于江龍 阿不都拉·艾沙 楊 巖 克熱木·阿卜力提普 欒新平

膠質(zhì)瘤細胞是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)病率最高且致死率最高的一種原發(fā)性惡性腫瘤，具有惡性程度高、增殖速度快、腫瘤異質(zhì)性明顯的特點，這些特點都是導致該病對放療、化療具有極高耐受性的原因[1-2]，而p-PI3K/p-AKT信號通路是與膠質(zhì)瘤的發(fā)生具有密切聯(lián)系的信號通路，可調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等多種惡性生物學行為，在腦膠質(zhì)瘤的治療中發(fā)揮重要作用[3-4]。lncRNA是一類非編碼RNA，具有高度保守的序列和表達的時空特異性以及特定的空間二級結(jié)構(gòu)，通過下調(diào)其表達可以改變膠質(zhì)瘤細胞的生物學行為[5]。有研究表明[6]，lncRNA-MALAT1在多種惡性腫瘤中均異常表達，可通過相關(guān)的信號通路發(fā)揮致癌基因的作用。本文旨在研究lncRNA-MALAT1基于p-PI3K/p-AKT通路對腦膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

研究細胞：人腦膠質(zhì)瘤細胞株U87購自中國科學院上海細胞庫。

主要試劑及材料：牛血清(鄭州九龍生物制品)，DMEM培養(yǎng)基(上海一基實業(yè)有限公司)，恒溫箱(深圳市北特儀器設備有限公司)，嘌呤霉素(湖北正興源精細化工有限公司)，EDTA-K2抗凝管(深圳市保安醫(yī)療用品有限公司)，胰酶(西安拉維亞生物科技有限公司)，酶標儀(濟南駿馳生物科技有限公司)，酶標儀(四川翼高科技有限公司)；TBST溶液(上海圖赫實業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將凍存的U87細胞從液氮中取出，放置37℃水浴，快速解凍，解凍完成后，使用75%乙醇擦拭凍存管外部避免污染，在細胞超凈工作臺將U87細胞加入1.5 ml DMEM培養(yǎng)基，用移液槍頭反復吹吸，將細胞團分散混勻，轉(zhuǎn)入離心管離心5 min，轉(zhuǎn)速為1000 r/min，棄去上清液，加入培養(yǎng)基，再次吹打混勻，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，靜置于37℃，5%CO2的恒溫箱，2～3天更換一次培養(yǎng)基，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與分組 將培養(yǎng)的對數(shù)期生長的U87腦膠質(zhì)瘤細胞株接種在12孔板中，當密度達到50%時進行轉(zhuǎn)染，分為腦膠質(zhì)瘤組、空白組和轉(zhuǎn)染組。腦膠質(zhì)瘤組不做處理，空白組為無意義序列，轉(zhuǎn)染組加入lncRNA-MALAT1慢病毒(lncRNA-MALAT1序列：5'-TGGCACCACACCTTCTACAA-3')。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染時將細胞與含有病毒的上清液同時進行孵育，48 h以后加入嘌呤霉素進行抗篩選，兩天更換一次清洗液，2周后轉(zhuǎn)染的細胞宣布死亡，再將嘌呤霉素的濃度改為2 μg/ml，然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

1.2.3 lncRNA-MALAT1表達檢測 將細胞碾碎，利用Trizol試劑提取細胞中的總RNA，使用微量分光光度計測量RNA的濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄呈cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒進行檢測，PCR反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，循環(huán)40次，利用2-△△Ct計算lncRNA-MALAT1表達量。

1.2.4 細胞凋亡情況 流式細胞儀檢測腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡的情況，取出六孔板，37℃ PBS洗滌貼壁細胞2次并收集，滴加適量0.25%胰酶消化細胞，待細胞剛脫落時，吸棄胰酶，需避免胰酶的過度消化，用含2%BSA的PBS(4℃)終止消化。吹打混勻后將細胞收集到離心管內(nèi)，1 ml PBS(4℃)重懸轉(zhuǎn)入1.5 ml的EP管中，2000 rpm，4℃離心5 min，吸棄上清，重復上述步驟：重懸，離心，棄上清后，加入500 μl Binding Buffer，吹打懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，往EP管中加入5 μl PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育5～15 min，用300目銅網(wǎng)過濾，在1 h內(nèi)使用流式細胞儀檢測。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖情況 將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化后，充分吹打成單細胞懸液，計數(shù)后以2.5×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當細胞密度達到70%時，棄去大部分培養(yǎng)液，加入適當培養(yǎng)基，26 h后，用槍頭吸去培養(yǎng)液，小心用PBS洗2遍，每孔加入終濃度為0.5 mg/ml MTT的新鮮培養(yǎng)液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄MTT溶液，每孔加入100 μl DMSO后，將培養(yǎng)板置于振蕩器上振搖10 min，使形成的紫色結(jié)晶充分溶解，多功能酶標儀570 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲 將基質(zhì)膠在4℃的冰上解凍過夜，再用EP管預冷，用PBS洗滌3次，在37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，用胰酶消化細胞，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，在顯微鏡下記錄細胞的數(shù)量，用結(jié)晶紫進行染色，再用PBS洗滌3次，用濃度為95%的乙醇固定35 min，再用顯微鏡觀察穿膜細胞的數(shù)量。

1.2.7 Western blot法檢測相關(guān)蛋白水平 U87腦膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)至80%的匯合率時，進行Western blot法檢測p-PI3K/p-AKT通路相關(guān)蛋白以及MMP2、MMP9蛋白水平，先用冷PBS清洗細胞，加入配好的細胞裂解液，4℃下裂解5 min，用細胞刮子刮下細胞，將其吸入到EP管中，15000 r/min，離心20 min，吸取的上清液即為所需全蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，煮蛋白98℃ 5 min，將取樣蛋白樣進行電泳，轉(zhuǎn)膜，用TBST配制的牛奶封閉1 h，加入一抗在4℃下孵育過夜(p-PI3K/p-AKT通路相關(guān)蛋白以及MMP2、MMP9按照1∶1000的比例進行稀釋)，過夜后用TBST洗膜5次，每次6 min，然后用熒光二抗避光孵育1 h，掃描灰度并計算p-PI3K/p-AKT通路蛋白以及MMP2、MMP9蛋白的表達量，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組lncRNA-MALAT1表達量比較

與腦膠質(zhì)瘤組相比，空白組、轉(zhuǎn)染組lncRNA-MALAT1表達量較低；與空白組相比，轉(zhuǎn)染組lncRNA-MALAT1表達量較低，lncRNA-MALAT1在腦膠質(zhì)瘤組中呈高表達(P<0.05),見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤細胞株中l(wèi)ncRNA-MALAT1表達量比較

2.2 各組腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡、增殖率比較

與轉(zhuǎn)染組相比，空白組、腦膠質(zhì)瘤組細胞凋亡率較低；與空白組相比，膠質(zhì)瘤組細胞凋亡率較低。與轉(zhuǎn)染組相比，空白組、腦膠質(zhì)瘤組細胞增殖率較高；與空白組相比，腦膠質(zhì)瘤組細胞增殖率較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡、增殖率比較

2.3 各組p-PI3K/p-AKT通路相關(guān)蛋白表達水平比較

與轉(zhuǎn)染組相比，空白組、腦膠質(zhì)瘤組p-PI3K、p-AKT蛋白表達較高；與空白組相比，腦膠質(zhì)瘤組p-PI3K、p-AKT蛋白表達較高(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 各組p-PI3K/p-AKT通路相關(guān)蛋白表達比較

圖1 各組p-PI3K/p-AKT通路相關(guān)蛋白表達水平比較

2.4 各組膠質(zhì)瘤細胞侵襲狀況比較

如圖2所示，空白組、轉(zhuǎn)染組膠質(zhì)瘤細胞侵襲個數(shù)均低于腦膠質(zhì)瘤組，轉(zhuǎn)染組膠質(zhì)瘤細胞侵襲個數(shù)低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。如表4、圖3所示，與轉(zhuǎn)染組相比，空白組、腦膠質(zhì)瘤組MMP2、MMP9蛋白表達較高；與空白組相比，腦膠質(zhì)瘤組MMP2、MMP9蛋白表達較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 各組細胞侵襲圖(結(jié)晶紫染色，200×)

表4 各組侵襲相關(guān)蛋白表達比較

圖3 MMP2、MMP9蛋白表達變化情況

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是成人中常見的一種顱內(nèi)腫瘤，同時也是侵襲性和致死性最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病是由多因素、多基因共同作用的結(jié)果，細胞增殖、凋亡、侵襲均會在多種致癌物質(zhì)的誘發(fā)下失控，最后導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。目前，治療腦膠質(zhì)瘤的方法有很多，如神經(jīng)導航下手術(shù)切除、放化療、基因治療等，但由于膠質(zhì)瘤的惡性程度較高、進展速度較快，因此這些治療方法的效果較差，腦膠質(zhì)瘤患者的預后和生活質(zhì)量未見改善[9-10]。

有研究表明[11]，人類基因組中有1%的基因可以轉(zhuǎn)錄成有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，但是大部分的RNA是無蛋白編碼功能的非編碼RNA，而lncRNA就是一種非編碼RNA，且其異常表達與人類腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)，參與腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學過程。有研究指出[12]，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展必須具備細胞持續(xù)性的增殖、抑癌基因失活、細胞永生化、侵襲、細胞凋亡抑制等基本生物學特征，而研究發(fā)現(xiàn)高表達的lncRNA可促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲，抑制其凋亡。MALAT1主要存在于人體細胞的核散斑中，而核散斑是一個重要的亞核結(jié)構(gòu)，其中含有大量的核蛋白，這些蛋白參與前體心室RNA的交替剪接和轉(zhuǎn)運，表明MALAT1是轉(zhuǎn)錄后RNA修飾的一個調(diào)控因子，通過基因芯片及PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個與膠質(zhì)瘤發(fā)生相關(guān)的lncRNA-MALAT1在多種膠質(zhì)瘤細胞系和膠質(zhì)瘤組織中呈高表達[13]。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病是多因素多基因作用的結(jié)果，而細胞的信號傳導對這一過程起到重要作用，p-PI3K/p-AKT通路能夠被一些神經(jīng)營養(yǎng)因子和其他生物學刺激而激活[14-15]，可對細胞的增殖和凋亡造成直接影響，同時對腫瘤的生長和對化療的反應也可造成深刻的影響，p-PI3K/p-AKT通路在細胞內(nèi)可抑制凋亡，促進增殖，對腫瘤下游多種效應分子的活化狀態(tài)進行影響[16-17]。本文研究顯示，通過下調(diào)lncRNA-MALAT1可調(diào)控p-PI3K/p-AKT通路相關(guān)蛋白的表達，抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡。

MMPs是高度保守的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，在正常人體中，MMPs的表達量極少，當人體處于病理狀態(tài)中時，由于炎性細胞因子、激素以及生長因子的刺激，MMPs的表達量會急劇上升[18-19]。有研究表明[20]，MMP2、MMP9與腦膠質(zhì)瘤的侵襲性密切相關(guān)，細胞的侵襲性越強，腦膠質(zhì)瘤細胞分泌的MMP2、MMP9的量就越多，MMP2、MMP9可通過降解膠質(zhì)瘤細胞外基質(zhì)，而為腫瘤向正常組織侵襲提供通路和空間，進而對腦膠質(zhì)瘤的侵襲性生長產(chǎn)生影響。本文研究結(jié)果顯示，lncRNA-MALAT1可通過抑制p-PI3K/p-AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達而降低MMP2、MMP9蛋白的表達量，抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。研究顯示[21]，lncRNA-MALAT1可通過抑制p-PI3K/p-AKT信號通路而抑制MMPs蛋白的活性，繼而抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲性，與本文研究結(jié)果一致。

綜上所述，lncRNA-MALAT1可有效降低p-PI3K/p-AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達，繼而有效抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲，促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，降低MMP2、MMP9蛋白的表達量。