陳曉琳，劉潔瑩，宋艷琦，周潔塵，，汪 亮，段 翔，李學(xué)信，何苑皞

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.南方人工林病蟲害防治國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2.湘潭市林業(yè)科學(xué)研究所，湖南 湘潭 411206）

花櫚木Ormosia henryi又稱花梨木，為豆目Fabales 蝶形花科Papilionaceae 紅豆屬Ormosia常綠喬木，是我國特有的珍貴用材樹種，產(chǎn)于我國亞熱帶地區(qū)，自然分布于安徽、浙江、江西、湖南、湖北、廣東、四川、貴州、云南9 個(gè)省份，海拔100～1 300 m 的山地、溪邊和谷地林內(nèi)[1]。花櫚木樹體高大，木材結(jié)構(gòu)均勻，硬度適中，是制作高檔家具、工藝雕刻和特種裝飾品的珍貴高檔用材樹種；其根、莖、葉和樹皮均可入藥，具有通絡(luò)、祛風(fēng)濕、消腫痛等功能，也是一味重要的中藥材[2]；其植株四季青翠，可作為優(yōu)良的園林綠化樹種。因此花櫚木是集觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值于一身的植物資源。由于花櫚木具有十分高的利用價(jià)值，其野生種群大樹遭到嚴(yán)重砍伐，且分布區(qū)狹窄，自然更新不良，導(dǎo)致其種群衰退瀕臨滅絕，使天然林資源已瀕于枯竭[3]，被列為國家二級(jí)保護(hù)植物。目前，花櫚木的人工培育以種子繁殖、組織培養(yǎng)和無性繁殖為主[4]。組織培養(yǎng)和無性繁殖技術(shù)雖然成活率較高，但對(duì)于花櫚木種質(zhì)資源的豐富及種群的延續(xù)并不利。采用種子繁殖有利于花櫚木種群的延續(xù)及擴(kuò)大，但種子繁殖的花櫚木幼苗存在幼苗生長細(xì)弱，結(jié)瘤率低，上山造林成活率低的問題，因此如何提高結(jié)瘤率，提高種子幼苗保存率是目前亟待解決的問題。

根瘤菌是一種革蘭氏陰性菌，主要存在于土壤中，菌體呈桿狀，細(xì)胞的大小在（0.4～0.9）μm×（1.2～3.0）μm 范圍內(nèi)變化，周身、側(cè)生或單鞭毛，能侵染大多數(shù)豆科植物形成共生固氮結(jié)構(gòu)-根瘤。根瘤菌通過共生固氮作用將空氣中游離態(tài)氮轉(zhuǎn)變成植物可利用態(tài)氮，并且其所固定的氮素約占生物固氮總量的65%。根瘤菌與植物的共生固氮作用，在生態(tài)改良和農(nóng)林牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展上有著非常廣闊的應(yīng)用前景。因?yàn)槠洳粌H可以有效地改良土壤肥力，并且可以緩解因過度使用氮肥而造成的環(huán)境污染[5]。目前研究根瘤菌的研究主要集中在與豆科植物共生的機(jī)理，但一些林木也可與根瘤菌形成根瘤，例如花櫚木、合歡Albizia julibrissin。等?；澳究膳c根瘤菌共生，但在栽培過程中發(fā)現(xiàn)，人工播種的花櫚木幼苗根瘤較少，幼苗長勢不佳。目前對(duì)花櫚木根瘤菌研究較少，主要集中在根瘤菌對(duì)植株的影響、根瘤菌種群多樣性等方面。段如雁等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌顯著地促進(jìn)了2年生花櫚木的生長，對(duì)花櫚木的葉綠素含量、硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性、根系活力等生化指標(biāo)影響極顯著，同時(shí)還對(duì)花櫚木根瘤菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究；安常蓉等[8]研究了花櫚木根瘤接種的適宜方式，發(fā)現(xiàn)用萌發(fā)種子浸根和用菌液澆灌長出真葉后的幼苗效果最佳。前人的研究表明接種根瘤菌對(duì)提高種子幼苗存活率，促進(jìn)苗木生長具有重要意義。

湖南土壤全磷含量低，是森林生態(tài)系統(tǒng)林木生長的關(guān)鍵限制因子之一，但依靠傳統(tǒng)地施加磷肥，僅有不足20.0%的磷素最終被作物吸收，并不能解決土壤“缺磷”的問題[9]。由于土壤中的一些細(xì)菌或真菌具有溶解無機(jī)或有機(jī)磷化合物的能力，因此可利用這些解磷微生物提高土壤有效磷。本研究結(jié)合湖南土壤及花櫚木種植的特點(diǎn)，篩選具有解磷能力的花櫚木根瘤菌，同時(shí)研究其對(duì)花櫚木實(shí)生苗生長的影響，可為提高花櫚木種子繁殖存活率提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于湖南湘潭市林業(yè)科學(xué)研究所苗圃地（112°70.33′E，27°85.76′N），海拔71.13 m，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均降水量1 300 mm，年平均溫度16.7～18.3℃。

1.2 花櫚木根瘤的采集

試驗(yàn)樣本分別于2020年6—11月采自湖南湘潭市林業(yè)科學(xué)研究所，挖取2～3年生長情況基本一致的野生花櫚木，放入自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃冰箱保存，并盡快進(jìn)行根瘤菌的分離培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)基

蒙金娜培養(yǎng)基：葡萄糖10 g；硫酸銨0.5 g；氯化鈉0.3 g；氯化鉀0.3 g；七水硫酸亞鐵0.03 g；四水硫酸錳0.03 g；碳酸鈣5 g；酵母膏0.4 g；卵磷脂0.2 g；瓊脂20 g；水1 000 mL；pH 值為7.0。

YMA 培養(yǎng)基：甘露醇10 g；磷酸氫二鉀0.5 g；七水硫酸鎂0.2 g；氯化鈉0.2 g；酵母膏0.8 g；0.5%鉬酸鈉和硼酸各4 mL；瓊脂20 g；水1 000 mL；pH 值7.0。

PKO 培養(yǎng)基：葡萄糖10 g；磷酸鈣3 g；硫酸銨0.5 g；氯化鈉0.1 g；七水硫酸鎂0.1 g；氯化鉀0.2 g；硫酸錳0.004 g；硫酸亞鐵0.002 g；酵母膏0.5 g；瓊脂20 g；水1 000 mL；pH 值為7.0。

NF 無氮營養(yǎng)液：二水氯化鈣132 mg；磷酸二氫鉀100 mg；磷酸氫二鈉150 mg；七水硫酸鎂120 mg；硼酸6.2 mg；五水合檸檬酸鐵5 mg；四水硫酸錳0.17 mg；七水硫酸鋅0.28 mg；六水氯化鈷0.24 mg；五水硫酸銅0.025 mg；二水鉬酸鈉0.024 mg；水1 000 mL；pH 值為6.5。

1.4 花櫚木根瘤菌的分離純化

從采回的花櫚木根系上選取個(gè)大、飽滿、新鮮的根瘤，首先用自來水沖去表面泥土，然后再用無菌水洗滌干凈。在無菌條件下，用75%的乙醇溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3 次后，接著用0.1%氯化汞溶液消毒5 min，再用無菌水沖洗7～8 次。然后將取部分根瘤放于滅菌的研缽中，用研缽將其壓碎，并取汁液接種于YMA 固體培養(yǎng)基上。隨后，在滅菌的載玻片上將另一部分根瘤切成兩半，然后用無菌鑷子夾住其中半個(gè)瘤，切面向下并在YMA 固體培養(yǎng)基表面劃線，然后全部倒置后在28℃條件下培養(yǎng)大約5 d，隨時(shí)觀察生長狀況。吸取最后一次沖洗的無菌水100 μL 于YMA 固體培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，作為對(duì)照。菌體長出后，進(jìn)行分離純化，直至獲得單菌落。取單菌落，然后接入試管斜面中于4℃冰箱保藏備用。

1.5 花櫚木根瘤菌解磷能力的測定

將10 μL 根瘤菌培養(yǎng)液點(diǎn)接種于蒙金娜培養(yǎng)基和PKO 培養(yǎng)基正中央，待風(fēng)干后蓋好，28℃培養(yǎng)96 h，得到產(chǎn)生透明圈的解磷菌純菌落，并測量記錄透明圈直徑(D)，斜面保藏備用。

測定有效磷的含量運(yùn)用鉬銻抗比色法。將1 mL（1×108cfu·mL-1）菌種接入 50 mL 滅菌的液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 160 r·min-1在搖床上培養(yǎng)2 d。取適量菌液，在4℃ 10 000 r·min-1條件下離心20 min，吸取上清液于容量瓶中，用水稀釋至20 mL，加入2,6-二硝基酚指示劑2 滴，調(diào)節(jié)pH 值至溶液呈微黃色，然后加入鉬銻抗顯色劑5 mL，搖勻、定容至刻度線。在室溫下放置30 min，用分光光度計(jì)在波長700 nm 下比色，以空白為參比液調(diào)零點(diǎn)。讀取數(shù)值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出顯色液磷的讀數(shù)。

溶磷量=[(顯色液磷的讀數(shù)×顯色液體積×分取倍數(shù))/(W×109)]×100；W：每個(gè)錐形瓶發(fā)酵液中加入有機(jī)或無機(jī)磷化物的質(zhì)量（g）。

1.6 根瘤菌回接試驗(yàn)

將分離得到的純菌落分別挑取接種到100 mL YMA 液體培養(yǎng)基中，在28℃、150 r·min-1條件下的恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h，待用。

花櫚木種子用75%乙醇溶液處理15 min 和0.1%氯化汞進(jìn)行表面消毒后，用無菌水沖洗7～8次。將處理后的種子，放于滅菌后的組培瓶中，在25℃條件下的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行催芽。發(fā)芽后將其浸泡于根瘤菌緩沖液中2 h，然后將處理過的幼苗置于無氮營養(yǎng)液NF 瓊脂培養(yǎng)基中于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)觀察。培養(yǎng)條件：25℃光照16 h，20℃黑暗8 h，并且根部保持黑暗。當(dāng)花櫚木幼苗長至超過試管口時(shí)，引苗出口，在培養(yǎng)過程需要及時(shí)補(bǔ)充NF 營養(yǎng)液，定期觀察結(jié)瘤情況，90 d 后收集根瘤。以不接種根瘤菌的花櫚木幼苗為對(duì)照，采用目測統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)目。固氮酶活性測定采用乙炔還原法[10]。

固氮酶活(nmol·mg-1·h-1))：U=n/(m·t)。式中：U表示根瘤固氮酶活（nmol·mg-1·h-1）；n表示乙烯含量（nmol）；m表示根瘤鮮質(zhì)量（mg）；t表示反應(yīng)時(shí)間（h）。

1.7 根瘤菌對(duì)花櫚木生長影響的測定

選取10 株結(jié)瘤數(shù)目較多，固氮酶活性較高的根瘤菌繼續(xù)后期實(shí)驗(yàn)?；澳居酌玳L出真葉時(shí)用根瘤菌液澆灌根部，培養(yǎng)7 個(gè)月后，采用直尺測量的方式測定花櫚木主干生長高度，主干直徑。植株洗凈擦干后于105℃烘箱中殺青30 min，再調(diào)至80℃烘干恒質(zhì)量并稱量干質(zhì)量。采用SPAD-502葉綠素儀測定葉綠素含量[11]、植株全氮量的測定采用凱氏定氮法[12]。

全氮含量(g·kg-1)：W=［c(V2-V1)×0.014］/［m(V3/V)］×1 000。式中：W表示植株全氮含量（g·kg-1）；c表示硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度0.01 moL·L-1；V1表示空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量（mL）；V2表示試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量（mL）；V3表示上機(jī)測試液量10 mL；m表示樣品質(zhì)量（g）；V表示消煮后定容液100 mL；0.014 表示氮的毫摩爾質(zhì)量（g·mmol-1）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用 Microsoft Excel 2016 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析、統(tǒng)計(jì)；利用IBM SPSS Statistics 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌的分離純化及形態(tài)

從花櫚木根瘤中分離到根瘤菌株20 株。菌落基本呈圓形、橢圓形，2～7 d 開始長出菌落，菌落直徑1.7～5 mm，乳白色或半透明，菌落表面凸起，邊緣整齊，產(chǎn)生黏液，具光澤。革蘭氏染色陰性，光學(xué)顯微鏡下觀察到菌體為桿狀或棒槌狀，平均大小為(2.98±0.54) μm×(0.58±0.60) μm。

2.2 花櫚木根瘤菌解磷能力的測定

將分離到的20 株花櫚木根瘤菌接種在解磷固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)96 h 后測量解磷圈大小，初步判斷菌株的解磷能力。由表1可看出，具有解無機(jī)磷能力的固氮菌有8 株，具有解有機(jī)磷能力的固氮菌有14 株，具有同時(shí)分解無機(jī)磷和有機(jī)磷的菌株有8 株，分別為XT202001、XT202006、XT202010、XT202011、XT202014、XT202016、XT202019、XT202020。菌株XT202016 的解磷能力最強(qiáng)，無機(jī)磷和有機(jī)磷的透明圈直徑，分別為2.22±0.2 和4.91±0.05 mm，無機(jī)磷和有機(jī)磷的溶磷量分別為31.1±0.3 和71.2±0.6 mg·L-1。

2.3 回接根瘤菌對(duì)花櫚木結(jié)瘤的影響

本研究將根瘤菌分別回接于花櫚木幼苗上，對(duì)根瘤數(shù)目和固氮酶活性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，其目的是為了鑒定上述根瘤菌的共生結(jié)瘤和固氮能力。結(jié)果如表2所示，所分離的根瘤菌能與花櫚木共生形成根瘤，而不接種處理的花櫚木（CK）則不能形成根瘤。根瘤菌接種花櫚木后根瘤數(shù)量在30 個(gè)以上的有XT202016、XT202012、XT202007，數(shù)量分別為39、33、31 個(gè)。

表1 不同根瘤菌菌株的解磷能力?Table 1 Phosphate solubilizing ability of different rhizobium strains

表2 回接不同根瘤菌對(duì)花櫚木結(jié)瘤及固氮的影響Table 2 Effects of inoculation with different rhizobium strains on nodulation and nitrogen fixation in O.henryi

根瘤固氮酶活性是衡量根瘤菌固氮能力的重要指標(biāo)[13]。固氮酶活性最高的為菌株XT202016，值為2.54 μmol·g-1·h-1，其次為XT202004，固氮酶活性為1.34 μmol·g-1·h-1。從表2中可以看出根瘤數(shù)量較多的菌株其固氮酶活性也較高。

2.4 回接根瘤菌對(duì)花櫚木生長的影響

從表3可以看出，將回接處理7 個(gè)月后的幼苗，與不接種根瘤菌的幼苗進(jìn)行對(duì)照相比。接種了根瘤菌的花櫚木在株高、地徑和植株干質(zhì)量方面均增加，其中接種了XT202016 的植株增加最為明顯，株高、地徑和植株干質(zhì)量分別為0.77 m、1.58 mm、0.525 g，與CK 對(duì)照相比分別增加了92.5%、22.5%、35.0%，表明通過接種根瘤菌明顯促進(jìn)了植株的生長發(fā)育（表3）。

表3 回接不同根瘤菌對(duì)花櫚木生長的影響Table 3 Effects of inoculation with different rhizobium strains on the growth of O.henryi

葉綠素含量高低可以影響植物光合作用。接種根瘤菌的花櫚木植株葉綠素含量和氮含量明顯高于對(duì)照。其中接種菌株XT202014 和XT202016的葉綠素含量顯著高于其他植株，且對(duì)應(yīng)的植株全氮含量也最高。說明接種上述2 株根瘤菌更能顯著促提高植株葉綠素含量和氮含量。

3 結(jié) 論

花櫚木屬于豆目植物，可與根瘤菌共生固氮，但人工培育的花櫚木幼苗結(jié)瘤率低，生長緩慢[5]。本研究從野生花櫚木的根瘤中分離篩選了20 株根瘤菌，測定了其解磷能力、結(jié)瘤能力及固氮酶活性，并從中選取了解磷、結(jié)瘤和固氮酶活性較高的10 株根瘤菌，測定了其對(duì)花櫚木生長的影響，結(jié)果表明接種根瘤菌后可明顯提高植株的株高、地徑、干質(zhì)量、葉綠素含量及含氮量?；澳靖鼍浠境蕡A形、橢圓形，2～7 d開始長出菌落，菌落直徑1.7～5 mm，乳白色或半透明，菌落表面凸起，邊緣整齊，產(chǎn)生粘液，并具光澤。革蘭氏染色為陰性，菌體為桿狀或棒槌狀。其中菌株XT202016 解磷、結(jié)瘤能力較強(qiáng)，固氮酶活性較高，同時(shí)對(duì)花櫚木生長的促進(jìn)作用也較為明顯。

4 討 論

南方地區(qū)淋溶強(qiáng)烈，土壤富含鋁離子和鐵離子，磷極易被固定[14]，有效磷缺乏是一種非常普遍的現(xiàn)象[15]。林木種植時(shí)雖然施用了大量磷肥，但最終被作物吸收磷素不足20.0%，其余的被化合沉淀、吸附或形成閉蓄態(tài)磷而無法被植物吸收利用成為利用率極低的難溶性磷[16]。自然界中存在一些微生物可以不同程度地將土壤中的難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的有效磷。通常在外界缺磷的情況下，解磷微生物才會(huì)增加自身次生代謝物的分泌，從而產(chǎn)生解磷作用[17]。Chungopast等[18]研究發(fā)現(xiàn)溶磷菌（PSB）的應(yīng)用可以解決土壤中的固磷問題，同時(shí)PSB 還具有提高盆栽甘蔗Saccharum officinarum栽培產(chǎn)量的能力。楊豆等[19]在毛竹根際分離出解磷細(xì)菌B.lata PN1 用于石灰?guī)r土壤中，該菌株具有能適用于南方丘陵山區(qū)酸性土壤竹林的環(huán)境友好型菌肥的潛力。根瘤菌雖然在共生體階段難以與外界土壤接觸，不能發(fā)揮其解磷作用，但在根瘤形成前或根瘤衰敗破裂后根瘤菌是以游離狀態(tài)存在于土壤之中，因此根瘤菌也可作為根際促生菌發(fā)揮解磷促生的作用[20]。李劍鋒等[21]的研究也表明，解磷根瘤菌能有效緩解植物在僅提供難溶性無機(jī)磷的環(huán)境中受到的缺磷脅迫，并使之恢復(fù)正常生長。韓梅等[22]在大豆上分離篩選到1 株兼具有結(jié)瘤固氮和解磷作用的根瘤菌，其固氮酶活性為4.94 μmol·g-1，解磷量在第7 天為35.50 μg·mL-1。本研究從花櫚木根瘤菌中篩選了具有解磷特性的菌株，但所篩菌株的解磷能力并不是很強(qiáng)，特別是解無機(jī)磷的能力，可以通過誘變育種提高解磷能力。同時(shí)本研究并未對(duì)菌株的解磷能力進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，因此菌株的解磷能力隨著時(shí)間的推移可能存在一定的變化。

對(duì)于結(jié)瘤的豆科植物來說，結(jié)瘤的多少代表苗木質(zhì)量的優(yōu)劣。根瘤菌能不同程度地促進(jìn)其苗木的生長，且結(jié)瘤率與幼苗的株高、地徑、生物量之間存在著明顯的正相關(guān)性。根瘤菌對(duì)其他科的植物也具有同樣的作用，曾電源等[23]將合歡幼苗接種根瘤菌后，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌不僅可以促進(jìn)合歡幼苗根系和葉片的生長，并且還可以緩解Cd 脅迫對(duì)根系生長、葉片發(fā)育的抑制作用。黃寶靈等[24]將根瘤菌接種馬占相思Acacia mangium苗木，苗木的生物量和葉片含氮量顯著提高，同時(shí)還可顯著的增加土壤氮素含量及迅速降低土壤的含磷量。本研究研究結(jié)果與前人基本一致，表明根瘤菌可促進(jìn)花櫚木苗木的生長，提高葉綠素含量，同時(shí)提高植物氮含量。

本研究中僅對(duì)根瘤菌的溶磷性能進(jìn)行了測定，未對(duì)其溶磷的機(jī)理及施用后土壤中的磷元素的變化情況進(jìn)行探討，存在一定的局限性，后續(xù)可以對(duì)相關(guān)問題進(jìn)行深入研究。同時(shí)本研究在接種根瘤菌時(shí)只采用了一種接種方式，有研究表明不同的接種方式對(duì)花櫚木結(jié)瘤具有顯著的差異[8]，因此還可以繼續(xù)研究不同接種方式對(duì)花櫚木結(jié)瘤及生長的影響。