蔣相康，楊婧媛，張茂

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科/浙江大學(xué)急救醫(yī)學(xué)研究所/浙江省嚴(yán)重創(chuàng)傷與燒傷診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310009

骨骼肌占人體體重的40%～45%，對(duì)機(jī)體活動(dòng)至關(guān)重要。機(jī)體通過(guò)協(xié)調(diào)骨骼肌的收縮與舒張控制運(yùn)動(dòng)，保護(hù)關(guān)節(jié)穩(wěn)定性、維持姿勢(shì)及保持身體平衡。此外，骨骼肌在呼吸運(yùn)動(dòng)、代謝調(diào)節(jié)、體溫調(diào)控和能量存儲(chǔ)中也起著重要作用[1]。在各種創(chuàng)傷事件中骨骼肌組織容易發(fā)生急性損傷，腫瘤、遺傳、代謝性疾病等原因造成的骨骼肌損傷也較常見(jiàn)。組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理和技術(shù)，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物正常及病理狀態(tài)下組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究與開(kāi)發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)的生物替代物的一門(mén)新興學(xué)科[2]。應(yīng)用組織工程學(xué)方法治療肌肉損傷具有較好的應(yīng)用前景，本文結(jié)合骨骼肌的正常生理結(jié)構(gòu)與再生基礎(chǔ)，綜述了當(dāng)前組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷的研究進(jìn)展。

1 骨骼肌的結(jié)構(gòu)與再生

人體的骨骼肌組織由多核肌纖維、細(xì)胞外基質(zhì)、血管和神經(jīng)組成(圖1)[3]。肌纖維是骨骼肌的基本結(jié)構(gòu)單位，在胚胎發(fā)育階段由中胚層的肌肉祖細(xì)胞融合形成。雖然肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，但骨骼肌卻擁有良好的再生能力[4]。在應(yīng)對(duì)輕微損傷如挫傷、勞損、部分撕裂導(dǎo)致的肌纖維受損時(shí)，骨骼肌能夠修復(fù)損傷并維持正常功能[5]。骨骼肌自我修復(fù)的基礎(chǔ)在于肌膜與基底膜之間存在未分化的前體細(xì)胞，稱(chēng)為衛(wèi)星細(xì)胞(satellite cells，SCs)。肌纖維發(fā)生損傷后，SCs受刺激激活并通過(guò)對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的方式產(chǎn)生子代細(xì)胞，在進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)分化為成肌細(xì)胞，從而修復(fù)受損的肌纖維[6]。SCs以自我更新及向成肌細(xì)胞分化的方式參與肌纖維的適應(yīng)性改變，其良好的增殖與分化能力在骨骼肌損傷后的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖1 骨骼肌組織結(jié)構(gòu)(根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]修改)Fig.1 Structure of skeletal muscle tissue (modified from reference [3])

雖然骨骼肌的自我修復(fù)能力能夠應(yīng)對(duì)一定的損傷，但在嚴(yán)重受損后骨骼肌的再生能力仍會(huì)相對(duì)不足，且損傷后伴隨的纖維化反應(yīng)也會(huì)抑制新生肌肉的形成。例如，在體積性肌肉缺失(volumetric muscle loss，VML)中，SCs的修復(fù)能力有限，不能完全再生缺失的肌肉組織，而是由成纖維細(xì)胞對(duì)缺損部位進(jìn)行修復(fù)形成瘢痕組織，產(chǎn)生亞神經(jīng)支配、功能障礙的肌肉，最終造成肌肉功能受損甚至永久殘疾[7]。目前臨床上對(duì)于VML的處理往往限于清創(chuàng)縫合、肌肉皮瓣移植，均不能誘導(dǎo)足夠的骨骼肌組織再生，且存在移植物來(lái)源困難的問(wèn)題，導(dǎo)致肌肉功能不能完全恢復(fù)。在此背景下，組織工程技術(shù)逐漸受到關(guān)注，有望成為治療骨骼肌疾病、促進(jìn)骨骼肌再生的新工具[8-9]。

2 組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷概述

組織工程技術(shù)是一門(mén)單獨(dú)或組合運(yùn)用種子細(xì)胞、支架材料以及生物活性分子修復(fù)或替換受損組織的交叉技術(shù)，能夠在體內(nèi)外構(gòu)建具有生命力的活體組織，進(jìn)而對(duì)損傷部位進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的重建。在骨骼肌損傷的治療中，組織工程技術(shù)能有效克服目前手術(shù)治療的缺陷，通過(guò)構(gòu)建功能性的骨骼肌組織來(lái)恢復(fù)受損肌肉的功能，在嚴(yán)重肌肉損傷的治療中具有較大潛力。種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子是組織工程的三大基本要素[10]。

2.1 種子細(xì)胞 種子細(xì)胞的構(gòu)建是組織工程研究中最基本的環(huán)節(jié)。理想的種子細(xì)胞應(yīng)符合以下要求：(1)適合臨床應(yīng)用需求，即來(lái)源廣泛、易于分離純化；(2)具有明確形成骨骼肌組織的能力；(3)易于擴(kuò)增且保持肌源性分化能力；(4)能與體內(nèi)骨骼肌組織適當(dāng)融合[11]。

作為骨骼肌組織的未分化前體干細(xì)胞，SCs在組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷的研究中較常用，是目前最有希望在臨床上廣泛使用的種子細(xì)胞。體內(nèi)骨骼肌組織的再生依賴于SCs的自我更新與肌源性分化，了解調(diào)控該過(guò)程的信號(hào)通路和分子機(jī)制可促進(jìn)SCs在組織工程中的應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄因子Pax7是SCs的特異性表達(dá)基因，在SCs的增殖和分化調(diào)控中起著重要作用[12]。同時(shí)，Pax7也是急性骨骼肌損傷后啟動(dòng)再生修復(fù)過(guò)程所必需的轉(zhuǎn)錄因子[13]。Pax7的功能受H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1的調(diào)控，MLL1表達(dá)降低會(huì)抑制SCs的增殖和自我更新，并顯著損害骨骼肌的再生能力[14]。在轉(zhuǎn)錄因子激活后，成肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)調(diào)控后續(xù)SCs的活化進(jìn)程。MRFs是肌肉特異性的堿性轉(zhuǎn)錄因子，包括MyoD、Myf5、Myogenin和MRF4等4種蛋白，其中MyoD和Myf5是基本調(diào)節(jié)因子，在SCs中特異性表達(dá)。SCs激活后Myf5的表達(dá)可促進(jìn)SCs增殖，MyoD的表達(dá)則促進(jìn)SCs向肌源性分化[15]。SCs作為骨骼肌的成體干細(xì)胞，影響其再生過(guò)程的作用機(jī)制得到了廣泛研究。例如，前列腺素E2(PGE2)可通過(guò)EP4受體靶向激活SCs并促進(jìn)其增殖，肌內(nèi)注射PGE2可顯著促進(jìn)骨骼肌損傷后的修復(fù)[16]；Notch靶基因Hesr1和Hesr3可維持體內(nèi)SCs的穩(wěn)態(tài)[17]；賴氨酸特異性去甲基化酶1可調(diào)控成肌轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)并促進(jìn)SCs向肌源性分化，抑制SCs向棕色脂肪細(xì)胞分化[18]等。目前研究雖然發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控SCs活化的因素，但體外培養(yǎng)的SCs仍會(huì)逐漸失去自我更新的能力；SCs的主要來(lái)源為肌肉活檢，這種方法會(huì)給患者帶來(lái)一定損傷，且無(wú)法獲得足夠數(shù)量的SCs用于骨骼肌組織的修復(fù)。傳統(tǒng)的酶解法獲得的SCs數(shù)量少，純度低[11]。為解決上述問(wèn)題，Garcia等[19]發(fā)展了一系列高效純化、保存和連續(xù)移植人體SCs的方法，為相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究提供了較好的解決方案。

除SCs外，具有種子細(xì)胞潛能的還有間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。在MSCs群體中，研究較多的是脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)和骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived stem cells，BMSCs)。BMSCs主要從患者股骨和脛骨的骨髓中獲取，數(shù)量較少，對(duì)患者危害較大。相反，ADSCs易獲得、生長(zhǎng)較快，且可表達(dá)更高水平的干細(xì)胞標(biāo)志物[20]。因此，ADSCs在MSCs中作為種子細(xì)胞的應(yīng)用前景更好。雖然多項(xiàng)研究表明MSCs具有促進(jìn)骨骼肌再生的作用，但其作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。MSCs是一種多能干細(xì)胞，可分泌生物活性因子，具有免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)血管生成的能力[21]。同時(shí)，MSCs可向骨骼肌細(xì)胞分化[22]。已經(jīng)證實(shí)MSCs產(chǎn)生的旁分泌因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulinlike growth factors-1，IGF-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，在血管生成和肌源性干細(xì)胞的活化中起著重要作用[23]。最近研究發(fā)現(xiàn)，MSCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-6可通過(guò)激活STAT通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而促進(jìn)損傷后肌肉組織的再生[24]。Mitchell等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs分泌的細(xì)胞外囊泡在肌肉再生過(guò)程中起著有益的作用。但MSCs直接分化為骨骼肌細(xì)胞的效率較低。在分化培養(yǎng)基中，僅15%的MSCs能分化為骨骼肌細(xì)胞[26]。雖然許多研究致力于提高M(jìn)SCs的分化效率，例如在支架材料上培養(yǎng)細(xì)胞[27]、施加物理或化學(xué)刺激[28-29]等，但效果有限，尚不足以應(yīng)用于臨床。因此，今后應(yīng)進(jìn)一步探討提升MSCs分化效率的方法，以促進(jìn)MSCs作為種子細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用。

ESCs和iPSCs都擁有向所有胚層細(xì)胞分化的潛能，但倫理問(wèn)題限制了ESCs的應(yīng)用，iPSCs可以用人體多數(shù)體細(xì)胞制備，具有更廣闊的應(yīng)用前景[30]。目前的研究主要通過(guò)轉(zhuǎn)基因或化學(xué)誘導(dǎo)的方法將iPSCs轉(zhuǎn)化為骨骼肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因技術(shù)較化學(xué)誘導(dǎo)穩(wěn)定，可直接獲得誘導(dǎo)成肌祖細(xì)胞(induced myogenic progenitors，iMPCs)。Rao等[31]成功利用iMPCs構(gòu)建了具備3D結(jié)構(gòu)的骨骼肌束，奠定了iMPCs的應(yīng)用基礎(chǔ)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)主要通過(guò)在培養(yǎng)基中加入特定物質(zhì)誘導(dǎo)iPSCs向肌細(xì)胞譜系分化，如Shelton等[32]證實(shí)了在培養(yǎng)液中添加膠原酶Ⅳ和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2可誘導(dǎo)iPSCs向肌源性分化。雖然iPSCs可分化為骨骼肌細(xì)胞，但由于當(dāng)前無(wú)法精準(zhǔn)控制iPSCs的分化方向，植入體內(nèi)后有產(chǎn)生腫瘤組織的可能，臨床應(yīng)用iPSCs的安全性尚須充分認(rèn)證，以確保其在體內(nèi)不會(huì)向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變[33]。

2.2 支架材料 支架材料是具有3D結(jié)構(gòu)的生物材料，在組織工程中起著不可或缺的作用。仿生支架能為種子細(xì)胞提供暫時(shí)的機(jī)械支撐，并對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖與分化進(jìn)行調(diào)節(jié)[34]。理想的支架材料應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)毒且具有良好的組織相容性，不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)；(2)具有3D空間結(jié)構(gòu)和組織孔隙，以便再生組織能夠與宿主組織整合；(3)具有生物可降解性、降解可調(diào)控性、可塑性；(4)具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能抵抗一定的張力；(5)可促進(jìn)細(xì)胞黏附與增殖，誘導(dǎo)組織再生；(6)可促進(jìn)骨骼肌再生，以及血管和神經(jīng)肌肉接頭的形成[35]。

目前常用的支架材料主要有生物材料支架(如膠原蛋白支架、脫細(xì)胞基質(zhì)支架、纖維蛋白支架、殼聚糖及其衍生物支架、透明質(zhì)酸支架、角蛋白支架等)、高分子材料支架(如聚羥基乙酸支架、聚己交酯支架、聚乳酸支架、聚乳酸-乙醇酸支架等)以及各種材料制作的復(fù)合支架[35]。單一材料構(gòu)成的支架往往存在很多缺陷，通過(guò)整合各種材料的優(yōu)點(diǎn)制作復(fù)合支架可為種子細(xì)胞提供更好的環(huán)境。骨骼肌組織能夠通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)電刺激，且電刺激在肌肉生長(zhǎng)過(guò)程中也起著一定作用，這使得導(dǎo)電能力對(duì)支架十分重要，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)研究證實(shí)，導(dǎo)電生物材料支架能通過(guò)電刺激有效促進(jìn)肌源性干細(xì)胞的黏附、增殖與分化，并提高仿生肌肉的成熟度[36-37]。目前研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種類(lèi)型的導(dǎo)電生物材料用于支架制作，如導(dǎo)電聚合物[38]、碳納米材料及金屬納米材料[39-40]等，未來(lái)進(jìn)一步的研究可促進(jìn)導(dǎo)電生物材料在組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷中的應(yīng)用。

支架材料在組織工程中的主要作用是模仿細(xì)胞外基質(zhì)，材料的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)影響著種子細(xì)胞的命運(yùn)。其中較為重要的特性包括支架對(duì)細(xì)胞的黏附作用、支架的3D空間結(jié)構(gòu)及彈性。早期研究發(fā)現(xiàn)，移植的SCs未與細(xì)胞外基質(zhì)整合可誘發(fā)凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞移植的成活率較低[41]。用細(xì)胞黏附配體對(duì)天然或合成聚合物進(jìn)行修飾，增強(qiáng)SCs與植入支架的黏附作用，可有效提高細(xì)胞成活率[42]。骨骼肌組織主要由平行排列的肌纖維束組成，其毛細(xì)血管豐富，血流量大，代謝率較高，對(duì)氧的需求量也較大。因此，支架材料應(yīng)包含大小與數(shù)量一定的相互連通的孔隙，以允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效傳遞和代謝廢物的清除。一般情況下，支架的孔徑尺寸在100～500 μm是細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳條件[43]。另外，支架材料的彈性對(duì)骨骼肌的再生也有一定影響。正常肌肉的彈性值為12 kPa，衰老、損傷和疾病可導(dǎo)致組織僵硬度增加[44]。體內(nèi)外研究表明，不同彈性值的材料會(huì)對(duì)SCs的增殖及分化產(chǎn)生不同的影響[45-46]，在模擬生理彈性值的支架材料上SCs的自我更新能力最強(qiáng)[47]，可能更適合應(yīng)用于骨骼肌組織工程。

2.3 生長(zhǎng)因子 生長(zhǎng)因子是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和分化的可溶性信號(hào)肽，可通過(guò)連接或嵌入的方式與支架材料結(jié)合輸送至肌肉組織。直接肌內(nèi)注射生長(zhǎng)因子對(duì)組織再生的促進(jìn)作用很小[48]，可能與局部注射后迅速耗盡導(dǎo)致濃度下降或生物活性喪失有關(guān)。因此，可通過(guò)共價(jià)鍵、物理包埋或表面吸附的方式將生長(zhǎng)因子與支架結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)在局部組織中的持續(xù)性釋放。目前在骨骼肌組織工程中常用的生長(zhǎng)因子主要有VEGF、HGF、IGF-1以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)[49]。VEGF可誘導(dǎo)新生血管形成，增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供應(yīng)，從而促進(jìn)肌肉組織生長(zhǎng)[50]。HGF可能通過(guò)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體c-MET促進(jìn)SCs的活化[51]。IGF-1被認(rèn)為是調(diào)節(jié)肌肉修復(fù)的關(guān)鍵因子，體外實(shí)驗(yàn)表明其具有刺激成肌細(xì)胞增殖和肌纖維肥大的作用[52]，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明其可增強(qiáng)肌組織的再生[53]。FGF與受體結(jié)合后能誘導(dǎo)SCs的活化與增殖[54]。值得注意的是，細(xì)胞因子刺激肌肉再生的作用是相互協(xié)同的，如聯(lián)合應(yīng)用VEGF和IGF-1較單獨(dú)使用可明顯增強(qiáng)肌肉組織的再生能力，表明二者在促進(jìn)血管生成、神經(jīng)再支配和肌肉生成方面具有協(xié)同作用[55]。

3 組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷的策略

組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷分為原位組織工程和體外組織工程兩種策略[56](圖2)。原位組織工程技術(shù)是在植入體內(nèi)的支架材料上結(jié)合細(xì)胞因子或旁分泌信號(hào)細(xì)胞，通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)肌肉再生過(guò)程促進(jìn)受損骨骼肌組織的修復(fù)(圖2A)。體外組織工程技術(shù)是將種子細(xì)胞及其他細(xì)胞與支架材料相結(jié)合，直接植入肌肉損傷部位或在體外構(gòu)建具有一定功能的骨骼肌組織后再進(jìn)行植入(圖2B)。與原位組織工程相比，體外組織工程的優(yōu)勢(shì)包括：(1)能設(shè)計(jì)特定結(jié)構(gòu)的肌肉組織對(duì)受損部位進(jìn)行精確修復(fù)；(2)可對(duì)植入物進(jìn)行預(yù)處理，使其獲得正常肌肉組織的部分功能；(3)能提供有益于SCs存活的環(huán)境，有利于植入后再生過(guò)程的繼續(xù)進(jìn)行[8,57]。

圖2 組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷的策略(根據(jù)參考文獻(xiàn)[56]修改)Fig.2 Strategies for repairing skeletal muscle injury by tissue engineering techniques (modified from reference [56])

體外組織工程技術(shù)經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，目前已能構(gòu)建具備部分正常功能的仿生肌肉組織[58]。1990年Strohman等[59]首先在體外培育出了公認(rèn)的骨骼肌組織，其由單層骨骼肌細(xì)胞排列，并能產(chǎn)生收縮活動(dòng)。隨后的研究在此基礎(chǔ)上不斷發(fā)展完善，如對(duì)培養(yǎng)的組織施加電和機(jī)械刺激、加強(qiáng)血流灌注以及促進(jìn)神經(jīng)-肌肉突觸的形成等。適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激可通過(guò)成肌細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白傳遞至細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)肌細(xì)胞的成熟[60]。電刺激可增加細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原沉積，促進(jìn)SCs的肌源性分化[61]。另外，充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換對(duì)培養(yǎng)的組織十分重要。Levenberg等[62]在高度多孔、可生物降解的聚合物支架上移植成肌細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)形成了類(lèi)似于正常肌肉組織的血管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，為構(gòu)建3D化的骨骼肌組織奠定了基礎(chǔ)。許多研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)體外培養(yǎng)的組織進(jìn)行預(yù)血管化處理能夠促進(jìn)移植物與移植部位的整合，改善受損肌肉的功能[63-65]。此外，肌肉的神經(jīng)支配在肌細(xì)胞的發(fā)育以及肌肉功能的發(fā)揮中起著重要作用，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨骼肌組織形成；含有成熟乙酰膽堿受體的神經(jīng)肌肉接頭能夠確保足夠肌纖維的生成和電刺激傳輸，從而產(chǎn)生適當(dāng)?shù)牧α渴湛s。目前解決的方法主要包括與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)神經(jīng)-肌肉接頭的形成[66]，或在損傷的神經(jīng)周?chē)浦布〗M織[67]。

4 基因技術(shù)在組織工程修復(fù)骨骼肌損傷中的應(yīng)用

基因技術(shù)與組織工程技術(shù)聯(lián)同研發(fā)是骨骼肌疾病生物物理學(xué)領(lǐng)域的革命?；蚓庉嫾夹g(shù)除可為組織工程構(gòu)建合適的種子細(xì)胞來(lái)源外，還能通過(guò)構(gòu)建具有分泌功能的靶細(xì)胞促進(jìn)新生骨骼肌的形成以及組織工程骨骼肌的血管化。重組蛋白成本昂貴，在體內(nèi)半衰期較短，作為生長(zhǎng)因子遞送的替代方法，目的基因可以通過(guò)病毒或非病毒載體(如質(zhì)粒、脂質(zhì)體等)遞送的方式誘導(dǎo)相應(yīng)生長(zhǎng)因子的合成，且與外源性重組生長(zhǎng)因子相比，局部合成生長(zhǎng)因子經(jīng)過(guò)翻譯后修飾具有更高的生物活性[68]。

目的基因遞送分為體內(nèi)和體外兩種方式。體內(nèi)法通過(guò)使用支架材料負(fù)載編碼目的基因的病毒或非病毒載體至骨骼肌缺損處[69]，步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，但對(duì)特定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低，且容易造成靶蛋白的異位表達(dá)。體外法從患者機(jī)體獲取受體細(xì)胞后體外構(gòu)建表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞并進(jìn)行體外擴(kuò)增，再單獨(dú)或結(jié)合支架材料植入骨骼肌缺損處[70]，可有效提高對(duì)特定細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，可控性強(qiáng)，但操作相對(duì)復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，成本也相對(duì)更高。相比體外法的成本與耗時(shí)，體內(nèi)法由于具有簡(jiǎn)單和低成本的優(yōu)點(diǎn)，具有更好的發(fā)展前景，但目前需提高轉(zhuǎn)染的效率和靶向性，以為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

5 3D生物打印技術(shù)在組織工程修復(fù)骨骼肌損傷中的應(yīng)用

在過(guò)去的10年中，3D生物打印技術(shù)在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用得到了快速發(fā)展，為組織工程三大基本要素在時(shí)間和空間上的精準(zhǔn)組合提供了有力工具。3D生物打印技術(shù)源于3D打印技術(shù)，可通過(guò)逐層打印由生物材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子組成的生物墨水構(gòu)建具有復(fù)雜生理結(jié)構(gòu)的仿生組織，常用的打印方法包括噴墨式3D生物打印、微擠壓式3D生物打印和激光輔助式3D生物打印等[71]。在骨骼肌組織的構(gòu)建中，3D生物打印技術(shù)可將水凝膠、脫細(xì)胞基質(zhì)等生物材料配合種子細(xì)胞進(jìn)行打印，精準(zhǔn)還原骨骼肌組織的生理結(jié)構(gòu)。如Choi等[72]以3D生物打印的方式將C2C12成肌細(xì)胞整齊搭載于豬骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)中進(jìn)行體外仿生骨骼肌組織的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)所獲骨骼肌組織的肌管成熟度較高。隨后的研究也表明，與傳統(tǒng)的體外組織工程技術(shù)相比，3D生物打印技術(shù)為種子細(xì)胞提供了一種更符合生理狀態(tài)的微環(huán)境，促進(jìn)了種子細(xì)胞的增殖與肌源性分化[73]，移植后的仿生骨骼肌組織與缺損部位的整合度也更高[74]。目前研究致力于開(kāi)發(fā)具有更高生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度的生物墨水，以提高仿生骨骼肌組織的生物學(xué)性能。

6 外泌體在組織工程修復(fù)骨骼肌損傷中的應(yīng)用

近年越來(lái)越多的研究表明，干細(xì)胞分泌的外泌體可發(fā)揮類(lèi)似于干細(xì)胞的作用。外泌體是一類(lèi)具有脂質(zhì)雙分子層的球狀細(xì)胞外囊泡，直徑為40～160 nm。在生理?xiàng)l件下，外泌體能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、miRNA等多種分子從親代細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到其他細(xì)胞，是細(xì)胞間重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)[75]。作為一種生物活性分子，干細(xì)胞分泌的外泌體主要通過(guò)以下3種機(jī)制發(fā)揮作用：(1)調(diào)節(jié)病灶部位的炎癥反應(yīng)，減少骨骼肌細(xì)胞凋亡；(2)促進(jìn)血管形成；(3)促進(jìn)肌源性干細(xì)胞增殖分化，修復(fù)受損肌纖維[76]。外泌體的應(yīng)用可在一定程度上解決當(dāng)前組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷時(shí)存在的一些問(wèn)題，如種子細(xì)胞來(lái)源、數(shù)量及免疫排斥反應(yīng)等。目前，采用外泌體的治療方法主要有兩種：一種是將外泌體定期注射于缺損部位[77]，但操作較繁瑣，宿主痛苦較大，且外泌體易流失；另一種是將外泌體與組織工程支架結(jié)合后植入，如Shi等[78]采用水凝膠支架負(fù)載MSCs分泌的外泌體，有效促進(jìn)了骨骼肌肌腱損傷后的愈合。研究表明，水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能有效包封外泌體并持續(xù)性釋放，可對(duì)周?chē)?xì)胞施加正向調(diào)節(jié)作用[79]。但單純的水凝膠材料難以與損傷部位高度黏附與整合，強(qiáng)度也難達(dá)到應(yīng)用需求。因此，應(yīng)進(jìn)一步研發(fā)更多能有效負(fù)載外泌體的支架材料，以促進(jìn)其在組織工程中的應(yīng)用。

7 總結(jié)與展望

組織工程技術(shù)應(yīng)用不同的細(xì)胞、生物材料以及活性分子作為原材料，整合多種技術(shù)對(duì)損傷的骨骼肌進(jìn)行修復(fù)，在嚴(yán)重肌肉損傷的治療中前景較好，臨床上的初步探索也獲得了較好成果[80]，但真正大范圍用于臨床前仍需解決許多問(wèn)題：首先，目前尚缺乏大量穩(wěn)定來(lái)源的種子細(xì)胞用于組織工程的修復(fù)，自體SCs的分離費(fèi)時(shí)費(fèi)力，技術(shù)尚不完善，獲得的數(shù)量無(wú)法滿足應(yīng)用需求，同時(shí)免疫排斥反應(yīng)的存在限制了異體干細(xì)胞的應(yīng)用。除了可分離干細(xì)胞分泌的外泌體替代部分干細(xì)胞的功能，未來(lái)對(duì)于SCs分離技術(shù)的改進(jìn)以及對(duì)細(xì)胞活動(dòng)調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)也能促進(jìn)自體SCs的應(yīng)用。其次，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，自體SCs自我更新能力的限制會(huì)逐漸被打破，同種異體來(lái)源細(xì)胞的免疫原性也可能會(huì)被消除，但其安全性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。第三，現(xiàn)階段尚不能構(gòu)建具有全功能的骨骼肌組織，工程化的骨骼肌組織在三維空間結(jié)構(gòu)上通常存在缺陷，與人體正常的骨骼肌在肌纖維排列、血管以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上存在一定差距。3D生物打印技術(shù)可以利用生物墨水制作復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，并將細(xì)胞更精確地定位排列于基質(zhì)中[71]，可能是解決這一問(wèn)題的重要途徑。隨著對(duì)SCs群體及神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)認(rèn)識(shí)的加深，新材料和新技術(shù)的研發(fā)，以及基因工程、3D生物打印技術(shù)與組織工程技術(shù)的不斷融合發(fā)展，組織工程技術(shù)修復(fù)骨骼肌損傷必能在臨床上取得更大的成就。