陳彥民 鄒明雷 李 麗 王珍珍 呂晶晶

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)估計(jì)，全世界約有140萬(wàn)婦女患有宮頸癌(僅次于乳腺癌)。早期發(fā)現(xiàn)可在降低相關(guān)發(fā)病率方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，但是臨床上多數(shù)患者確診時(shí)已至晚期[1,2]。因此，尋找高效的治療藥物在臨床上具有重要意義。安羅替尼(anlotinib)是一種口服多受體酪氨酸激酶小分子抑制劑，對(duì)腫瘤血管的生成和生長(zhǎng)有廣泛的抑制作用。安羅替尼在中國(guó)被批準(zhǔn)用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者，目前其處于Ⅱ期和/或Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段[3-5]。但是，安羅替尼對(duì)宮頸癌是否有療效尚未清楚。本研究旨在探究安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細(xì)胞HeLa由上海中國(guó)科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)饋贈(zèng)；改良杜氏細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell count kit，CCK-8)購(gòu)自上海碧云天公司；遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell)小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。所有引物、質(zhì)粒的序列均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。兔單克隆抗體CyclinD1、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-AKT均購(gòu)自上海艾博抗公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京凱瑞基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞HeLa的培養(yǎng)：DMEM+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液培養(yǎng)，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 細(xì)胞分組 將正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞標(biāo)記為NC組。安羅替尼(4、8、16、32 μmol/L)處理HeLa細(xì)胞48 h，分別標(biāo)記為4 μmol/L安羅替尼組、8 μmol/L安羅替尼組、16 μmol/L安羅替尼組、32 μmol/L安羅替尼組，選取16 μmol/L安羅替尼組細(xì)胞標(biāo)記為安羅替尼組。使用3～5倍質(zhì)?；駾NA量的脂質(zhì)體將miR-NC(miR-NC組)、miR-33b(miR-33b mimics組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-33b(anti-miR-33b組)、16 μmol/L安羅替尼+anti-miR-NC(anti-miR-NC+安羅替尼處理組)、16 μmol/L安羅替尼+anti-miR-33b(轉(zhuǎn)染anti-miR-33b+安羅替尼組)，轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后，補(bǔ)充新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的效率。確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-NC、miR-33b mimics和anti-miR-NC、anti-miR-33b均由上海吉瑪公司完成。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)增殖期需要檢測(cè)的細(xì)胞，將其按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，添加CCK-8反應(yīng)液，孵育4 h后，將其置于酶標(biāo)儀中，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光值(A)。增殖抑制率為(1-A樣本/A對(duì)照)×100%。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 將需要檢測(cè)的細(xì)胞裂解后提取總蛋白。取定量后的蛋白50 μg進(jìn)行蛋白電泳上樣，然后將蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。再用2.5%的脫脂奶粉將膜在室溫下封閉處理2 h。結(jié)束后，進(jìn)行一抗(CyclinD1，1∶1000；MMP2，1∶1500；MMP9，1∶1000；p-PI3K，1∶2000；p-AKT，1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，1∶2000)37℃孵育2 h。最后將膜用電化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影曝光。用Quantity One軟件將目的條帶的灰度值與內(nèi)參的灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)。

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 選用含有基質(zhì)膠的小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，不含基質(zhì)膠的小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。具體操作步驟為：先將需要檢測(cè)的細(xì)胞用不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，進(jìn)行饑餓處理。取約104個(gè)細(xì)胞均勻浸潤(rùn)小室的上層膜，再將下室中加入600 ml的含血清的培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜(約 12 h)。取出小室，擦去殘余細(xì)胞，將穿過(guò)膜的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色。最后在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 將需要檢測(cè)的細(xì)胞提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以此為模板按照qRT-PCR試劑盒要求操作，檢測(cè)模板中miR-33b的表達(dá)情況。結(jié)果計(jì)算，以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-33b的相對(duì)表達(dá)水平。miR-33b上游引物5′-TGTCAGGCAACCGTATTCACC-3′，下游引物5′-CATGCAGTGAGTTAGATGTAGAACGTGCATTGCTGT-3′；U6上游引物5′-ATACAGAGAAAGTTAGCACGG-3′，下游引物5′-GGAATGCTTCAAAGAGTTGTG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中所涉及的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析+LSD-t檢驗(yàn)，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)意義用P<0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖抑制的影響

結(jié)果如圖1、表1所示，與NC組相比，安羅替尼(4、8、16、32 μmol/L)對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率呈濃度依賴性增強(qiáng)(P<0.05)。因16 μmol/L安羅替尼對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率接近半數(shù)抑制率，故選用該濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 Western blot檢測(cè)CyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)

表1 不同濃度安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖抑制的影響

2.2 安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移和侵襲的影響

結(jié)果如圖2和表2所示，與NC組相比，安羅替尼(16 μmol/L)處理的HeLa細(xì)胞中MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)均顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

注：A：transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲,B：Western Blot檢測(cè)MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)。

表2 安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa遷移和侵襲的影響

2.3 安羅替尼對(duì)miR-33b表達(dá)的影響

與NC組miR-33b表達(dá)量(1.00±0.11)相比，安羅替尼組細(xì)胞中miR-33b表達(dá)量(3.96±0.40)顯著升高(t=21.405，P<0.05)。

2.4 miR-33b對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移和侵襲的影響

結(jié)果如圖3和表3所示，與miR-NC組相比，miR-33b組細(xì)胞中miR-33b表達(dá)顯著升高，CyclinD1、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)均顯著降低，細(xì)胞的增殖抑制率顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-33b組細(xì)胞則發(fā)生相反的變化。

注：A：transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲情況,B：Western blot檢測(cè)CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)情況。

表3 miR-33b對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移和侵襲的影響

2.5 低表達(dá)miR-33b在安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移和侵襲影響中的逆轉(zhuǎn)作用

結(jié)果如圖4和表4所示，與安羅替尼+anti-miR-NC組相比，安羅替尼+anti-miR-33b組細(xì)胞中miR-33b表達(dá)顯著降低，CyclinD1、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)均發(fā)生明顯升高，增殖抑制率顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)。

注：A：transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲,B：Western Blot檢測(cè)CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)。

表4 低表達(dá)miR-33b在安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖、遷移和侵襲影響中的逆轉(zhuǎn)性

2.6 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

結(jié)果如圖5和表5所示，與NC組相比，安羅替尼組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá)均顯著降低。與安羅替尼+anti-miR-NC組相比，安羅替尼+anti-miR-33b組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。

圖5 Western blot檢測(cè)p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)

表5 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

安羅替尼是一種多目標(biāo)受體酪氨酸激酶抑制劑，在婦科癌癥中具有潛在的FGFR抑制作用和抗血管生成活性[6]。在美國(guó)的Ⅰb期復(fù)發(fā)性或持續(xù)性卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌的臨床劑量研究中顯示，每日單次服用12 mg，每2周開方/1周關(guān)閉的方案時(shí)，該藥耐受性良好[7]。據(jù)報(bào)道，安羅替尼能夠抑制甲狀腺癌細(xì)胞的活力，并阻滯細(xì)胞周期的G2/M期，在體內(nèi)還可抑制小鼠異種移植甲狀腺腫瘤的生長(zhǎng)，揭示安羅替尼在甲狀腺癌中的抗腫瘤活性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這與前輩們關(guān)于安羅替尼抗癌功能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，為安羅替尼在宮頸癌中的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)支持。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼可明顯上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中miR-33b的表達(dá)，猜測(cè)miR-33b可能參與了安羅替尼的抗癌功能。

miR-33b是miR-33家族的成員，在多種癌癥中起著抑癌作用[9,10]。Zhai等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-33b在非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)組織和細(xì)胞系中下調(diào)，與細(xì)胞增殖和集落形成增加有關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-33b能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、集落形成并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡并抑制癌細(xì)胞的葡萄糖代謝，其機(jī)制與乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)。據(jù)報(bào)道，miR-33b在膽囊癌細(xì)胞中表達(dá)異常降低，并且上調(diào)miR-33b能夠增加E-鈣粘蛋白的水平，降低N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平，這與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、EMT和腫瘤生長(zhǎng)受阻有關(guān)，究其機(jī)制這與miR-33b靶向睫狀小根卷曲螺旋蛋白(ciliary rootlet coiled coil protein，CROCC)相關(guān)[12]。據(jù)報(bào)道，在胰腺癌中miR-33b可作為長(zhǎng)的非編碼RNA(lncRNA)分化拮抗非蛋白編碼RNA(differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR)的靶標(biāo)，還可靶向抑制下游的MMP16基因，調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，對(duì)胰腺癌的治療提供了新的策略[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-33b能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-33b則具有相反的作用，這說(shuō)明miR-33b在宮頸癌中也具有潛在的治療價(jià)值。

PI3K/AKT信號(hào)通路是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化等過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。研究顯示，miR-489通過(guò)靶向調(diào)節(jié)X-連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)并抑制PI3K/AKT和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)信號(hào)通路來(lái)抑制卵巢癌的發(fā)展[15]；下調(diào)芳香烴受體核易位蛋白2(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like 2，ARNTL2)可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼能夠抑制宮頸癌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，并且抑制miR-33b能夠部分逆轉(zhuǎn)安羅替尼對(duì)宮頸癌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用。這說(shuō)明了PI3K/AKT信號(hào)通路的活性受miR-33b和安羅替尼的調(diào)控，也說(shuō)明了miR-33b與安羅替尼在抗宮頸癌中的相互關(guān)系，為安羅替尼在宮頸癌治療中的價(jià)值提供理論支持，但不足的是，缺乏動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)支持。

綜上所述，安羅替尼可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制與上調(diào)miR-33b，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活性有關(guān)，為安羅替尼在宮頸癌中的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。