(mesothelin，MSLN)[15-16]、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGFR)或表皮生長因子突變體Ⅲ(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)[17-18]、上皮細(xì)胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)[19]、黏蛋白1(Mucin 1，MUC1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)[20]、前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)[21]等。胰腺癌CAR-T療法已有較多研究報道，目前已發(fā)現(xiàn)多個抗原靶點，如MUC1、MSLN、HER2(ERBB2)、CE A(CE ACAM5)、CD133(PROM1)、前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)等，并開展了多項臨床試驗。本文綜述了基于上述靶點的胰腺癌CAR-T治療的最新研究進(jìn)展，以期為CAR-T用于胰腺癌的臨床治療提供新思路。

1 CAR-T療法與實體瘤

近10年來CAR-T發(fā)展迅速，目前已發(fā)展到第4代，包含胞內(nèi)信號域CD3ζ、共刺激域CD28和4-1BB、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外scFv以及細(xì)胞因子(添加細(xì)胞因子基因，能在CAR-T細(xì)胞被活化后高表達(dá)，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的活性)[22-23]。其中4-1BB屬于壞死因子受體超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)，通過激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、c-Jun和p38等信號通路促進(jìn)CAR-T的體內(nèi)存活并延長留存時間[24-25]；CD28通過激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶(phosphoinositol 3 kinase-protein kinase B，PI3K/AKT)、NF-κB、Fos等信號通路促進(jìn)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[26]；CD3ζ通過招募Zap-70激活C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)及Fos等，進(jìn)而激活T細(xì)胞[27]。CAR-T細(xì)胞scFv與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合后，胞內(nèi)信號被激活，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用：第一，CAR-T細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性顆粒、穿孔素和顆粒酶，其中穿孔素可在腫瘤細(xì)胞表面“打洞”，隨后顆粒酶被輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，通過物理作用對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷或者誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；第二，CAR-T細(xì)胞表面高表達(dá)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)配體，這些配體可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[28]；第三，CAR-T細(xì)胞分泌特定的細(xì)胞因子，如γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等[29-30]，這些細(xì)胞因子可以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的活性，改變腫瘤微環(huán)境，進(jìn)一步增強(qiáng)其抗腫瘤活性。

在血液系統(tǒng)腫瘤治療中取得的成功使CAR-T應(yīng)用于實體瘤的治療成為可能，但絕不是簡單的平移，實體瘤治療仍面臨以下難題：(1)抗原異質(zhì)性導(dǎo)致難以鑒定腫瘤細(xì)胞特異的抗原[31]；(2)T細(xì)胞很難浸潤到實體瘤內(nèi)部[32]；(3)腫瘤微環(huán)境的免疫抵抗，實體瘤微環(huán)境非常復(fù)雜，包含各種基質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞、脈管系統(tǒng)、細(xì)胞外基質(zhì)等[33]。盡管采取一些措施，如設(shè)計多靶向的CAR分子以增加靶抗原的表達(dá)，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的浸潤能力和增殖能力，以及改變Tregs介導(dǎo)的免疫抑制作用等可以部分解決上述難題，但實體瘤CAR-T治療的效果仍不理想。在眾多實體瘤中，胰腺癌的腫瘤微環(huán)境尤為極端，包括極端低氧、高密度纖維基質(zhì)、脈管系統(tǒng)少等，因此其CAR-T治療較其他實體瘤更加困難，未來靶向胰腺癌微環(huán)境可能成為突破口。

2 胰腺癌CAR-T治療靶點的選擇

選擇理想的靶點是CAR-T治療的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。目前的設(shè)計思路是根據(jù)胰腺癌的分子特征，找到胰腺癌中高表達(dá)的膜蛋白，并以這些蛋白作為抗原靶點，通過在體外改造外周血中分離培養(yǎng)的T細(xì)胞，使T細(xì)胞可以特異性識別這些抗原靶點，從而起到殺死腫瘤細(xì)胞的作用。具體思路如圖1所示。

圖1 CAR-T細(xì)胞體外改造流程及胰腺癌靶點選擇Fig.1 The in vitro modification process of CAR-T cells and target selection for pancreatic cancer

目前胰腺癌CAR-T治療的臨床研究使用較多的抗原靶點包括MUC1、MSLN、HER2(ERBB2)、CEA(CEACAM5)、CD133(PROM1)、PSCA等，這些蛋白均在胰腺癌中高表達(dá)，且與患者預(yù)后明顯相關(guān)(圖2)。

圖2 胰腺癌CAR-T抗原靶點蛋白與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between the CAR-T antigen target of pancreatic cancer and the prognosis of patients

2.1 MUC1 MUC1是一種表達(dá)在細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，在80%以上的胰腺癌中高表達(dá)[34-35]，在75種潛在的腫瘤抗原中被國家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)列為第二適合免疫治療的抗原靶點[36]。通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，MUC1高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后較差，可能是胰腺癌CAR-T治療的理想靶點之一。

Posey等[37]設(shè)計了一種針對糖基化MUC1的CAR-T，并用人胰腺癌原位移植瘤測試其對胰腺癌的作用，發(fā)現(xiàn)5×105個CAR-T細(xì)胞處理可有效抑制小鼠胰腺癌生長，113 d后小鼠生存率仍為100%，而用未處理的T細(xì)胞和CD19 CAR-T細(xì)胞處理的小鼠生存率分別為40%和33%。另有研究發(fā)現(xiàn)，靶向MUC1的CAR-T細(xì)胞對Capan-1、Panc-1、Bxpc-3、Miapaca2、人胰腺腺泡上皮癌(human acinar epithelial carcinoma of the pancreas，HPAC)等多種胰腺癌細(xì)胞系均有較好的殺傷作用，并能明顯抑制腫瘤在體內(nèi)的生長[38]。上述兩項研究結(jié)果表明，靶向MUC1的CAR-T能有效殺死胰腺癌細(xì)胞并抑制其體內(nèi)生長，提示MUC1可作為胰腺癌治療的潛在靶標(biāo)。

2.2 MSLN MSLN是一種在正常組織中表達(dá)量很低，但在間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)的細(xì)胞表面抗原，是腫瘤治療的潛在靶點。目前已有多種針對MSLN的CAR-T被用于治療實體瘤[39-41]。MSLN在80%以上的胰腺癌中高表達(dá)，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，因此也是胰腺癌潛在的治療靶點之一。一項Ⅰ期臨床試驗對6例胰腺導(dǎo)管腺癌患者給予靶向MLSN的CAR-T治療，每周1次，持續(xù)3周，發(fā)現(xiàn)3例腫瘤活性保持穩(wěn)定，1例下降69.2%，2例無進(jìn)展生存期(PFS)分別延長了3.8個月和5.4個月[15]。有研究利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建靶向MSLN的CAR-T，其在體外可以快速殺死胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spc-1，并能明顯抑制用Aspc-1細(xì)胞構(gòu)建的裸鼠移植瘤的生長[42]。有研究發(fā)現(xiàn)，靶向MSLN和CEA的雙CAR-T具有更強(qiáng)的抗胰腺癌活性[43]。

2.3 CEA CEA是一種糖蛋白，在75%以上的胰腺癌中高表達(dá)[44]。通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，CEA高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更差。一項靶向CEA的臨床試驗中，53%接受治療的胰腺癌患者6周后病情保持穩(wěn)定，但由于4例出現(xiàn)肺毒性而被迫停止。有研究發(fā)現(xiàn)，靶向CEA的CAR-T可以消除67%小鼠的移植瘤[45]。

2.4 HER2 HER2在20%～60%的胰腺癌中高表達(dá)，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，基于曲妥單抗設(shè)計的二代HER2 CAR-T，可在1周內(nèi)有效減小胰腺癌移植瘤的體積；結(jié)合使用CD24 CAR-T，可使90%的小鼠14周后仍存活[46]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，接受HER2 CAR-T治療后，患者15 min內(nèi)出現(xiàn)呼吸窘迫等嚴(yán)重不良反應(yīng)[47]。因此，HER2 CAR-T的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

2.5 PSCA PSCA在60%～80%的胰腺癌中表達(dá)[48-49]，且嚴(yán)重影響患者的生存，但在正常組織中表達(dá)量很低，因此也是胰腺癌免疫治療的理想靶點之一。Abate-Daga等[50]和Katari等[51]的研究證實，靶向PSCA的CAR-T具有較好的抗胰腺癌活性，為PSCA作為胰腺癌的免疫治療靶點提供了有效證據(jù)。

2.6 CD133 研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因[52-54]，CD133是胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，盡管僅在極少數(shù)細(xì)胞中被檢測到，但這部分細(xì)胞的成瘤能力較普通腫瘤細(xì)胞強(qiáng)百倍[55-57]。因此，CD133可能是胰腺癌治療的潛在靶點。有研究發(fā)現(xiàn)，CD133 CAR-T可以有效清除胰腺癌患者腫瘤中的CD133+細(xì)胞，有效抑制腫瘤復(fù)發(fā)[58]。

3 胰腺癌CAR-T治療的臨床研究

2010年1月1日－2021年1月1日美國國立衛(wèi)生院(National Library of Medicine，NLM，www.clinicaltrials.gov)收錄的胰腺癌CAR-T治療的臨床研究如表1所示，這些臨床研究涉及多個抗原靶點，包括MSLN、CEA、MUC1、EpCAM、HER2、Claudin18.2、PSCA、CD133、CD70、受體酪氨酸激酶樣孤兒素受體2(ROR2)等。目前雖然有多項胰腺癌CAR-T臨床試驗還在進(jìn)行中，但均處于臨床早期，因此胰腺癌CAR-T臨床治療亟需深入研究。

表1 胰腺癌CAR-T治療臨床試驗Tab.1 Clinical trial of CAR-T therapy for pancreatic cancer

4 胰腺癌CAR-T治療的安全性評估

實體瘤CAR-T治療的主要障礙之一為其毒性，包括脫靶效應(yīng)、神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子風(fēng)暴及過敏反應(yīng)等[47,59-60]。一項靶向EGFR的胰腺癌CAR-T Ⅰ期臨床試驗(NCT01869166)，在接受治療的16例患者中，2例出現(xiàn)胸腔積液、肺間質(zhì)滲出毒性、細(xì)胞因子明顯升高等嚴(yán)重不良反應(yīng)，1例出現(xiàn)呼吸困難、血氧不足、胸腔積液及C反應(yīng)蛋白、IL-6等快速升高，8例出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，14例出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少，6例出現(xiàn)血小板減少癥狀[17]。一項靶向HER2的Ⅰ期臨床試驗(NCT01935843)中，81.8%的患者出現(xiàn)淋巴球減少，其中54.5%的患者癥狀達(dá)到3～4級；72.7%的患者出現(xiàn)惡心嘔吐；63.6%的患者出現(xiàn)疲勞；所有患者均出現(xiàn)急性發(fā)熱，其中1例癥狀達(dá)到3級；1例出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶異常升高[61]。一項靶向MLSN的臨床試驗(NCT01583686)中，1例患者死亡，40%的患者發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，20%的患者出現(xiàn)缺氧、呼吸窘迫，所有患者均出現(xiàn)粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板減少癥狀。一項靶向HER2的胰腺癌CAR-T治療結(jié)果顯示，接受治療后，患者15 min內(nèi)出現(xiàn)呼吸窘迫、急性肺浸潤，血清中IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)等細(xì)胞因子水平明顯升高，并在5 d后死亡[47]。上述研究結(jié)果表明，胰腺癌CAR-T治療的安全性仍是一個嚴(yán)峻的問題，在臨床治療前必須全面評估CAR-T治療的安全性。

有學(xué)者用非人靈長類獼猴建立了CAR-T安全性測試模型，用獼猴自體同源的CD20 CAR-T注射獼猴，發(fā)現(xiàn)獼猴血清中IL-6、IL-8、IL-1受體拮抗劑(interleukin1 receptor antagonist，IL1RA)、IFN-γ誘導(dǎo)的單核細(xì)胞(monokine induced by gamma interferon，MIG)和干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞α趨化劑(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant，I-TAC)水平明顯升高，腦脊液中IL-6、IL-2、GMCSF和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平升高，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞因子風(fēng)暴和神經(jīng)毒性[62]。由于非人靈長類獼猴與人的親緣關(guān)系較為接近，因此該研究為CAR-T安全性評估建立了一個可靠的模型。

5 總結(jié)與展望

CAR-T療法在血液系統(tǒng)腫瘤中取得的成功為胰腺癌的臨床治療帶來了新的希望，但卻面臨著諸多挑戰(zhàn)，如胰腺癌腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性、抗原缺乏或逃逸、T細(xì)胞難以進(jìn)入腫瘤內(nèi)部等。對于血液系統(tǒng)腫瘤，CAR-T細(xì)胞進(jìn)入血液后可直接接觸到腫瘤細(xì)胞，而胰腺癌的組織學(xué)特征阻止了CAR-T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，因此很難徹底清除腫瘤；此外，CD19抗原存在于所有B細(xì)胞表面，因此靶向CD19

的CAR-T可在血液腫瘤治療中取得成功，而異質(zhì)性是實體瘤的主要特征之一，導(dǎo)致不同個體、不同腫瘤細(xì)胞的表面抗原可能不同，因此CAR-T治療實體瘤的難度較大；胰腺癌微環(huán)境較復(fù)雜，腫瘤內(nèi)部大部分是由纖維基質(zhì)組成，而腫瘤細(xì)胞僅占10%左右，微環(huán)境一方面阻止T細(xì)胞浸潤，另一方面對T細(xì)胞具有抑制作用，使T細(xì)胞不能長時間存活。因此CAR-T在實體瘤中的應(yīng)用仍需要進(jìn)一步探索，可能需要更復(fù)雜的治療策略，如聯(lián)合使用抗體抑制免疫檢查點或者抑制CAR-T細(xì)胞內(nèi)部程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)等[63-64]。

CAR-T細(xì)胞療法在胰腺癌治療中面臨的另一項挑戰(zhàn)是其安全性，包括脫靶效應(yīng)、神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子風(fēng)暴及過敏反應(yīng)等[47,59-60]。針對脫靶問題，有學(xué)者提出使用腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的天然抗原受體構(gòu)建CAR-T細(xì)胞，可能有助于改善脫靶或抗原逃逸[65]；針對神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子風(fēng)暴等問題，有學(xué)者提出，在開展正式臨床試驗前，可以先用與人類親緣關(guān)系近的物種測試CAR-T細(xì)胞的安全性，如非人靈長類動物獼猴，后者被認(rèn)為是最接近人類的大型實驗動物[66]。將獼猴來源的CAR-T細(xì)胞注射到對應(yīng)的個體體內(nèi)，通過檢測獼猴的反應(yīng)，包括食欲、發(fā)熱、呼吸、腹瀉、過敏等，并用ELISA檢測血清中細(xì)胞因子及神經(jīng)毒性相關(guān)因子的釋放水平，進(jìn)而綜合評價CAR-T治療的安全性，可為其臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

通過改造CAR-T細(xì)胞本身的結(jié)構(gòu)來提高其有效性、特異性及存活時間等是胰腺癌CAR-T治療未來的發(fā)展方向，如構(gòu)建Dual-CAR、添加趨化因子受體、基于天然配體-受體構(gòu)建CAR-T等?？紤]到胰腺癌中豐富的纖維基質(zhì)，因此同時靶向腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的Dual-CAR可能具有更好的治療效果；趨化因子受體如CCR2b、CCR4、CXCR2等可使細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的遷移能力增強(qiáng)[67-68]，如在小鼠實驗中證實，CCR2b表達(dá)可使T細(xì)胞在腫瘤中的遷移能力提高12.5倍[69]；基于天然配體-受體構(gòu)建的CAR-T較常規(guī)基于抗體的CAR-T具有一定優(yōu)勢，如同一個受體可以靶向多個受體，避免抗原丟失造成的免疫逃逸，基于天然配體構(gòu)建的靶向NKG2D的CAR-T在膠質(zhì)瘤和肝癌中已顯示出較好的抑瘤作用[70-71]。上述類似的方法同樣適用于胰腺癌的免疫治療。

綜上，CAR-T療法在胰腺癌治療中應(yīng)用前景廣闊，但仍需解決多個問題：(1)探索表達(dá)穩(wěn)定、具有普遍性的抗原靶點；(2)改造CAR的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的活性、存活能力及侵襲能力等；(3)改善CAR-T的毒性；(4)探索靶向胰腺癌微環(huán)境的CAR-T；(5)探索聯(lián)合治療方法，如聯(lián)合免疫檢查點抑制劑、PD-1抑制劑或Dual-CAR-T等；(6)建立基于天然配體-受體的CAR-T。