魏騰超 王真真 孫樂樂 付希安 陳聲利 王建文 張福仁 劉 紅

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院)，山東省皮膚病性病防治研究所，山東濟(jì)南，250022

汗孔角化癥(porokeratosis, PK)是一組罕見的、具有遺傳異質(zhì)性的角質(zhì)形成細(xì)胞克隆異常性皮膚病。目前，已發(fā)現(xiàn)7個基因與PK發(fā)病密切相關(guān)，包括甲羥戊酸代謝通路中的4個基因(MVK、PMVK、MVD、FDPS)和另外3個基因(SSH1、SART3、 SLC17A9)[1-6]。2015年，Zhang等[3]報道MVK、PMVK、MVD、FDPS 可以解釋98%家系及73%散發(fā)患者的發(fā)病風(fēng)險。2019年本課題組對137例PK患者進(jìn)行甲羥戊酸通路上的全部12個基因和另外3個PK致病基因(SSH1、SART3和SLC17A9)的外顯子區(qū)域進(jìn)行高通量測序，共檢測到108例在5個基因(MVK、PMVK 、MVD、FDPS和SLC17A9)上攜帶有害突變，其余29例患者未檢測到相關(guān)突變[7]，患者的突變攜帶率為78.8%。未檢測到突變位點的家系，推測原因為：(1)由于引物設(shè)計等目標(biāo)區(qū)域測序可能導(dǎo)致遺漏剪切區(qū)域的突變位點；(2)另有報道4%的PK患者發(fā)病是由拷貝數(shù)變異(CNV) 導(dǎo)致的[3]，此類變異目標(biāo)區(qū)域測序也無法檢出；(3)存在體細(xì)胞突變的可能；(4)存在未知的新的基因。2019年Atzmony和Kubo先后發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞突變與線狀汗孔角化癥(LP)、光照播散型汗孔角化癥(DSAP)的關(guān)聯(lián)，患者同時攜帶不同的體細(xì)胞突變[8，9]。本研究對課題組在已知基因上未發(fā)現(xiàn)有害突變的29例患者進(jìn)行外周血DNA全外顯子組測序(WES)和體細(xì)胞DNA Sanger測序，尋找是否存在目標(biāo)區(qū)域測序遺漏的已知致病基因上的突變、CNV、體細(xì)胞突變，通過全血DNA全外顯子組測序?qū)ふ沂欠裼行碌腜K致病基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取上述29例(3個家系，26例散發(fā)) 患者，年齡5～73歲，診斷均經(jīng)我院臨床及病理組織檢查確診為汗孔角化癥。部分患者皮損見圖1?；颊吆炇鹬橥鈺?，收集病史資料及庫存外周血并切取病理組織蠟塊，該研究通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 從-80℃超低溫冰箱取出外周血5 mL，使用TIANamp Blood DNA Kit DP318-02(天根血液基因組DNA提取試劑盒) 按照說明提取外周血基因組DNA。從我院病理科切取患者病理組織蠟塊，厚度6～8 μm每片，每人切取10片。使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，按照Qiagen官網(wǎng)步驟提取體細(xì)胞基因組DNA。

1.2.2 全外顯子組測序 使用超微分光光度計Nanodrop 8000檢測上述外周血DNA樣品的質(zhì)量和純度，使用Biorupter核酸剪切儀獲得150～200 bp大小片段，使用AIExome Enrichment Kit V4試劑盒[艾吉泰康生物科技(北京)有限公司]進(jìn)行富集，采用Illumina NovaSeq 6000平臺進(jìn)行大規(guī)模并行高通量測序。使用FastQC v0.11.8軟件檢查原始測序數(shù)據(jù)的基本質(zhì)量。然后利用Trimmonmatic v0.38軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪和過濾。使用BWA v0.7.17比對工具將得到的過濾后的數(shù)據(jù)映射到人類基因組參考(hg19版本)，然后利用GATK v4.0.12.0軟件并按照其最佳操作流程(the best practices ) 得到所有變異位點。

以200名正常人的數(shù)據(jù)構(gòu)建CNV分析基線，使用CNVKit和Adtex軟件以基線為參考對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行分析。

1.2.3 Sanger測序 在基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站http://asia.ensembl.org/index.html找到Grch37版本下載基因序列，進(jìn)入NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST進(jìn)行引物設(shè)計，分別獲取外顯子的跨側(cè)翼的上下游引物序列。并采用溫度梯度法探索每一對引物的最佳退火溫度。PCR反應(yīng)在9700型PCR擴增儀(美國ABI公司)上完成，PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳儀進(jìn)行電泳，切取熒光條帶凝膠并回收后，使用醋酸鈉乙醇沉淀法純化PCR產(chǎn)物。對于組織DNA質(zhì)量不佳或存在DNA斷裂的，采用二次PCR方法：以PCR產(chǎn)物為模板重復(fù)上述步驟一次。最后在ABI 3500XL遺傳分析儀(美國ABI公司) 直接測序。

1.2.4 突變注釋 首先，我們基于hg19參考基因組用ANNOVAR軟件對所有變異位點進(jìn)行注釋。去除在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫以及gnomAD數(shù)據(jù)庫中次等位基因頻率>0.01%的位點后，滿足下面任一條件的變異位點被認(rèn)為是有害的：(1)SIFT評分<0.025且Polyphen-2評分>0.95的錯義突變位點；(2)無義突變、移碼突變；(3)剪切位點突變且dbscSNV評分>0.6的變異；(4)在基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)中被定義為有害突變(DM)的位點。

2 結(jié)果

2.1 外周血DNA 全外顯子組測序結(jié)果 28例患者(1例DNA質(zhì)檢不合格)中，有3例患者(F1，S1，S2)在已知基因上發(fā)現(xiàn)致病突變，F(xiàn)1、S2攜帶MVD: c.70+5 G>A突變，S1攜帶MVK:c.371+5 G>A突變，MVD上的突變已被報道[8]，MVK上的突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)突變位點。剩下的25例患者未在已知基因上發(fā)現(xiàn)致病突變或CNV變異。

攜帶突變的3例患者均為DSAP分型，并通過Sanger測序排除假陽性(圖2) 。

2.2 組織DNA Sanger測序結(jié)果 成功提取了16例患者的組織DNA(表1)。16例患者中6例(S2、S3、S4、S5、S6、S7)檢出致病突變，10例未檢出致病突變。6例突變中S7為WES攜帶突變的患者，組織DNA與外周血DNA攜帶相同突變位點。另外5例突變位于MVD、MVK、PMVK基因上(突變位點均已報道)，Sanger測序驗證生殖細(xì)胞相應(yīng)位點均未發(fā)生突變，證實患者僅為體細(xì)胞突變(圖3)。

圖1 面頸部、前胸、后背見環(huán)形小丘疹，中央萎縮，邊緣隆起，邊界清晰

2a:MVD c.70+5 G>A;2b:MVK: c.371+5 G>A;2c:MVD c.70+5 G>A

3a：PMVK c.412 C>T無義突變;3b：MVK c.467 C>A 錯義突變;3c：MVD c.746 T >C錯義突變

表1 28個樣本實驗結(jié)果

3 討論

汗孔角化癥遺傳模式主要表現(xiàn)為單基因常染色體顯性遺傳，但其外顯不完全，也有部分無遺傳史的散發(fā)病例。 2015年Zhang等[3]對134例PK患者的外周血DNA進(jìn)行突變檢測，發(fā)現(xiàn)位于甲羥戊酸通路上的4個基因(MVK、PMVK、MVD、FDPS)與PK發(fā)病的關(guān)聯(lián)， 98%家系及73%散發(fā)患者至少存在1個基因突變，未發(fā)現(xiàn)突變的患者4%存在CNV變異。同時發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞中存在野生等位基因表達(dá)失衡(AEI)現(xiàn)象。2019年Atzmony和Kubo等[8，9]發(fā)現(xiàn)LP、DSAP患者生殖系突變基礎(chǔ)上，體細(xì)胞遭受“二次打擊”導(dǎo)致基因突變或雜合性缺失(CN-LOH)。這表明胚胎期基因突變和出生后外界環(huán)境的“二次打擊”的累加效應(yīng)會導(dǎo)致LP和DSAP發(fā)病。

本研究通過WES技術(shù)，在外周血DNA中鑒定了目標(biāo)區(qū)域測序遺漏的2個已報道剪切位點突變和1個新的剪切位點突變MVK: c.371+5 G>A，dbscSNV[10]得分0.97，預(yù)測為有害突變。

最近Atzmony等[8]報道了3例LP患者同時存在生殖系和體細(xì)胞突變，1/3病例為體細(xì)胞雜合缺失，Kubo等[9]報道2例LP和7例DSAP患者同時存在生殖系和體細(xì)胞突變，8/9患者存在體細(xì)胞雜合缺失現(xiàn)象。Saleva-Stateva等[11]在6例散發(fā)LP患者中發(fā)現(xiàn)生殖系和體細(xì)胞突變，5/6患者存在體細(xì)胞雜合缺失現(xiàn)象。以上報道病例疾病分型為DSAP或LP，突變基因涉及MVD、PMVK和 MVK，后天的“二次基因突變”是DSAP和LP發(fā)生的基礎(chǔ)[12，13]，LP的二次突變通常發(fā)生在生殖細(xì)胞，因此臨床上發(fā)病相對較早，DSAP的二次突變發(fā)生在體細(xì)胞，可以為同源重組或紫外線導(dǎo)致的點突變，臨床發(fā)病相對LP較晚。在Kubo的報道中，一例DSAP患者的體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多達(dá)5種突變形式，提示DSAP患者可能經(jīng)受多次體細(xì)胞突變事件。Kubo根據(jù)Knudson’s“二次打擊”假說[14]把DSAP描述為表皮內(nèi)良性腫瘤。本研究在進(jìn)行體細(xì)胞DNA測序時，由于試劑盒提取體細(xì)胞基因組DNA的洗脫體積為60 μL，且質(zhì)量不佳，不滿足WES測序要求，因此采用Sanger測序。限于DNA洗脫體積，選取相對熱點的突變基因MVK、MVD、PMVK[8，9]進(jìn)行測序，最終鑒定了5例已報道突變。5例患者均為散發(fā)病例，其中4例為DSAP分型、1例DSP分型，表現(xiàn)出DSAP分型和后天體細(xì)胞突變的關(guān)聯(lián)性[9]。有1例患兒發(fā)病年齡早，考慮與MVD和MVK均突變有關(guān)。5例患者僅檢出體細(xì)胞突變，患者可能遭受二次甚至多次體細(xì)胞突變致病，包括Sanger測序難以分辨的體細(xì)胞純合突變或其他突變形式。

編號F2、S18～S26的患者，病理組織存放時間過長，提取到的DNA無法滿足測序要求，因此未進(jìn)行Sanger測序。通過WES和體細(xì)胞檢測未發(fā)現(xiàn)突變的患者均為散發(fā)患者，可能的解釋：(1)這些患者可能存在現(xiàn)有突變篩查方法無法檢測到的突變形式。雖然WES有幫助，但有些突變可能很難通過這種方法檢測出來，如非編碼區(qū)的突變[15]和雜合的大面積缺失、插入或復(fù)制[16]。同時由于Sanger測序的局限性，不能排除患者存在其他體細(xì)胞突變或其他突變形式。(2)這些患者可能是無突變的免疫抑制引起的PK，有學(xué)者認(rèn)為該病是一種具有遺傳性的皮膚特異性自身炎癥性疾病，與免疫抑制有關(guān)[17]。(3)研究中采用二次PCR擴增方法，可能使DNA被稀釋，導(dǎo)致檢測突變遺漏。

基因突變按照突變部位可分為生殖系突變和體細(xì)胞突變，生殖系突變遺傳給后代，而體細(xì)胞突變不會。因此建議對PK患者進(jìn)行跨側(cè)翼序列的基因突變檢測[18]。對于未發(fā)現(xiàn)生殖系突變的患者，可進(jìn)行體細(xì)胞突變檢測，為遺傳咨詢提供更準(zhǔn)確的建議。