吳振波，邵淑蓉，陳虹宇

1麗水市中心醫(yī)院藥學(xué)部，浙江麗水 323000；2寧波市婦女兒童醫(yī)院藥劑科，浙江寧波 315012

人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是導(dǎo)致嬰幼兒急性和嚴(yán)重下呼吸道疾病的最常見(jiàn)病毒之一[1]，在發(fā)展中國(guó)家的死亡率較高[2-3]，且目前的治療方案仍局限于支持治療[4]。利巴韋林是唯一被批準(zhǔn)用于治療RSV感染所致呼吸道疾病的抗病毒藥物，然而其療效和不良反應(yīng)限制了其在免疫功能低下患兒中的應(yīng)用[5]。因此，臨床迫切需要能有效治療RSV的藥物。既往研究證實(shí)植物提取物和草藥化合物具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用[6-7]。黃芪長(zhǎng)期被作為許多中藥方劑的重要組成部分[8-9]，具有止汗、降壓、利尿和增補(bǔ)等作用[10]。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是從黃芪中提取的一種有效成分，研究證實(shí)其可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和細(xì)胞因子的表達(dá)[11]，增強(qiáng)抗炎活性[12-13]及減少氣道重塑[14-15]，從而在哮喘治療中發(fā)揮重要作用。在抗病毒方面，有研究發(fā)現(xiàn)APS能夠減輕由單純皰疹病毒引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷[16]。然而，目前尚無(wú)APS治療RSV肺部感染的相關(guān)研究。本研究探討了APS對(duì)RSV所致小鼠感染性肺炎的治療作用及其可能機(jī)制，旨在為尋找治療RSV所致呼吸道疾病的有效藥物提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 APS和利巴韋林購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，人喉癌上皮細(xì)胞(HEp-2，ATCCCCL-23)和RSV Long株(ATCC-VR-26)購(gòu)自美國(guó)ATCC，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-18及IL-33酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均購(gòu)自中國(guó)Elabscience公司，10%多聚甲醛、1%結(jié)晶紫水溶液、RIPA強(qiáng)裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、封閉液、一抗及二抗稀釋液、ECL發(fā)光液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Merck-Millipore公司，抗小鼠CD3單克隆抗體(APC標(biāo)記)、抗小鼠CD4單克隆抗體(FITC標(biāo)記)、抗小鼠CD8單克隆抗體(PE標(biāo)記)、小鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、磷酸化的分裂素原活化蛋白激酶(phosphorylated mitogenactivated protein kinases，p-MAPK)、MAPK、磷酸化的核轉(zhuǎn)錄因子κB(phosphorylated nuclear factor κB，p-NF-κB)、NF-κB及β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 RSV感染模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 60只雄性3周齡BALB/c小鼠(SPF級(jí)，12～14 g)購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將小鼠置于濕度為55%、溫度為20～25 ℃、12 h光/暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組(n=10)：對(duì)照組、RSV組、利巴韋林組、APS低劑量組、APS中劑量組及APS高劑量組。具體操作步驟為：將小鼠用乙醚輕度麻醉后，對(duì)照組滴鼻50 μl生理鹽水，其余各組小鼠均通過(guò)鼻腔滴注50 μl RSV-long株病毒溶液[含6.8×106個(gè)斑塊形成單位(pfu)]制備模型。滴鼻2 h后開(kāi)始灌胃，APS低、中、高劑量組分別給予100、200、300 mg/(kg.d)APS灌胃[17]，利巴韋林組給予46 mg/(kg.d)利巴韋林灌胃，對(duì)照組及RSV模型組給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)5 d。待氣道高反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，留取肺組織，摘眼球取血，肝素管抗凝，4 ℃、5000×g離心20 min獲得血清，儲(chǔ)存于–80 ℃冰箱中待用。

1.3 測(cè)量小鼠體重及計(jì)算肺指數(shù) 各組小鼠于RSV感染前3 d及感染后5 d連續(xù)稱(chēng)重，然后取小鼠肺組織并稱(chēng)重。肺指數(shù)計(jì)算公式為：肺指數(shù)=肺重量/體重。

1.4 空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度 制備肺組織勻漿，600×g離心5 min，取上清液加至培養(yǎng)有HEp-2細(xì)胞的24孔板中。培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入瓊脂糖覆蓋培養(yǎng)基。待瓊脂糖凝固后，將維持培養(yǎng)基添加至孔中，進(jìn)一步培養(yǎng)5 d以形成菌斑。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定染色，計(jì)數(shù)斑塊數(shù)。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清中炎性因子表達(dá)水平 使用ELISA試劑盒檢測(cè)RSV感染小鼠血清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的水平。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子水平。

1.6 肺組織抗氧化及氧化產(chǎn)物含量檢測(cè) 制備肺組織勻漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)采用比色法分別測(cè)定抗氧化產(chǎn)物GSH、SOD及氧化指標(biāo)MDA的水平。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群水平 取100 μl外周血加入相應(yīng)CD3、CD4和CD8抗體各5 μl，渦旋混勻后室溫、避光孵育30 min，然后加入1 ml稀釋溶血素，渦旋混勻樣品，室溫靜置15 min，400×g離心5 min后棄上清，加入2 ml PBS混勻，400×g離心5 min后棄上清，最后加入450 μl PBS重懸樣品，并采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 Western blotting檢測(cè)肺組織蛋白表達(dá)水平 使用含蛋白酶抑制劑的RIPA強(qiáng)裂解液處理肺組織，將溶解后的樣品在13 000×g、4 ℃條件下離心30 min留取上清液，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液室溫封閉2 h，然后與一抗TLR4、p-MAPK、MAPK、p-NF-κB、NF-κB及β-actin抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。次日回收一抗，洗膜后以相應(yīng)二抗室溫孵育PVDF膜1 h，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行目標(biāo)蛋白可視化顯影，并采用Photoshop進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步比較采用Dunnett'st檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 APS對(duì)RSV感染小鼠肺組織病毒載量的影響與對(duì)照組(0)比較，RSV組[(98.3±4.5)個(gè)]、APS低劑量組[(77.0±3.6)個(gè)]、APS中劑量組[(61.7±2.5)個(gè)]、APS高劑量組[(33.0±2.0)個(gè)]及利巴韋林組[(33.7±3.5)個(gè)]的空斑數(shù)量均明顯增加(P<0.05)；與RSV組比較，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組的空斑數(shù)量明顯減少(P<0.05)，且APS低、中、高劑量組的病毒載量呈劑量依賴(lài)性降低(P=0.0032)；利巴韋林組的空斑數(shù)量與APS高劑量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 APS對(duì)RSV感染小鼠肺組織病毒載量的影響(n=10)Fig.1 Effect of APS on the viral load in lung tissue of RSV infected mice (n=10)

2.2 APS對(duì)RSV感染小鼠體重及肺指數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，RSV組小鼠體重明顯降低(P<0.05)，而給予低、中、高劑量APS及利巴韋林治療后，小鼠體重明顯增加(P<0.05)，其中APS低、中、高劑量組小鼠體重呈劑量依賴(lài)性地增加(P<0.05)；此外，APS高劑量組小鼠較利巴韋林組體重增加更明顯(P<0.05)(圖2A)。與對(duì)照組(0.83%±0.09%)比較，RSV組感染小鼠的肺指數(shù)(1.63%±0.09%)明顯升高(P=0.0004)；而APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠肺指數(shù)(分別為1.44%±0.06%、1.34%±0.04%、1.16%±0.08%、1.24%±0.11%)均明顯低于RSV組(P=0.0424、0.0071、0.0027、0.0090)，其中，APS低、中、高劑量組的肺指數(shù)呈劑量依賴(lài)性地降低(P=0.0038)；此外，利巴韋林組的肺指數(shù)與APS高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.3799)(圖2B)。

圖2 APS對(duì)RSV感染小鼠體重及肺指數(shù)的影響(n=10)Fig.2 Effects of APS on body weight and lung index of RSV infected mice (n=10)

2.3 APS對(duì)RSV感染小鼠血清中IL-1β、IL-18和IL-33水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠血清中IL-1β、IL-18和IL-33水平均明顯升高(P<0.05)；與RSV組比較，APS低、中、高劑量組的IL-1β、IL-18和IL-33水平呈劑量依賴(lài)方式明顯降低(P<0.05)，利巴韋林組的IL-1β、IL-18和IL-33水平也明顯降低(P<0.05)；與APS高劑量組比較，利巴韋林組的IL-1β水平升高(P<0.05)，而IL-18和IL-33水平無(wú)明顯變化(P>0.05，圖3)。

圖3 APS對(duì)RSV感染小鼠血清IL-1β、IL-18和IL-33水平的影響(n=10)Fig.3 Effects of APS on the levels of IL-1β, IL-18 and IL-33 in serum of RSV infected mice (n=10)

2.4 APS對(duì)外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠外周血中的CD4+T細(xì)胞百分比增高(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞百分比降低(P<0.05)，CD4+/CD8+比值明顯增高(P<0.05)；與RSV組比較，低、中、高劑量APS及利巴韋林可明顯逆轉(zhuǎn)上述變化(P<0.05)，其中，低、中、高劑量APS呈劑量依賴(lài)方式發(fā)揮作用(P<0.05)。此外，利巴韋林組的CD4+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯高于APS高劑量組，而CD8+T細(xì)胞百分比明顯低于APS高劑量組(P<0.05)(圖4、表1)。

表1 各組小鼠外周血T細(xì)胞亞群水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of T cell subset levels among each group of mice (±s, n=10)

表1 各組小鼠外周血T細(xì)胞亞群水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of T cell subset levels among each group of mice (±s, n=10)

與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與RSV組比較，(2)P<0.05；與APS低劑量組比較，(3)P<0.05；與APS中劑量組比較，(4)P<0.05；與APS高劑量組比較，(5)P<0.05

組別 CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+對(duì)照組 23.55±1.07 8.70±0.66 2.72±0.26 RSV組 31.82±1.21(1) 6.20±0.70(1) 5.18±0.62(1)APS低劑量組 30.48±1.59(1)(2) 7.03±0.40(1)(2) 4.35±0.46(1)(2)APS中劑量組 26.20±2.72(1)(2)(3) 7.77±1.03(1)(2)(3) 3.44±0.74(1)(2)(3)APS高劑量組 24.53±1.70(1)(2)(3)(4) 8.10±0.40(1)(2)(3)(4) 3.04±0.30(1)(2)(3)(4)利巴韋林組 26.55±1.09(1)(2)(3)(5) 7.20±0.46(1)(2)(3)(4)(5) 3.70±0.27(1)(2)(3)(4)(5)F 9.979 4.578 8.981 P 0.0044 0.0379 0.0061

圖4 APS對(duì)外周血CD4+、CD8+ T細(xì)胞亞群的影響(n=10)Fig.4 Effects of APS on CD4+ and CD8+ T cell subsets in peripheral blood of RSV infected mice (n=10)

2.5 APS對(duì)肺組織MDA、SOD、GSH含量的影響與對(duì)照組比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組小鼠肺組織中抗氧化產(chǎn)物SOD、GSH水平明顯降低(P<0.05)，而氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高(P<0.05)；APS低、中、高劑量組的SOD、GSH水平以劑量依賴(lài)方式明顯升高(P<0.05)，而MDA水平則呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)(P<0.05)；與RSV組比較，利巴韋林組的SOD、GSH水平明顯升高(P<0.05)，而MDA水平降低(P<0.05)。此外，利巴韋林組的SOD活性與APS高劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但GSH水平明顯低于APS高劑量組，MDA水平明顯高于APS高劑量組(P<0.05)(圖5)。

圖5 APS對(duì)肺組織SOD、GSH和MDA含量的影響(n=10)Fig.5 Effects of APS on the contents of SOD, GSH and MDA in lung tissue (n=10)

2.6 APS對(duì)TLR4/MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組

比較，RSV組，APS低、中、高劑量組及利巴韋林組TLR4、p-MAPK、p-NF-κB蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與RSV組比較，APS中、高劑量組及利巴韋林組的TLR4、p-MAPK、p-NF-κB蛋白水平明顯降低(P<0.05)。此外，利巴韋林組的TLR4、p-MAPK及p-NF-κB表達(dá)水平明顯高于APS高劑量組(P<0.05)(圖6)。

圖6 APS對(duì)TLR4/MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用(n=10)Fig.6 Regulating effects of APS on TLR4/MAPK/NF-κB signaling pathway (n=10)

3 討 論

RSV是下呼吸道感染的重要原因，可導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎和肺炎[18]。目前臨床上仍無(wú)有效、安全的RSV治療藥物。既往研究報(bào)道，利巴韋林具有抑制RSV復(fù)制的作用[19]，但近年的數(shù)據(jù)表明，利巴韋林對(duì)RSV感染引起的炎癥反應(yīng)作用有限[18]，與本研究結(jié)果一致。因此，尋找可抑制RSV感染引起的炎癥反應(yīng)的藥物具有重要意義。

APS具有抗氧化、抗炎、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，APS可抑制RSV誘導(dǎo)的小鼠體重減輕，并可降低肺指數(shù)，提示其可有效減輕RSV感染引起的肺水腫，改善小鼠的身體狀況。本研究還檢測(cè)了小鼠血清中的促炎細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)高劑量APS可抑制RSV感染誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-18及IL-33的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。此外，空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APS有降低RSV滴度、抑制病毒復(fù)制的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，RSV肺炎小鼠體內(nèi)的MDA水平升高，GSH和SOD活性降低[21]。已知MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性[22]；細(xì)胞內(nèi)GSH水平降低可使細(xì)胞對(duì)有害刺激的敏感性升高[23]；SOD活性降低可導(dǎo)致機(jī)體超氧化物的過(guò)量利用，進(jìn)而產(chǎn)生自由基類(lèi)物質(zhì)損傷細(xì)胞[22]。本研究在小鼠RSV肺炎中發(fā)現(xiàn)，高劑量APS治療可逆轉(zhuǎn)MDA、GSH及SOD水平的變化，提示APS具有抗氧化作用。

本研究還探討了APS的免疫調(diào)節(jié)作用。已知在正常情況下，人體內(nèi)輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+T細(xì)胞，簡(jiǎn)稱(chēng)CD4+T細(xì)胞)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+T細(xì)胞，簡(jiǎn)稱(chēng)CD8+T細(xì)胞)的比值相對(duì)穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠感染RSV后，CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值發(fā)生變化，提示RSV感染可誘導(dǎo)機(jī)體免疫平衡紊亂；而高劑量APS可調(diào)節(jié)CD4+/CD8+比值趨于正常，另外APS治療還可增高CD8+T細(xì)胞百分比，降低CD4+T細(xì)胞百分比，提示APS具有激活免疫反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫失衡的雙向作用，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。

此外，本研究還進(jìn)一步探討了APS發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用的潛在機(jī)制。已知Toll樣受體(TLRs)是一類(lèi)進(jìn)化保守的模式識(shí)別受體，在機(jī)體識(shí)別病毒感染方面，具有調(diào)節(jié)干擾素和促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生等作用。Marchant等[24]發(fā)現(xiàn)，TLR4明顯集中于病毒與細(xì)胞的相互作用部位，可參與RSV病毒的內(nèi)化。Marzec等[25]發(fā)現(xiàn)，TLR4參與了RSV所致小鼠肺部疾病的發(fā)生發(fā)展，可激活細(xì)胞免疫，促進(jìn)炎癥復(fù)合物的產(chǎn)生。MAPK和NF-κB信號(hào)通路的激活在TLR4信號(hào)軸中起著至關(guān)重要的作用，最終可導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV可促進(jìn)TLR4蛋白表達(dá)增多，并促使MAPK和NF-κB蛋白發(fā)生磷酸化，而APS可呈劑量依賴(lài)性地逆轉(zhuǎn)上述蛋白變化，從而抑制TLR/MAPK/NF-κB信號(hào)通路的激活，提示APS可能通過(guò)該通路抑制RSV感染引起的炎癥反應(yīng)和氧化反應(yīng)。鑒于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性，雖然本研究發(fā)現(xiàn)高劑量APS可明顯抑制RSV誘導(dǎo)幼鼠肺炎的發(fā)生發(fā)展，但其對(duì)人體的有效治療濃度仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，APS可抑制RSV病毒復(fù)制，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減輕RSV引起的炎癥及氧化反應(yīng)，且其機(jī)制可能與抑制TLR4/MAPK/NF-κB通路的激活有關(guān)。然而動(dòng)物研究與人群研究相比存在其固有的局限性，因此，為明確APS對(duì)幼兒RSV肺炎的作用，今后仍需進(jìn)行更為深入的人群研究，對(duì)APS應(yīng)用于臨床的可能性加以探索。