王一愷

（上?？迫A生物工程股份有限公司，上海 200233）

雌二醇（Estradiol，E2）屬于甾醇類性激素，是反映人體健康的重要指標(biāo)。目前，酶聯(lián)免疫檢測是應(yīng)用較為廣泛的雌二醇含量測定方法，具有便捷、快速、成本低廉的優(yōu)勢。天然雌二醇分子本身不含有可直接用于偶聯(lián)的官能團(tuán)，目前雌二醇免疫原及酶標(biāo)抗原的制備均是將雌二醇衍生物與相應(yīng)的載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，再采用競爭法測得樣本中雌二醇含量[1-2]。雌二醇化學(xué)發(fā)光法檢測診斷試劑盒用原料雌二醇偶聯(lián)堿性磷酸酶（E2-AP）的普遍制備工藝是混合酸酐法[3]，該工藝是用氯甲酸乙酯與三乙基胺活化E2衍生物使其形成酸酐，而后與堿性磷酸酶反應(yīng)形成酶結(jié)合產(chǎn)物。但是，其成酐副產(chǎn)物較多，并且隨著反應(yīng)時間延長而增多。而且偶聯(lián)物在化學(xué)發(fā)光檢測中的穩(wěn)定性與檢測值的相關(guān)性較差，制備過程中涉及到的化學(xué)試劑毒性較大。因此本文采用碳二亞胺法的偶聯(lián)工藝制備E2-AP，以期能解決上述問題。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 混合酸酐法

混合酸酐法是利用氯甲酸乙酯與三乙基胺活化E2衍生物使其形成酸酐，而后與堿性磷酸酶的游離氨基反應(yīng)形成酶結(jié)合產(chǎn)物，反應(yīng)原理如圖1所示。但是，其偶聯(lián)物的穩(wěn)定性與檢測值的相關(guān)性較差，并且制備過程中涉及的化學(xué)試劑毒性較大。

圖1 混合酸酐法反應(yīng)原理

1.2 碳二亞胺法（不加NHS）

碳二亞胺法（不加NHS）是利用碳二亞胺試劑EDC活化E2-3-CME的羧基端，再與堿性磷酸酶上的游離氨基反應(yīng)生成酶結(jié)合產(chǎn)物[4-5]，反應(yīng)過程如圖2所示。

圖2 碳二亞胺法（不加NHS）反應(yīng)原理

1.3 碳二亞胺法（加NHS）

碳二亞胺法（加NHS）是利用碳二亞胺試劑EDC活化E2-3-CME的羧基端，然后加入NHS加速活化效率，再與堿性磷酸酶上的游離氨基反應(yīng)生成酶結(jié)合產(chǎn)物。反應(yīng)過程如圖3所示。

圖3 碳二亞胺法（加NHS）反應(yīng)原理

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

氯甲酸乙酯（ECF），純度≥96%，國藥集團(tuán)；三乙基胺（TEA），純度≥99%，Sigma；無水二氧六環(huán)（DIO），純度≥99%，Sigma；Estradiol 3-CME（E2-3-CME），純度≥99%，F(xiàn)itzgerald；堿性磷酸酶（少糖基）（AP），純度≥95%，Roche；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），純度≥99%，Sigma；二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），純度≥99%，Sigma；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），純度≥99%，賽默飛；二甲基甲酰胺（DMF），純度≥99.8%，Sigma；氯化鈉，純度≥99%，太倉美達(dá)試劑；磷酸氫二鈉，純度≥99%，太倉美達(dá)試劑；磷酸二氫鈉，純度≥99%，太倉美達(dá)試劑；硼酸鈉，純度≥99%，國藥集團(tuán)；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris），純度≥99%，Amresco。

2.2 儀器與設(shè)備

SRT-202滾軸，海門其林貝爾儀器制造有限公司；GL-88B旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；Finnptpette移液器，賽默飛；BioLogic LP純化儀，BIO-RAD；G25脫鹽柱，GE Healthcare；卓越C1800化學(xué)發(fā)光儀，上?？迫A生物工程股份有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 混合酸酐法制備酶結(jié)合物

2.3.1.1 制備流程

（1）稱取E2-3-CME 3 mg，用DIO 50 μL溶解，配制成60 mg/mL的樣品溶液。（2）量取138 μL TEA，加入872 μL DIO，混合均勻，配制成1 mol/L的溶液。（3）量取87 μL ECF，加入872 μL DIO，混合均勻，配制成1 mol/L的溶液。（4）活化。從（1）中取出50 μL，再從（2）和（3）中各取出10 μL加入其中。（5）室溫滾軸反應(yīng)30 min。（6）偶聯(lián)。取AP脫鹽至硼酸緩沖液（pH=9.0）中，按照E2∶AP =10∶1（摩爾比）加入活化E2，室溫避光反應(yīng)2 h。（7）將偶聯(lián)物脫鹽至Tris緩沖液（pH=7.4）中，加入等體積甘油-20 ℃保存。

2.3.1.2 在37 ℃的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制E2-AP稀釋液至0.5 μg/mL，取一半于37 ℃放置7 d，另一半于4 ℃放置。配制校準(zhǔn)品濃度為0 pg/mL、50 pg/mL、250 pg/mL、500 pg/mL、1 000 pg/mL和4 500 pg/mL，依次編號為S1～S6，抗雌二醇單抗-磁微粒包被稀釋液至0.5 mg/mL。按照順序放置試劑及樣品至全自動化學(xué)發(fā)光儀中檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.3.1.3 與羅氏對比相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

配制E2-AP稀釋液至0.5 μg/mL，取一半于37 ℃放置7 d，另一半4 ℃放置。配制48個樣品液及抗雌二醇單抗-磁微粒包被稀釋液至0.5 mg/mL。按照順序放置試劑及樣品至全自動化學(xué)發(fā)光儀中檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.3.2 碳二亞胺法制備酶結(jié)合物

2.3.2.1 制備流程

（1）稱取E2-3-CME 2 mg，用DMF 200 μL溶解，配制成10 mg/mL的樣品溶液。（2）稱取EDC 10 mg，用DMF 0.5 mL溶解，配制成20 mg/mL。（3）活化。向樣品溶液中加入EDC溶液58 μL，反應(yīng)摩爾比為1∶1。（4）室溫滾軸反應(yīng)30 min。（5）催化。再向E2活化液中加入16 μL的NHS溶液（10 mg/mL），使之反應(yīng)終濃度為5 mmol/L。碳二亞胺法（不加NHS）處理沒有此步驟。（6）室溫滾軸再反應(yīng)30 min。（7）偶聯(lián)。取AP脫鹽至磷酸緩沖液（pH=7.4）中，按照E2∶AP =10∶1（摩爾比）加入活化E2，室溫避光反應(yīng)2 h。（8）將偶聯(lián)物脫鹽至pH=7.4的Tris緩沖液中，加入等體積甘油于-20 ℃保存。

2.3.2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)

配制加NHS與不加NHS的E2-AP稀釋液至0.5 μg/mL。配制校準(zhǔn)品濃度為0 pg/mL、50 pg/mL、250 pg/mL、500 pg/mL、1 000 pg/mL 和 4 500 pg/mL，抗雌二醇單抗-磁微粒包被稀釋液至0.5 mg/mL。按照順序放置試劑及樣品至全自動化學(xué)發(fā)光儀中檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.3.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制E2-AP（加NHS）稀釋液至0.5 μg/mL，取一半于37 ℃放置7 d，另一半于4℃放置。配制校準(zhǔn)品濃度為0 pg/mL、50 pg/mL、250 pg/mL、500 pg/mL、1 000 pg/mL和4 500 pg/mL，抗雌二醇單抗-磁微粒包被稀釋液至0.5 mg/mL。按照順序放置試劑及樣品至全自動化學(xué)發(fā)光儀中檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.3.2.4 相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

配制E2-AP（加NHS與不加NHS）稀釋液各至0.5 μg/mL。配制48個樣品液及抗雌二醇單抗-磁微粒包被稀釋液至0.5 mg/mL。按照順序放置試劑及樣品至全自動化學(xué)發(fā)光儀中檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 混合酸酐法制備酶結(jié)合物在37 ℃的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

從表1可以看出，運(yùn)用混合酸酐法制備的酶結(jié)合物在37 ℃時，穩(wěn)定性快速下降，7 d后只有原來發(fā)光值的50%以下。這可能是因?yàn)榛旌纤狒姆磻?yīng)不僅會使3位上的羧基形成酸酐，還會使17位的羥基形成酸酐，或者酯化反應(yīng)等產(chǎn)生的副產(chǎn)物與AP也能形成偶聯(lián)物，但成酯后的偶聯(lián)物穩(wěn)定性較差，容易水解導(dǎo)致偶聯(lián)物斷裂失活。

表1 不同溫度下E2-AP（0.5 μg/mL）發(fā)光值對比

3.2 混合酸酐法制備的酶結(jié)合物與羅氏對比相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

以48組羅氏測值濃度的樣本所測得酶結(jié)合物在4 ℃與37 ℃的發(fā)光值見表2，圖4、圖5、圖6、圖7分別為表2中4 ℃下羅氏樣本濃度、羅氏樣本濃度歸類的組別與發(fā)光值的相關(guān)性散點(diǎn)圖和37 ℃下羅氏樣本濃度、羅氏樣本濃度歸類的組別與發(fā)光值的相關(guān)性散點(diǎn)圖。從圖4和圖6可以看到，不論是4 ℃還是37 ℃，圖中的點(diǎn)較為零散，說明此法得出的結(jié)果波動大，與羅氏的相關(guān)性相差較大。從圖5和圖7中可以看到，不同組別中的發(fā)光值有交叉，由于理論上在低濃度組別中的發(fā)光值較高，而高濃度組別中發(fā)光值應(yīng)該依次遞減，不應(yīng)該看到不同組別的發(fā)光值有大量交叉的情況，所以此法的相關(guān)性較差。

表2 以48組羅氏測值濃度的樣本所測得酶結(jié)合物在4 ℃與37 ℃的發(fā)光值

續(xù)表2

圖4 4 ℃下表2中羅氏樣本濃度與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖5 4 ℃下表2中羅氏樣本組別與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖6 37 ℃下表2中羅氏樣本濃度與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖7 37 ℃下表2中羅氏樣本組別與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

3.3 碳二亞胺法制備酶結(jié)合物的靈敏度實(shí)驗(yàn)

從表3可以看到，使用碳二亞胺法制備E2-AP的活化過程中加NHS催化的偶聯(lián)效率是不加NHS的20倍，并且也高出使用混合酸酐法偶聯(lián)物活性的2倍以上。

表3 酶結(jié)合物相同工作濃度下加NHS催化與不加NHS的發(fā)光值梯度對比

3.4 碳二亞胺法制備酶結(jié)合物的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

從表4可以看到，碳二亞胺法偶聯(lián)的E2-AP相對較穩(wěn)定，37 ℃下加速破壞實(shí)驗(yàn)后的活性靈敏度只下降了不到15%。碳二亞胺法反應(yīng)的專一性較強(qiáng)，一般只發(fā)生羧基與氨基的酰胺反應(yīng)，不需要產(chǎn)生酸酐作為中間體。而Estradiol 3-CME的羧基只有在3號位有，所以產(chǎn)物的一致性較高。

表4 酶結(jié)合物相同工作濃度下NHS催化的E2-AP在37 ℃加速破壞試驗(yàn)中穩(wěn)定性情況

3.5 碳二亞胺法制備酶結(jié)合物的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

以羅氏測值濃度的樣本所測得加NHS與不加NHS的發(fā)光值見表5，圖8、圖9、圖10及圖11分別為表5中加NHS下羅氏樣本濃度、羅氏樣本濃度歸類的組別與發(fā)光值的相關(guān)性散點(diǎn)圖和不加NHS下羅氏樣本濃度、羅氏樣本濃度歸類的組別與發(fā)光值的相關(guān)性散點(diǎn)圖。

表5 以羅氏測值濃度的樣本所測得加NHS與不加NHS的發(fā)光值

續(xù)表5

圖8 加NHS下表5中羅氏樣本濃度與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖9 加NHS下表5中羅氏樣本組別與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖10 不加NHS下羅氏樣本濃度與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖11 不加NHS下表5中羅氏樣本組別與發(fā)光值相關(guān)性散點(diǎn)圖

從圖8和圖10散點(diǎn)圖中可以看到，不論是加NHS或者不加，圖中的點(diǎn)都較為密集，說明此法得出的結(jié)果波動小，與羅氏的一致性較高。圖9和圖11中一樣可以看到，不同組別中的散點(diǎn)的發(fā)光值交叉少，基本能夠分段，說明與羅氏的一致性較高。使用碳二亞胺法來偶聯(lián)雌二醇與堿性磷酸酶（不論是否使用NHS來催化反應(yīng)）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與羅氏的相關(guān)性都非常高，并且比混合酸酐法好很多。

4 結(jié)論

雌二醇衍生物Estradiol 3-CME與堿性磷酸酶AP的偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)質(zhì)上就是羧基與氨基反應(yīng)形成肽鍵。本文中只探討了碳二亞胺類試劑EDC，諸如碳二亞胺中DCC、DIC等其他試劑及多肽合成中常用的試劑HBTO、HOBT等未進(jìn)行詳細(xì)探討。此外，本文中偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)均采用E2∶AP=10∶1（摩爾比）偶聯(lián)，還可以嘗試選擇其他偶聯(lián)比、緩沖液體系或雌二醇溶劑等反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)產(chǎn)物。

使用混合酸酐法偶聯(lián)雌二醇與堿性磷酸酶所得的酶結(jié)合產(chǎn)物副產(chǎn)物較多，穩(wěn)定性較差，化學(xué)發(fā)光法檢測得到的相關(guān)性也不太理想，最關(guān)鍵的是其制備過程中使用的氯甲酸乙酯等氯甲酸酯類化合物都帶有劇毒，對實(shí)驗(yàn)人員人身安全十分不利。根據(jù)本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用碳二亞胺試劑EDC，再加入微量的NHS作為催化劑不僅可以大幅提高檢測靈敏度，還可以有效增強(qiáng)酶結(jié)合物的穩(wěn)定性、大幅改善相關(guān)性。并且，實(shí)驗(yàn)過程中涉及的反應(yīng)試劑毒性相對較低，實(shí)驗(yàn)人員人身安全可以得到保障，因此碳二亞胺法可以替代混合酸酐法。