李曉博，王華啟，王云飛，魏小婉，張國俊

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450052）

人口老齡化、環(huán)境惡化、不良生活習(xí)慣等使全球癌癥負(fù)擔(dān)急劇增加。癌癥在中國也成為主要的死亡原因，病例數(shù)每年仍在上升，其中肺癌是我國乃至全世界發(fā)病率及病死率最高的癌癥［1］。2020年，在我國所有疾病中，肺癌病死率居第四，其中肺腺癌已經(jīng)超越肺鱗癌成為發(fā)病率最高的肺癌類型［2］。由于早期肺腺癌多無明顯的臨床癥狀，大多數(shù)患者初次就診時已經(jīng)處于晚期。目前常用于肺腺癌臨床診斷及早期篩查的指標(biāo)有甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1、NapsinA、細(xì)胞角蛋白7、白細(xì)胞分化抗原15等，但其特異度和靈敏度均欠佳，能夠反映預(yù)后的相關(guān)標(biāo)志分子也有待進(jìn)一步探索。早期肺腺癌常選擇手術(shù)治療，Ⅲ期多以放化療為主，Ⅳ期則以全身治療為主，可選擇放化療結(jié)合靶向治療及免疫治療。靶向治療及免疫療法已經(jīng)成為晚期肺腺癌的一線療法，雖然在臨床實踐中取得了一定的成績，但是患者易出現(xiàn)耐藥且5 a生存率仍然不高，所以積極尋找相關(guān)分子標(biāo)志物對于肺腺癌的診斷和治療有重要意義。血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）參與肺上皮和腸上皮平滑肌松弛，具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用，能夠促進(jìn)外周神經(jīng)元存活并抑制損傷后神經(jīng)元的死亡［3］，可以通過上調(diào)P53，下調(diào)核因子-κB、血管內(nèi)皮生長因子、CD-34表達(dá)水平抑制人腎細(xì)胞癌A498細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移［4］，同時也具有免疫調(diào)節(jié)功能，是巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞的特異性趨化因子和激活因子［5-6］，并且能抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-12、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1（macrophage inflammatory protein 1，MIP-1）、MIP-2在內(nèi)的多種促炎因子及趨化因子的產(chǎn)生［4］，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10、IL-1R 等 拮 抗 劑 的 產(chǎn) 生，其 中TNF-α、IL-12、MIP-1、MIP-2、IL-10主要通過血管活性腸肽受體1（vasoactive intestinal peptide receptor 1，VIPR1）調(diào)節(jié)［7］。VIPR1是VIP最主要的作用受體，主要存在于人腦的一些區(qū)域，也在大鼠和人類肺巨噬細(xì)胞、肺靜脈血管平滑肌和從支氣管至呼吸性細(xì)支氣管的氣道上皮中表達(dá)［8］。VIPR1在不同腫瘤組織中呈不同表達(dá)，在乳腺癌組織中的表達(dá)量高于正常乳腺組織的5倍［9］，在胰腺癌［10］、肝癌［11］、甲狀腺癌［12］、非小細(xì)胞肺癌［13］腫瘤組織中的表達(dá)量則低于正常組織。在乳腺癌中VIP作用于VIPR1能引起癌細(xì)胞增殖［14］，而肝細(xì)胞癌中，高表達(dá)VIPR1患者的預(yù)后相對較好［11］。越來越多研究證明VIPR1在人類癌癥的鑒別及治療中起重要作用，如在前列腺癌中拮抗VIP與VIPR1的結(jié)合能抑制腫瘤細(xì)胞生長［11］，在乳腺癌中作為分子靶點進(jìn)行腫瘤組織功能成像及靶向化療［15］。在肺腺癌中上調(diào)VIPR1基因的表達(dá)能抑制H1299細(xì)胞的生長［16-17］。近年來，免疫治療日益成為肺癌治療的熱點，其效果也與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)。目前尚無VIPR1基因在肺腺癌免疫浸潤中的作用的相關(guān)研究，所以本研究擬通過多種生物信息學(xué)方法對VIPR1基因在肺腺癌中的作用進(jìn)行研究，并挖掘其對免疫細(xì)胞浸潤模式的影響，為臨床提供新的免疫相關(guān)基因的預(yù)后標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集及整理分析從腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載肺腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù)（535例為腫瘤樣本，59例為正常對照樣本），分析腫瘤組織和正常組織基因表達(dá)的差異，通過單因素Cox回歸分析探討VIPR1表達(dá)水平與肺腺癌患者總生存時間的關(guān)系。選取T分期、M分期、N分期、年齡、性別、臨床分期作為肺腺癌臨床病理特征。用箱線圖顯示正常組和腫瘤組基因表達(dá)的差異。

1.2 基因富集分析采用GSEA 4.0.1軟件分析探索與VIPR1相關(guān)的重要信號通路。根據(jù)VIPR1表達(dá)水平分為高表達(dá)組及低表達(dá)組。通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）網(wǎng) 站 獲 取c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt數(shù)據(jù)集。采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計方法進(jìn)行富集分析并設(shè)置隨機組合次數(shù)為1 000次。

1.3 免疫浸潤評估采用CIBERSORT（http：／／cibersort.stanford.edu／）估算肺腺癌組織及正常肺組織中22種免疫細(xì)胞的組成。通過反卷積算法，采用CIBERSORT軟件基于標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)計算復(fù)雜細(xì)胞中的免疫細(xì)胞組成，并給出計算結(jié)果的可信度，將P＜0.05作為計算所得結(jié)果可靠。

1.4 VIPR1與免疫浸潤細(xì)胞關(guān)系分析通過TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫（http：／／timer.cistrome.org／）的Immune板塊分析VIPR1表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓系抑制性細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系，在所有計算結(jié)果中選擇腫瘤類別為肺腺癌，保存并下載所需結(jié)果至本地計算機。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用R 4.1.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Wilcoxon秩和檢驗比較肺腺癌組織和正常肺組織中VIPR1的表達(dá)，采用單因素方差分析比較不同TNM分期肺腺癌組織中VIPR1的表達(dá)水平，采用Spearman相關(guān)性檢驗分析兩組間的相關(guān)性，通過Kaplan-Meier曲線分析VIPR1與總生存期的關(guān)系，并采用log-rank法進(jìn)行檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 VIPR1基因在肺腺癌組織和正常組織中的表達(dá)通過TCGA公共數(shù)據(jù)庫分析VIPR1在肺腺癌組織及正常肺組織中的差異，結(jié)果顯示VIPR1在正常肺組織中的表達(dá)水平較肺腺癌組織高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 VIPR1基因在肺腺癌組織和正常組織中的表達(dá)

2.2 VIPR1基因高表達(dá)組和低表達(dá)組的預(yù)后VIPR1高表達(dá)組患者的預(yù)后較低表達(dá)組好（P＜0.05）。見圖2。

圖2 VIPR1高低表達(dá)組的預(yù)后分析

2.3 VIPR1基因表達(dá)水平與肺腺癌患者的臨床病理特征關(guān)系根據(jù)VIPR1在肺腺癌組織中表達(dá)的中位值，將患者分為高表達(dá)組（267例）和低表達(dá)組（268例），其中，部分患者的性別（22例）、年齡（41例）、T分期（25例）、N分期（34例）、M 分期（166例）、臨床分期（30例）、生存狀態(tài)（23例）信息不完整，未對該部分患者相關(guān)信息分析。進(jìn)一步分析肺腺癌中VIPR1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示VIPR1的表達(dá)與患者的生存狀態(tài)（P＜0.001）、N 分 期（P＝0.010）、臨 床 分 期（P＝0.011）有關(guān)，與性別、年齡、T分期、M 分期無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床特征肺腺癌患者VIPR1的表達(dá)［n（%）］

2.4 VIPR1低表達(dá)組的功能富集分析通過VIPR1表達(dá)的中位數(shù)將肺腺癌患者分為高、低表達(dá)組，GSEA富集分析結(jié)果表明，VIPR1低表達(dá)樣本富集在一些信號通路中，如細(xì)胞周期通路、P53信號通路、DNA復(fù)制通路、RNA降解通路等。見表2。

表2 VIPR1低表達(dá)組基因功能富集分析

2.5 肺腺癌和正常組織中免疫細(xì)胞浸潤情況肺癌組織與正常組織中免疫細(xì)胞的浸潤構(gòu)成存在差異。肺腺癌組織中幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞、激活的CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、靜息的樹突狀細(xì)胞浸潤水平較正常肺組織高（P＜0.05），而正常肺組織靜息的CD4+T細(xì)胞、靜息的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、激活的樹突狀細(xì)胞、靜息的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤水平高于肺腺癌組織（P＜0.05）；在兩種組織中均未發(fā)現(xiàn)幼稚的CD4+T細(xì)胞；記憶B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、激活的NK細(xì)胞、激活的肥大細(xì)胞在肺腺癌組織和正常組織中的浸潤水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 正常肺組織與肺腺癌組織中免疫細(xì)胞組成的差異

2.6 VIPR1基因表達(dá)水平與免疫浸潤細(xì)胞表達(dá)相關(guān)性通過TIMER 2.0分析發(fā)現(xiàn)，VIPR1基因的表達(dá)水平與髓系抑制性細(xì)胞的浸潤水平（相對水平）呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.488，P＜0.001）。見圖4。

圖4 VIPR1表達(dá)水平與免疫浸潤水平的相關(guān)性

3 討論

在中國，肺癌給國家?guī)砹藰O大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，肺癌的預(yù)防、診斷、治療仍是當(dāng)今的一大難題。目前肺腺癌尚無有效的分子標(biāo)志物及治療靶點，探討肺腺癌的生物學(xué)發(fā)病機制及分子治療靶點有重要意義。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織的VIPR1表達(dá)水平低于正常肺組織。肺腺癌中VIPR1高表達(dá)組的生存率優(yōu)于低表達(dá)組，這提示VIPR1可能是肺腺癌的一個重要的抑癌基因，這與Zhao等［16］發(fā)現(xiàn)的在H1299細(xì)胞中過表達(dá)VIPR1能夠抑制該細(xì)胞增殖、生長及侵襲的結(jié)果相符。進(jìn)一步分析VIPR1與肺腺癌臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，VIPR1的表達(dá)與患者的生存狀態(tài)、N分期、臨床分期相關(guān)，在肺腺癌患者中VIPR1的低表達(dá)可能引起腫瘤組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這往往提示預(yù)后不良。

采用GSEA軟件分析預(yù)測與肺腺癌組織中VIPR1表達(dá)相關(guān)的信號通路，結(jié)果顯示低表達(dá)VIPR1組富集在細(xì)胞周期信號通路、P53信號通路、RNA降解通路、DNA復(fù)制通路、堿基切除修復(fù)等信號通路。這些通路主要影響遺傳物質(zhì)的表達(dá)，基因突變往往是癌癥發(fā)生的重要原因。

VIPR1是VIP的主要受體，VIP可以抑制TNF-α、IL-6、血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生［4］。有研究表明，前列腺素E2、TNF-α、IL-6、IL-1、血管內(nèi)皮生長因子聯(lián)合粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子可以誘導(dǎo)健康受試者外周血分離的CD33+單核細(xì)胞分化成髓系抑制性細(xì)胞［18］。髓系抑制性細(xì)胞是由未成熟的髓系祖細(xì)胞發(fā)展而來，主要分為兩大類：單核髓系抑制性細(xì)胞和多形核髓系抑制性細(xì)胞［19］。抑制性免疫浸潤微環(huán)境是造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、免疫治療效果不佳的主要原因之一，髓系抑制性細(xì)胞是構(gòu)成抑制性免疫浸潤微環(huán)境的主要細(xì)胞之一，可以抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的作用，并且能直接作用于上皮細(xì)胞促進(jìn)其生長及突變［20］。多形核髓系抑制性細(xì)胞可以產(chǎn)生活性氧，直接破壞T細(xì)胞抗原受體與主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合，單核髓系抑制性細(xì)胞則可以消耗T細(xì)胞重要的營養(yǎng)物質(zhì)，如L-精氨酸，從而抑制T細(xì)胞的功能。腫瘤組織高浸潤的髓系抑制性細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其往往標(biāo)志著預(yù)后不良。Li等［21］關(guān)于三陰乳腺癌小鼠模型的研究顯示，多西環(huán)素可以減少多形核髓系抑制性細(xì)胞的浸潤從而增強程序性死亡受體1抑制劑的抗瘤活性進(jìn)而抑制腫瘤的生長。有研究顯示，髓系抑制性細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞的功能活性，并使急性炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y，發(fā)展為癌前狀態(tài)，最終發(fā)展為癌癥，抑制髓系抑制性細(xì)胞的募集，進(jìn)而抑制肺癌的進(jìn)展［22-23］。有研究顯示，激活STAT3信號通路可以增加髓系抑制性細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展轉(zhuǎn)移［24］。Xu等［25］研究表明，通過P53信號通路可誘導(dǎo)髓系抑制性細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制小鼠肺癌組織的生長。本研究通過TIMER分析發(fā)現(xiàn)VIPR1低表達(dá)能促進(jìn)髓系抑制性細(xì)胞在腫瘤組織的浸潤，兩者呈負(fù)相關(guān)，所以推測VIPR1對預(yù)后的影響可能是通過改變腫瘤組織髓系抑制性細(xì)胞的浸潤引起的。

綜上所述，本研究通過分析VIPR1表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床特征的關(guān)系、對免疫微環(huán)境的影響及預(yù)后發(fā)現(xiàn)，VIPR1可能作為肺腺癌臨床預(yù)后評估的指標(biāo)及靶向治療的新靶點。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫大樣本患者的臨床資料、轉(zhuǎn)錄組資料進(jìn)行分析，結(jié)果可信性較高。