馬春梅，王 晶，夏 玄，王 暢，呂曉晨，李 莎,2，程 娟，龔振平*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆是重要的糧油兼用作物，其根瘤中的根瘤菌能夠高效地固定空氣中的氮?dú)猓腋弋a(chǎn)大豆往往有較高的根瘤固氮量[1]。而單純依靠大豆的根瘤固氮無(wú)法達(dá)到大豆高產(chǎn)的目標(biāo)，許多學(xué)者研究表明，適量的施氮能夠提高大豆產(chǎn)量[2-6]，然而施氮卻會(huì)抑制根瘤的生長(zhǎng)及根瘤固氮[7-17]。Gan 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在水培條件下，給大豆分別施加不同濃度的NO3-和NH4+，施用高濃度肥料氮能明顯抑制大豆根瘤數(shù)量、干重及根瘤固氮。作物利用的氮素主要有NO3-和NH4+，而NO3-和NH4+對(duì)根瘤的抑制作用也不盡相同，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為豆科作物根瘤生長(zhǎng)對(duì)NO3-比NH4+更為敏感[7-10]。而Dazzo 等[11]分別用不同濃度的NH4+和NO3-處理三葉草，發(fā)現(xiàn)16 mmol/L 的NO3-與1 mmol/L 的NH4+對(duì)結(jié)瘤的抑制相同，表明結(jié)瘤過(guò)程對(duì)NH4+的敏感性大于對(duì)NO3-的敏感性。Fujikake等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在水培條件下施加NO3-后，大豆根瘤直徑的增長(zhǎng)完全停止，而未加NO3-時(shí)，根瘤的生長(zhǎng)迅速回到原來(lái)的正常速率。由此證明NO3-引起的抑制根瘤的生長(zhǎng)是可逆的。但也有少數(shù)學(xué)者認(rèn)為，施加少量氮會(huì)促進(jìn)結(jié)瘤并提高根瘤固氮酶活性[18,20]。Xia 等[21]利用大豆雙根系統(tǒng)，在砂培條件下，一側(cè)施加高濃度氮，另一側(cè)不施氮，研究發(fā)現(xiàn)施加高濃度氮側(cè)的根瘤量減少，而不施氮側(cè)根瘤量均增加，表明高濃度氮對(duì)根瘤的形成及生長(zhǎng)的抑制作用有局部接觸效應(yīng)。另外，在水培條件下，利用大豆分根系統(tǒng)，一側(cè)施NO3-，另一側(cè)不施氮，研究發(fā)現(xiàn)供氮側(cè)的根瘤生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，當(dāng)供給高濃度的NO3-時(shí)，不施氮側(cè)的根瘤數(shù)量不變但重量減小，這可以解釋為根瘤生長(zhǎng)受到非局部性的抑制[22-23]。Daimon 等[16]則認(rèn)為，長(zhǎng)期施加NO3-，對(duì)花生結(jié)瘤和根瘤活性的抑制作用是系統(tǒng)性的。施氮導(dǎo)致根瘤的系統(tǒng)性抑制的機(jī)制有可能與氮的分配及轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。因此研究氮的分配及轉(zhuǎn)運(yùn)可能為解析根瘤的系統(tǒng)性抑制提供理論參考。Tanaka 等[12]利用大豆分根系統(tǒng)，一側(cè)施15NO3-，一側(cè)不施氮，發(fā)現(xiàn)15N 標(biāo)記出現(xiàn)在不施氮側(cè)的根及根瘤中，說(shuō)明一側(cè)的根吸收的NO3-會(huì)轉(zhuǎn)移到另一側(cè)的根中。Oghoghorie等[24]在水培條件下，將豌豆的根分為上下兩個(gè)部分并且隔開(kāi)，在根的上部施加15N2，發(fā)現(xiàn)除了地上部能檢測(cè)到15N 標(biāo)記，在根的下部及根瘤中也檢測(cè)到了15N 標(biāo)記；同樣在根的上部施加15NO3-，發(fā)現(xiàn)地上部、根的下部及根瘤中均檢測(cè)到了15N 標(biāo)記，表明由根吸收的氮或由根瘤固氮運(yùn)輸?shù)降厣喜康牡貢?huì)有一部分返回到根及根瘤中。

有許多學(xué)者認(rèn)為，作物體內(nèi)除了會(huì)發(fā)生碳的循環(huán)[25]，也會(huì)發(fā)生氮的循環(huán)，即氮的分配與再分配，而對(duì)于氮的轉(zhuǎn)運(yùn)量的研究較少。本試驗(yàn)利用嫁接方法制備出大豆的雙根系統(tǒng)，在砂培條件下施用15N 標(biāo)記NO3-和NH4+，對(duì)R1 期 (始花期) 和R5 期 (始粒期) 的大豆植株干重、氮含量、15N 豐度進(jìn)行測(cè)定與分析，對(duì)大豆不同時(shí)期各組織的氮素來(lái)源 (肥料氮和共生固氮) 進(jìn)行量化，并構(gòu)建了計(jì)算大豆地上部向根及根瘤轉(zhuǎn)移氮量的方法。系統(tǒng)研究了大豆對(duì)不同氮形態(tài)的吸收、分配及再分配特點(diǎn)，為解析肥料氮和根瘤固氮的互作機(jī)制及大豆根瘤形成的系統(tǒng)性調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016 年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)進(jìn)行，在砂培條件下，利用嫁接方法制備出雙根大豆植株，并施用15N 標(biāo)記的NO3-和NH4+為氮源進(jìn)行研究。15NO3-或15NH4+的15N 豐度均為3.63%。

1.1.1 雙根材料制備 選用直徑0.3 m、高0.3 m 的塑料桶，插入與桶內(nèi)部形狀契合的定制PC 塑料板，在塑料桶中間位置用膠固定密封，形成兩個(gè)相等且獨(dú)立的空間，塑料板高度低于桶沿2 cm，在桶底分別鉆1 cm 直徑的排水孔，于桶底每個(gè)圓孔上方放入一塊紗網(wǎng)，防止江砂堵塞圓孔，再將洗凈的江砂裝入桶中，總裝砂量為20 kg，用于培養(yǎng)雙根大豆材料。

大豆雙根植株制備方法:參考Xia 等[21]的大豆雙根植株制備方法。將大豆 (品種為‘墾豐16’) 種子播于細(xì)砂中，播深2 cm，置于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3 天，當(dāng)大豆子葉著生處至根尖長(zhǎng)約7～10 cm 時(shí)，用蒸餾水沖出幼苗根系，取大豆幼苗用滅菌刀片在兩株幼苗胚軸中間偏上的位置，向上或向下劃0.5～1.0 cm 長(zhǎng)切口 (不切斷)，一個(gè)大豆幼苗由子葉向根部方向豁開(kāi) (圖1A)，另一個(gè)大豆幼苗由根部向子葉方向豁開(kāi) (圖1B)，然后將兩株幼苗的切口相互插入 (圖1C) 后用嫁接夾夾好，再將兩幼苗的根分別栽植于桶內(nèi)隔板兩側(cè)的細(xì)砂內(nèi)，嫁接部位恰好處于隔板正上方，將嫁接苗放于防雨棚中，一周后去掉嫁接夾，剪掉圖1A 中接口以上部分，只留下接合部位及其下部，使幼苗成為包含兩個(gè)根和一個(gè)地上部的幼苗。圖1D 是取樣時(shí)的雙根大豆植株。

1.1.2 試驗(yàn)處理 試驗(yàn)設(shè)置NO3-和NH4+兩種氮源，供氮濃度均為50 mg/L。試驗(yàn)設(shè)置兩組試驗(yàn):試驗(yàn)Ⅰ中一側(cè)施加15N 標(biāo)記的氮，標(biāo)記為A 側(cè)；另一側(cè)不施加氮，標(biāo)記為B 側(cè)。試驗(yàn)Ⅱ中一側(cè)施加15N 標(biāo)記的氮，標(biāo)記為A 側(cè)；另一側(cè)施加相對(duì)應(yīng)的14N 的氮(A、B 兩側(cè)施相同形態(tài)氮)，標(biāo)記為B 側(cè)。每個(gè)處理5 次重復(fù)，試驗(yàn)處理見(jiàn)表1。

不含氮營(yíng)養(yǎng)液的組成為:KH2PO4136 mg/L、MgSO4240 mg/L、CaCl2220 mg/L、MnCl2·4H2O 4.9 mg/L、H3BO32.86 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、Na2MoO4·H2O 0.03 mg/L、FeSO4·7H2O 5.57 mg/L、Na2EDTA 7.45 mg/L。營(yíng)養(yǎng)液參考Hoagland 等[26]及董守坤等[27]的配制方法，略有改進(jìn)。含NO3-的營(yíng)養(yǎng)液是在上述不含氮營(yíng)養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加KNO3360.7 mg/L，含NH4+的營(yíng)養(yǎng)液是在上述不含氮營(yíng)養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加 (NH4)2SO4235.7 mg/L。

自幼苗對(duì)生真葉完全展開(kāi)前每日澆1 次蒸餾水，每次每側(cè)澆250 mL。對(duì)生真葉完全展開(kāi)后每日澆1 次配制的營(yíng)養(yǎng)液，每次每側(cè)250 mL 對(duì)應(yīng)營(yíng)養(yǎng)液，直至R1 期 (始花期)；R1 期后每日澆2 次配置的營(yíng)養(yǎng)液，早晚各1 次，每次每側(cè)250 mL 對(duì)應(yīng)營(yíng)養(yǎng)液，至R5 期 (始粒期) 試驗(yàn)結(jié)束。當(dāng)大豆對(duì)生真葉完全展開(kāi)時(shí)全部根均接種根瘤菌，其方法是將上年冷凍保存的田間大豆根瘤，清洗研碎后加到營(yíng)養(yǎng)液中，每升營(yíng)養(yǎng)液中約含5 g 根瘤，連續(xù)接種5 天。

圖 1 雙根大豆植株Fig. 1 Soybean plant with dual root systems

表 1 試驗(yàn)處理Table 1 Experiment treatments

1.2 取樣方法

于始花期和始粒期取樣兩次，將植株分為A 根、B 根、A 側(cè)根瘤、B 側(cè)根瘤、莖、葉片、葉柄、莢等部位，105℃殺青30 min 之后，65℃烘干，樣品用于測(cè)定15N 豐度、干重和氮含量等指標(biāo)。

1.3 測(cè)定分析

植株氮含量測(cè)定:以K2SO4和CuSO4為催化劑，濃硫酸消煮后，采用B324 全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定。

15N 豐度測(cè)定:先用凱氏定氮法測(cè)定植株氮含量，然后將凱氏定氮滴定后的樣品溶液濃縮，在冷凍真空條件下與次溴酸鋰反應(yīng)產(chǎn)生氮?dú)猓猛凰乇嚷寿|(zhì)譜儀 (Thermo-Fisher Delta V Advantage IRMS)采用雙路 (DI) 測(cè)量方式測(cè)定15N 豐度。

1.4 相關(guān)計(jì)算

試驗(yàn)采用砂培，沒(méi)有土壤因素，因此植株的兩個(gè)氮素來(lái)源是源于施加15N 標(biāo)記的肥料氮比例，和源于施加14N 肥料氮或根瘤固氮的比例 (后者在試驗(yàn)Ⅰ中為源于根瘤固氮的比例，在試驗(yàn)Ⅱ中為源于施加的14N 肥料氮+根瘤固氮的比例)。

源于15N 標(biāo)記的肥料氮的比例，即:

由公式 (1) 和 (2) 可推導(dǎo)出源于15N 標(biāo)記的肥料氮的比例:

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆對(duì)肥料氮與根瘤固氮的吸收及分配

2.1.1 大豆各組織中15N 豐度變化 表2 是試驗(yàn)Ⅰ和試驗(yàn)Ⅱ雙根大豆植株中各營(yíng)養(yǎng)器官的15N 豐度。試驗(yàn)Ⅰ，大豆植株中氮來(lái)源為A 根吸收的15NO3-或15NH4+、A 側(cè)根瘤固氮、B 側(cè)根瘤固氮。試驗(yàn)Ⅱ，大豆植株中氮來(lái)源為A 根吸收的15NO3-或15NH4+、B 根吸收的14NO3-或14NH4+、A 側(cè)根瘤固氮、B 側(cè)根瘤固氮。

表 2 大豆各組織中15N 豐度 (%)Table 2 15N abundance of the soybean tissues

由表2 可知，NO3-和NH4+兩種氮源的試驗(yàn)Ⅰ在R1 期A 根的15N 豐度為2.21%和2.30%，在R5 期為1.9 7% 和2.2 0%；在R 1 期B 根的15N 豐度為0.97%和0.91%，在R5 期為0.85%和0.84%，15N 豐度均高于自然豐度 (0.365%)，且小于肥料的15N 豐度(3.63%)，表明B 根中的氮除了來(lái)自根瘤固氮外，一定有A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮轉(zhuǎn)移到B 根中。在R1 期的A 側(cè)根瘤的15N 豐度為0.78%和0.80%，在R5 期為0.70%和0.70%；在R1 期的B 側(cè)根瘤的15N 豐度為0.60% 和0.59%，在R5 期為0.53% 和0.53%，15N 豐度均高于自然豐度 (0.365%)，說(shuō)明根瘤的氮除了來(lái)自根瘤固定的氮外，一定有A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮運(yùn)輸?shù)紸 側(cè)及B 側(cè)根瘤中。

在試驗(yàn)Ⅱ中，A 根及根瘤、B 根及根瘤、地上部 (莖、葉片、葉柄、莢) 中的15N 豐度與試驗(yàn)Ⅰ變化規(guī)律基本一致，說(shuō)明兩側(cè)根都施氮的條件下，兩側(cè)根吸收的肥料氮和兩側(cè)根瘤固氮仍然是可以相互轉(zhuǎn)移的。在NO3-和NH4+兩種氮源的試驗(yàn)Ⅱ中，R1 期A 根的15N 豐度為2.10%和2.25%，在R5 期為1.87%和2.18%；R1 期B 根的15N 豐度為0.76%和0.70%，R5 期為0.73%和0.67%。R1 期A 側(cè)根瘤的15N 豐度為0.74%和0.79%，R5 期為0.67%和0.70%，R1 期B 側(cè)根瘤的15N 豐度為0.53% 和0.54%，R5 期為0.51% 和0.51%。R1 和R5 期的莖、葉、葉柄的15N 豐度沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明根系吸收的肥料氮和根瘤固氮對(duì)莖、葉、葉柄三個(gè)部位的營(yíng)養(yǎng)作用相同；地上各部分15N 豐度均高于自然豐度 (0.365%)，且小于施加的肥料氮的15N 豐度 (3.63%)，說(shuō)明A 和B 兩側(cè)根吸收的肥料氮和A 和B 兩側(cè)根瘤固氮都會(huì)按一定的比例運(yùn)輸?shù)降厣喜?。試?yàn)Ⅰ、Ⅱ的R5 期植株各器官的15N 豐度均低于R1 期，說(shuō)明在R5 期根瘤固氮對(duì)植株的貢獻(xiàn)大于R1 期。

2.1.2 大豆植株吸收肥料氮和根瘤固氮比例 由表2中的15N 豐度數(shù)據(jù)，計(jì)算出各器官的氮來(lái)源于15N 和來(lái)源于根瘤固氮或來(lái)源于14N 與根瘤固氮的比例 (表3和表4)。

表 3 試驗(yàn)Ⅰ中大豆各組織中氮來(lái)源于15N 和根瘤固氮的比例 (%)Table 3 Proportions of nitrogen from 15N fertilizer and nodule fixation of soybean tissues in experiment Ⅰ

表 4 試驗(yàn)Ⅱ中大豆各組織中氮來(lái)源于15N 及14N+根瘤固氮的比例 (%)Table 4 Proportions of nitrogen from 15N and 14N+nodule fixation of soybean tissues in experiment Ⅱ

由表3 可知，試驗(yàn)Ⅰ中植株有三個(gè)氮源，分別為A 根吸收的15N 標(biāo)記肥料氮和A 側(cè)根瘤固定的氮及B 側(cè)根瘤固定的氮，但由于A 和B 兩側(cè)根瘤固定的氮無(wú)法區(qū)分，所以表中列出了兩個(gè)來(lái)源，分別為A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮和A、B 兩側(cè)根瘤固定的氮。由表3 可知，NO3-和NH4+兩種氮源的試驗(yàn)Ⅰ在R1 期A 根的氮來(lái)源于A 根吸收肥料氮占56.57%和59.26%，來(lái)自于A 根和B 根的根瘤固氮占43.43%和40.74%，R5 期分別為49.13%、56.29% 和50.87%、43.71%；在R1 期，B 根的氮來(lái)源于A 根吸收肥料氮占18.53% 和16.83%，來(lái)自于A 根和B 根的根瘤固氮占81.47%和83.17%，R5 期分別為14.79%、14.54%和85.21%和85.46%，說(shuō)明施氮的A 根氮大部分來(lái)自A 根吸收的肥料氮，少部分來(lái)自根瘤固氮；不施氮的B 根氮大部分來(lái)自根瘤固氮，少部分來(lái)自A 根吸收的肥料氮。在R1 期，A 側(cè)根瘤的氮來(lái)源于A 根吸收肥料氮占12.81%和13.33%，來(lái)自于A 根和B 根的根瘤固氮為87.19%和86.67%，R5 期分別為10.20%、10.13%和89.80%、89.87%；在R1 期，B 側(cè)根瘤的氮來(lái)源于A 根吸收肥料氮占7.20%和6.89%，來(lái)自于A 根和B 根的根瘤固氮為92.80%和93.11%，R5 期分別為5.17%、5.16%和94.83%、94.84%，說(shuō)明根瘤中的氮絕大多數(shù)來(lái)自根瘤固氮，少部分來(lái)自根系吸收的肥料氮。在R1 期，莖的氮來(lái)源于A 根吸收肥料氮占27.85%和31.11%，來(lái)自于A 根和B 根的根瘤固氮為72.15%和68.89%，葉片是30.69%、29.72%和69.31%、70.28%，葉柄是29.34%、30.30%和70.66%、69.70%。在R5 期，莖是22.17%、25.07%和77.83%、74.93%，葉片是25.70%、23.63% 和74.30%、76.37%，葉柄是27.44%、25.59% 和72.56%、74.41%，莢是20.46%、23.73%和79.54%、76.27%?？梢钥闯銮o、葉片、葉柄三個(gè)部分的氮來(lái)源比例幾乎相同，說(shuō)明根部吸收的肥料氮和根瘤固氮會(huì)按一定的比例運(yùn)輸?shù)降厣喜糠?，且?duì)莖、葉片、葉柄三個(gè)部分幾乎沒(méi)有差異。

試驗(yàn)Ⅱ中有4 個(gè)氮來(lái)源，分別為A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮、A 側(cè)根瘤固氮、B 根吸收的14N 肥料氮、B 側(cè)根瘤固氮，由于A 和B 兩側(cè)根瘤固定的氮和B 根吸收的14N 肥料氮無(wú)法區(qū)分，所以表中列出了2 個(gè)來(lái)源，分別為A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮和B 根吸收的14N 肥料氮及A、B 兩側(cè)根瘤固定的氮(表4)。

由于試驗(yàn)Ⅱ中A 和B 兩側(cè)根施加的肥料氮只有15N 豐度不同，其他均相同，可以認(rèn)為兩側(cè)根及根瘤所處的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境相同，即A 根源于A 側(cè)根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮等于B 根源于B 側(cè)根吸收14N 的肥料氮，B 根源于A 側(cè)根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮 (15N)等于A 根源于B 側(cè)根吸收的14N 肥料氮，A 和B 兩根源于雙側(cè)根瘤固定的氮無(wú)法區(qū)分，因此可以區(qū)分出A 和B 兩根的三個(gè)氮來(lái)源。即A 根氮來(lái)源于三個(gè)部分 (表4):1) A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮比例；2) A 根源于B 根吸收的14N 肥料氮比例等于B 根源于A 根吸收的15N 標(biāo)記分肥料氮比例；3) A 根源于A 和B 兩側(cè)根瘤固氮的比例等于1 減去上面兩個(gè)比例。B 根氮來(lái)源于三個(gè)部分 (表4):1) 源于A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮比例；2)B 根源于B 根吸收的14N 肥料氮比例等于A 根源于A 根吸收的15N 標(biāo)記分肥料氮比例；3)B 根源于A 和B 兩側(cè)根瘤固氮的比例等于1減去上面兩個(gè)比例。同理可知根瘤的三個(gè)氮來(lái)源。

地上部的氮來(lái)源于A 側(cè)根吸收15N 標(biāo)記的肥料氮等于來(lái)源于B 側(cè)根吸收的14N 肥料氮，源于雙側(cè)根瘤固定的氮無(wú)法區(qū)分，也可以區(qū)分出地上部的三個(gè)氮來(lái)源。如以莖為例，1) 莖源于A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮的比例 (表4)；2) 莖源于B 根吸收的14N 肥料氮的比例等于莖源于A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮的比例 (表4)；3) 莖源于A 和B 兩側(cè)根瘤固氮的比例為1 減去上面兩個(gè)比例。由此可計(jì)算出A 根、B 根、A 側(cè)根瘤、B 側(cè)根瘤、莖、葉片、葉柄、莢的三個(gè)氮素來(lái)源比例 (表5)。

由表5 可知，NO3-和NH4+兩種氮源的試驗(yàn)Ⅱ在R1 期A 根的氮來(lái)源于A 根吸收肥料氮為53.15%和57.70%，來(lái)源于B 根吸收的肥料氮為12.21% 和1 0.4 0%，來(lái)源于A 和B 兩側(cè)根瘤固定的氮為34.64%和31.90%，R5 期分別為45.88%和55.64%、11.31%和9.41%、42.81%和34.95%。進(jìn)一步證明A 根中的氮除了來(lái)自A 根吸收的肥料氮，還有來(lái)自B 根的肥料氮及根瘤固氮。在R1 期，A 側(cè)根瘤的氮來(lái)源于A 根吸收肥料氮為11.64%和13.12%，來(lái)源于B 根吸收的肥料氮為5.00% 和5.30%，來(lái)源于A 根和B 根的根瘤固氮為83.36%和81.58%，R5 期分別為9.2 2% 和1 0.2 2%、4.4 3% 和4.4 5%、86.35%和85.33%。進(jìn)一步證明了根瘤中的氮主要來(lái)自根瘤固氮，有一少部分來(lái)自本根系吸收的肥料氮。在NO3-和NH4+兩種氮源條件下，在R1 期，莖的氮來(lái)源于A 和B 兩根吸收肥料氮的比例為45.80%和61.26%，來(lái)自于A 和B 兩側(cè)根瘤固氮的比例為54.20% 和38.74%，葉片是43.36%、58.30% 和56.64%、41.70%，葉柄是48.86%、53.18% 和5 1.1 4%、4 6.8 2%。在R 5 期，莖是4 3.9 0%、46.58% 和56.10%、53.42%，葉片是42.00%、44.72% 和58.00%、55.28%，葉柄是46.96%、47.54% 和53.04%、52.46%，莢是36.44%、43.84%和63.56%、56.16%。

表 5 試驗(yàn)Ⅱ中大豆各組織中氮來(lái)源于15N、14N、根瘤固氮的比例 (%)Table 5 Proportions of nitrogen from 15N, 14N and nodule fixation of soybean tissues in experiment Ⅱ

2.2 大豆始花期～始粒期地上部向根及根瘤的氮轉(zhuǎn)移量

由表3、表4 可知，雙根系統(tǒng)中兩個(gè)根系吸收的氮可通過(guò)地上部相互轉(zhuǎn)移，但這種轉(zhuǎn)運(yùn)不是簡(jiǎn)單的過(guò)程，而是反映地上與根系和根瘤的相關(guān)性。試驗(yàn)中大豆植株各部15N 豐度不同 (表2)，將B 根和地上部看做一個(gè)系統(tǒng)，對(duì)B 根而言，地上部是其15N 供給源，R1～R5 期，B 根增加的15N 量可以用R5 期積累的15N 量減去R1 期積累的15N 量求得，其應(yīng)等于R1～R5 期由地上部轉(zhuǎn)移下來(lái)的15N 量，加上R1～R5期B 根自身吸收自然豐度的15N 量 (試驗(yàn)Ⅰ為根瘤固氮，試驗(yàn)Ⅱ?yàn)楦龉痰虰 根吸收的14N 肥料氮) 之和。設(shè)定從地上部轉(zhuǎn)運(yùn)到B 根的氮量為NT，地上部向下轉(zhuǎn)移氮的15N 豐度用R1 期和R5 期地上部15N 豐度的平均值來(lái)計(jì)算，則NT× (f地上部R1+f地上部R5)/2 代表R1 期到R5 期從地上部轉(zhuǎn)移到B 根的15N 量；NR5-NR1為R1 期到R5 期B 根的氮積累量，NR5-NR1-NT為R1 期到R5 期來(lái)自B 根吸收的氮積累量 (包括根瘤供給的)，其乘上15N 自然豐度f(wàn)自，即 (NR5-NR1-NT) ×f自代表R1 期到R5 期B 根吸收的及根瘤供給的15N 量；NR5× fR5為R5 期B 根全部15N 量，NR1×fR1為R1 期B 根全部15N 量。地上部轉(zhuǎn)移到B 側(cè)根瘤的氮量也可用此方法計(jì)算出來(lái)。對(duì)于試驗(yàn)Ⅱ，則NT×(f地上部R1+f地上部R5)/2+(NR5-NR1-NT) × f自= NR5× fR5-NR1×fR1，即，

式中，fR1、fR5為B 根或B 側(cè)根瘤在R1 期、R5 期的15N 豐度 (表1)，f地上部R1、f地上部R5為地上部R1 期、R5 期的莖、葉片、葉柄、莢的15N 豐度 (表1) 的平均值，f自為自然豐度 (0.365%)，NR1、NR5為B 根或B 側(cè)根瘤R1 期、R5 期氮積累量。試驗(yàn)中參數(shù)取值見(jiàn)表6。

由 (4) 式結(jié)合表6 可以計(jì)算出地上部轉(zhuǎn)移到B 根及B 根瘤的氮量，在試驗(yàn)Ⅱ中，由于雙側(cè)均施加相同濃度相同形態(tài)的氮，僅標(biāo)記不同，認(rèn)為地上部向A 和B 兩側(cè)的根及根瘤轉(zhuǎn)移的氮量相同，試驗(yàn)Ⅱ在R1～R5 期地上部向根及根瘤的氮轉(zhuǎn)移量和比例見(jiàn)表7。

NO3-和NH4+兩種氮源處理下，在R1～R5 期A 根或B 根增加的氮積累量為15.7 mg/株和19.7 mg/株，R1～R5 期從地上部轉(zhuǎn)移到A 根或B 根的氮積累量為6.4 mg/株和5.6 mg/株，占A 根或B 根增加的氮積累量的40.8%和28.4%。R1～R5 期A 側(cè)根瘤或B 側(cè)根瘤增加的氮積累量為20.3 mg/株和18.8 mg/株，R1～R5 期從地上部轉(zhuǎn)移到A 側(cè)根瘤或B 側(cè)根瘤的氮積累量為3.5 mg/株和2.7 mg/株，占A 根瘤或B 根瘤增加的氮積累量的17.2%和14.4%。

表 6 B 根、B 根瘤及地上部始花期 (R1) 和始粒期 (R5) 的15N 豐度及氮積累量Table 6 15N abundance and N accumulation of root B, nodule B and shoot at initial flowering (R1)and initial seeding (R5) stage

表 7 始花期 (R1) ～始粒期 (R5) 地上部向根及根瘤的氮轉(zhuǎn)移量和比例Table 7 Amount and proportion of N periodically transferred from shoot to root and nodule from initial flowering (R1) to initial seeding (R5) stage

3 討論

3.1 大豆各器官的氮素來(lái)源

大山卓爾等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，給大豆供給15NO3-，一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)15N 標(biāo)記出現(xiàn)在根瘤中，說(shuō)明硝態(tài)氮可供大豆根瘤生長(zhǎng)，尤其是在根瘤生長(zhǎng)初期，其利用率是較高的。Sato 等[30]向培養(yǎng)大豆的營(yíng)養(yǎng)液中加入13NO3-，發(fā)現(xiàn)13N 標(biāo)記的NO3-首先出現(xiàn)在大豆葉柄中，接著是葉片中，而在根瘤中很少，說(shuō)明根吸收的NO3-在短時(shí)間內(nèi)沒(méi)有轉(zhuǎn)移到根瘤中。本研究中試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ是一側(cè)施15N 標(biāo)記的肥料氮，而在沒(méi)有施氮或施沒(méi)有15N 標(biāo)記肥料氮的另一側(cè)根瘤15N 豐度高于自然豐度，結(jié)合Sato 等[30]的試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明一定有15N 標(biāo)記的肥料氮運(yùn)輸?shù)絻蓚?cè)根瘤中，即根瘤中來(lái)自根系吸收的氮素主要是由地上部轉(zhuǎn)移下來(lái)的。試驗(yàn)Ⅰ和試驗(yàn)Ⅱ中兩側(cè)根瘤的15N 豐度均高于氮的自然豐度 (0.365%)，說(shuō)明根瘤生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所需要的氮不是全部都來(lái)自自身固氮，也有一部分來(lái)自根系吸收的肥料氮。且A 側(cè)根瘤的15N 豐度顯著高于B 側(cè)根瘤，說(shuō)明A 側(cè)根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮供應(yīng)A 側(cè)根瘤的量多于B 側(cè)根瘤。

Wery 等[31]對(duì)苜蓿進(jìn)行供硝酸銨與不施氮的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者在氮積累量上沒(méi)有顯著性差異，但是在供氮條件下根瘤固氮率下降了，而吸收的氮素增加了，說(shuō)明在有化合態(tài)氮和N2同時(shí)存在的情況下，苜蓿會(huì)優(yōu)先選擇化合態(tài)氮。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅰ為單側(cè)供氮，試驗(yàn)Ⅱ?yàn)殡p側(cè)供氮，對(duì)比試驗(yàn)Ⅰ和試驗(yàn)Ⅱ中植株各部位來(lái)源于肥料氮和根瘤固氮的比例，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)Ⅱ中植株各部位來(lái)源于根瘤固氮的比例均小于試驗(yàn)Ⅰ，即根瘤固氮率明顯下降，這表明在適當(dāng)增加肥料氮時(shí)，大豆植株優(yōu)先吸收利用肥料氮。

對(duì)于銨態(tài)氮和硝態(tài)氮兩種氮素對(duì)氮的吸收及分配的影響說(shuō)法不一。一些學(xué)者在大豆和玉米的大田試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是NO3-還是NH4+，使用單一氮源植株的長(zhǎng)勢(shì)均不如NH4+和NO3-混合[32-33]。Chaillou等[34]在水培條件下，利用大豆分根系統(tǒng)，一側(cè)施加NH4+，一側(cè)施加NO3-，研究發(fā)現(xiàn)施加NO3-側(cè)的根干重大于NH4+側(cè)的根干重。而Gan 等[18]給大豆分別施加NH4+和NO3-，研究發(fā)現(xiàn)施用NH4+比施用NO3-的大豆具有更高生物積累量、根瘤干重、總氮積累量和固氮量。本試驗(yàn)的試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ的NO3-或NH4+處理對(duì)比，各器官15N 豐度均沒(méi)有顯著性差異，可能是由于一些細(xì)菌的存在將NH4+轉(zhuǎn)化為NO3-，但從其表現(xiàn)來(lái)看，施NO3-或NH4+并沒(méi)有影響大豆植株對(duì)氮的吸收及分配，說(shuō)明在50 mg/L 的氮濃度下，NO3-和NH4+影響大豆對(duì)氮吸收和分配的作用幾乎相同。

3.2 大豆地上部與根系、根瘤的氮分配與再分配

Oghoghorie 等[24]給豌豆葉面施加15NO3-，發(fā)現(xiàn)在地上部、根和根瘤中均檢測(cè)到了15N 標(biāo)記，說(shuō)明葉片中的氮會(huì)發(fā)生向下的運(yùn)輸，運(yùn)輸?shù)搅烁案鲋?。Ito 等[35]用15NO3-或15NH4+處理向日葵葉片，在施氮葉片的上下節(jié)間都測(cè)到了15N，而且上節(jié)間的15N 豐度小于下節(jié)間，表明施加在葉片上的氮可以發(fā)生向上運(yùn)輸?shù)耐瑫r(shí)也可以發(fā)生向下的運(yùn)輸，即地上部的氮會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)到根及根瘤中。Reynolds 等[36]在水培條件下，利用大豆分根系統(tǒng)，一側(cè)施13NH4+，一側(cè)不施氮，發(fā)現(xiàn)13N 先出現(xiàn)在地上部，隨后出現(xiàn)在未供氮一側(cè)的根中，說(shuō)明根部吸收的氮會(huì)運(yùn)輸?shù)降厣喜糠?，隨后再運(yùn)輸回根部。本研究的試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ中地上部、A 和B 兩側(cè)根、A 和B 兩側(cè)根瘤的15N 豐度均高于氮的自然豐度 (0.365%)，且小于施加的肥料氮的15N 豐度(3.63%)，表明A 和B 兩側(cè)根部吸收的肥料氮和A 和B 兩側(cè)根瘤固氮都會(huì)按一定的比例運(yùn)輸?shù)降厣喜?；一定有A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮轉(zhuǎn)移到B 根中；也一定有A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮運(yùn)輸?shù)絻蓚?cè)根瘤中，由于試驗(yàn)Ⅱ中雙側(cè)根都處于50 mg/L 的相同氮素溶液中，且均有根瘤的存在，可以認(rèn)為兩側(cè)根及根瘤所處的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)相同，因此試驗(yàn)Ⅱ中A 根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮會(huì)轉(zhuǎn)移到B 根中，同理可知，B 根吸收的14N 的肥料氮也會(huì)轉(zhuǎn)移到A 根中；A 側(cè)根吸收的15N 標(biāo)記的肥料氮會(huì)運(yùn)輸?shù)絻蓚?cè)根瘤中，同理可知，B 側(cè)根吸收的14N 的肥料氮也會(huì)運(yùn)輸?shù)絻蓚?cè)根瘤中。綜上所述，根吸收的肥料氮和根瘤固氮會(huì)以一定的比例運(yùn)輸?shù)降厣喜浚S后會(huì)再次重新分配回根及根瘤中。

為估算地上部向根及根瘤轉(zhuǎn)運(yùn)的氮量及占根和根瘤氮的比例，本試驗(yàn)將大豆雙根系統(tǒng)中地上部和未施15N 標(biāo)記肥料氮的一側(cè)根及根瘤看成一個(gè)氮轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，利用15N 豐度的差異，構(gòu)建了R1～R5 期地上部向根及根瘤轉(zhuǎn)移氮量的計(jì)算方法。在試驗(yàn)Ⅱ中，利用公式 (1) 計(jì)算得出，在NO3-和NH4+兩種氮源下，R1-R5 期A 根或B 根來(lái)自地上部轉(zhuǎn)移的氮為5.6～6.4 mg/株，占R1～R5 期A 根或B 根氮積累量的28.4%～40.8%；R1～R5 期A 側(cè)根瘤或B 側(cè)根瘤來(lái)自地上部的氮為2.7～3.5 mg/株，占R1～R5 期A 側(cè)根瘤或B 側(cè)根瘤氮積累量的14.4%～17.2%。地上部向根及根瘤中轉(zhuǎn)運(yùn)的氮，是以何種形態(tài)和通過(guò)什么部位運(yùn)輸?shù)?，以及其生理作用如何還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1) 根瘤生長(zhǎng)所需要的氮來(lái)源包括自身根瘤固氮和根系吸收的外源氮，且大豆植株優(yōu)先吸收外源氮。不論供應(yīng)NO3-還是NH4+，在N 50 mg/L 濃度下，大豆氮的吸收和分配不受氮形態(tài)的影響。

2) 大豆根系吸收的肥料氮以及根瘤固氮運(yùn)輸?shù)降厣喜亢?，?huì)再次重新分配回根及根瘤中。將大豆雙根系統(tǒng)中地上部和施14N 肥料氮的一側(cè)根及根瘤看成一個(gè)氮轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，利用15N 豐度的差異，構(gòu)建了R1～R5 期地上部向根及根瘤轉(zhuǎn)移氮量的計(jì)算方法。經(jīng)計(jì)算表明，當(dāng)施氮濃度為50 mg/L 時(shí)，R1～R5 期(始花期～始粒期) 根來(lái)自地上部轉(zhuǎn)移的氮占根部氮素積累量的28.4%～40.8%，根瘤來(lái)自地上部轉(zhuǎn)移的氮占其氮素積累量的14.4%～17.2%。