郭潔，樊竹青

（普洱學(xué)院，云南普洱 665000）

植物內(nèi)生真菌是指生活史的一定階段生活于健康植物組織和器官的細(xì)胞內(nèi)部，對(duì)植物自身沒有引起明顯的病害，并與植物自身建立密切關(guān)系的一類微生物[1-3]。植物內(nèi)生真菌是宿主植物天然的微生態(tài)系統(tǒng)組成部分，對(duì)植物具有促生長(zhǎng)的調(diào)控作用，可增強(qiáng)宿主植物的抗逆性。植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生豐富的酶類和生物堿類、皂苷、芳香類等活性物質(zhì)，對(duì)動(dòng)植物及人病原菌體具有不同的抗菌性[3-5]。植物內(nèi)生真菌產(chǎn)酶豐富，種類繁多，對(duì)酶工程的發(fā)展具有很大的潛在價(jià)值。作為一類重要的微生物資源，植物內(nèi)生真菌為研究新型抗菌藥提供了豐富的資源。

小白芨（Bletilla striata）是蘭科植物多年生的草本藥用植物，內(nèi)含豐富的小白芨多糖和小白芨膠，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等功效[6]。近年來(lái)，對(duì)小白芨的藥理研究、化學(xué)成分分析、繁育栽培、多糖等提取的工藝研究方面較為廣泛，但對(duì)小白芨內(nèi)生真菌的研究報(bào)道資料相對(duì)較少。陳青青等[7]對(duì)湖北鐘祥、陜西安康兩地的野生白芨進(jìn)行了分離鑒定，而云南產(chǎn)小白芨屬植物內(nèi)生真菌和酶活研究鮮有報(bào)道。本研究以云南宣威產(chǎn)小白芨為研究對(duì)象，采用形態(tài)鑒定和分子鑒定的方法，對(duì)小白芨內(nèi)生真菌進(jìn)行分析，增加宣威小白芨的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期為云南產(chǎn)小白芨屬植物內(nèi)生真菌系統(tǒng)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種的來(lái)源

菌株分離自宣威所產(chǎn)無(wú)病蟲害的小白芨（Bletilla striata），供試菌株共2株，保存于普洱學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

100 mL TE緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；PCR擴(kuò)增劑，福州生物公司； Tris-HCl，碧云天生物公司；100 mL 1×TAE緩沖液，上海麥克林公司；8200 Triton X-100，北京索萊寶科技有限公司；100 mL 6×Loading Buffer，北京索萊寶科技有限公司；500 μL核苷酸染料（GeneFinder染料），北京生物科技有限公司；100 mg DNA Marker（DL2000），上海研生有限公司；50T真菌基因組DNA提取試劑盒，德國(guó)QIAGEN；上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，250 μL，杭州星群儀器公司；下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，250 μL，杭州星群儀器公司。

1.3 儀器與設(shè)備

L96G型PCR擴(kuò)增儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；TL2600型生物顯微鏡，上海締倫光學(xué)儀器有限公司；SC-3616型離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DNA自動(dòng)測(cè)序儀，昆明碩擎生物公司；HZQ-X300型搖床,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GXZ-300B型恒溫培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)，托普儀器有限公司；QL-901型旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；CP224C型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；Starter2C型pH計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；LDZX-75KBS型立式高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；EPED-20TJ型純水儀，易普易達(dá)公司。

1.4 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（分離純化培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂10～12 g，水1 000 mL，pH自然。

淀粉培養(yǎng)基：淀粉 10 g、馬鈴薯200 g、瓊脂11～12 g，水1 000 mL，pH自然。

油脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、花生油或香油10 g、瓊脂15～20 g、1.6%中性紅水溶液1 mL，水1 000 mL，pH6.9～7.1。

酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白10 g、牛肉浸粉3 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀2 g、瓊脂15 g，水1 000 mL，pH7.3～ 7.5。

果膠培養(yǎng)基：果膠5 g、酵母膏5 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）2 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）1 g、瓊脂20 g、剛果紅0.15 g，pH7.0～7.2。

1.5 內(nèi)生真菌的分離純化

小白芨表面消毒法參照劉悅等[9]對(duì)刺五加的表面消毒法。菌種的分離純化采用3點(diǎn)種植法，用接種針挑取內(nèi)生真菌的孢子或少量氣生菌絲接種于PDA培養(yǎng)基平板，接種的3個(gè)點(diǎn)成三角形，倒置于26～28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，觀察3個(gè)點(diǎn)菌落形態(tài)，直至3個(gè)菌落形態(tài)相同，并與原始記錄相符，則完成純化，將真菌轉(zhuǎn)接到斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 菌種的鑒定

1.6.1 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將純化后的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)3 d、7 d、15 d后分別觀察并記錄菌落形態(tài)，包括菌株的大小、顏色、質(zhì)地、菌落邊緣和有無(wú)滲出物等情況。用插片法培養(yǎng)菌株5～7 d后，在顯微鏡下觀察蓋玻片上的菌絲形態(tài)，重點(diǎn)觀察菌絲是否有隔，分生孢子的形態(tài)、大小、著生情況、聚集方式和分生孢子梗的形態(tài)，觀察的同時(shí)進(jìn)行拍照，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》[8]進(jìn)行初步形態(tài)鑒定。

1.6.2 2株真菌產(chǎn)酶情況初篩

將經(jīng)過(guò)分離純化的真菌分別接種至淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和果膠培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)。每天觀察菌株的生長(zhǎng)情況及是否有透明圈的產(chǎn)生，篩選具有明顯透明圈的真菌。

1.6.3 內(nèi)生真菌的分子鑒定

選出具有明顯透明圈的2株真菌，進(jìn)行分子鑒定。

1.6.3.1 內(nèi)生真菌細(xì)胞總DNA材料的獲得

（1）25 mL PDA液體培養(yǎng)基分裝于50 mL的搖瓶中，121 ℃滅菌30 min備用。

（2）將菌株接種到無(wú)菌的PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min、搖床培養(yǎng)2～3 d后將菌體收集在1.5 mL Eppendorf管中。

（3）將收集好的菌體在8 000 r/min下離心4 min，倒掉上清液，用冰冷的等體積無(wú)菌水洗滌，再離心。

（4）用200 μL的裂解液重懸上一步中得到的細(xì)胞沉淀，混勻后加入2匙石英砂，苯酚、氯仿各200 μL，渦旋振蕩 5 min，加入 200 μL TE 緩沖液，充分混勻。

（5）13 000 r/min離心5 min，將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈的Eppendorf管中，加入400 μL氯仿并翻轉(zhuǎn)混勻（輕混）。

（6）重復(fù)步驟（5），加入1 mL無(wú)水乙醇，充分混勻，13 000 r/min離心2 min。

（7）棄上清液，用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，13 000 r/min離心3～5 min。

（8）完全棄上清液，并將沉淀在烘箱中干燥至沉淀發(fā)白無(wú)酒精味。

（9）加入50 μL TE緩沖液重懸沉淀，4 ℃冰箱中過(guò)夜溶解，-20 ℃保存。

1.6.3.2 測(cè)定DNA濃度

為了提高實(shí)驗(yàn)效果和縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，在PCR擴(kuò)增前測(cè)定DNA濃度。用核酸測(cè)定儀測(cè)量波長(zhǎng)260 nm的吸光值，然后直接在儀器上轉(zhuǎn)化成濃度、純度的讀數(shù)。

1.6.3.3 rDNA-ITS基因序列的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

瓊脂糖凝膠電泳步驟如下。（1）取1.6 g瓊脂糖置于三角瓶中，加入75 mL 1×TAE緩沖液，瓶口蓋一塊布或者倒扣一個(gè)小燒杯，放在微波爐中加熱直到瓊脂糖溶解，待溶液冷卻至60 ℃左右時(shí)加入一滴GeneFinder染料，輕輕混勻，倒入制膠槽，待有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。（2）室溫下靜置20～25 min，膠層完全凝固后，將凝膠和內(nèi)槽一起放在含有1×TAE緩沖液的電泳槽中，將準(zhǔn)備好的梳子輕輕地插入膠層上，再輕拔出梳子，制成均勻的膠板樣品孔。（3）用移液器分別將2個(gè)樣品將各取9 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混合后點(diǎn)樣加入膠板的樣品孔，待全部加完樣品后即可通電進(jìn)行電泳（電壓200 V，電流200 mA）。電泳結(jié)束用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。DNA測(cè)序結(jié)果用Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定檢驗(yàn)，構(gòu)建進(jìn)化樹，根據(jù)進(jìn)化樹分析2株內(nèi)生真菌之間的親緣關(guān)系和遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 小白芨內(nèi)生真菌的特征與鑒定

經(jīng)過(guò)PDA培養(yǎng)基的分離純化，最終獲得純正的2個(gè)菌株，編號(hào)為M15和PDAX2，菌落形態(tài)見圖1、圖2、圖3。2株內(nèi)生真菌根據(jù)形態(tài)鑒定到屬,初步確定內(nèi)生真菌M15、PDAX2為青霉屬（Penicillium）菌株。

圖1 菌株M15培養(yǎng)7 d的宏觀菌落形態(tài)圖

圖2 菌株P(guān)DAX2培養(yǎng)7 d的宏觀菌落形態(tài)圖

圖3 菌株培養(yǎng)7 d的微觀菌落形態(tài)圖

表1 M15菌株菌落形態(tài)及顯微鏡下的形態(tài)特征

表2 PDAX2菌株菌落形態(tài)及顯微鏡下的形態(tài)特征

2.2 產(chǎn)酶情況初篩

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)觀察，菌株M15在蛋白質(zhì)培養(yǎng)基、果膠培養(yǎng)基和脂肪培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明的水解圈，PDAX2在淀粉培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和果膠培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈。說(shuō)明M15能產(chǎn)生蛋白酶、果膠酶和脂肪酶，PDAX2能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和果膠酶（見圖4、圖5）。

圖4 菌株M15出現(xiàn)水解圈的情況

圖5 菌株P(guān)DAX2出現(xiàn)水解圈的情況

2.3 小白芨內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)基因序列構(gòu)建的菌株M15、PDAX2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖6所示。供試的2株真菌M15、PDAX2的DNA成功提取并擴(kuò)增，將純化的DNA擴(kuò)增結(jié)果送由昆明碩擎生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中生物序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)序列輸入Mega5軟件，進(jìn)行鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其鑒定結(jié)果如下：M15鑒定為青霉屬雷斯青霉菌（Penicillium raistrickii）；PDAX2鑒定為青霉屬波蘭青霉（Penicillium polonicum）菌。

圖6 根據(jù)基因序列構(gòu)建菌株M15、PDAX2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

在Blast的結(jié)果中，與M15比對(duì)上的序列是Penicillium raistrickii，與PDAX2相似度最高的是Penicillium polonicum菌株。在進(jìn)化樹的結(jié)果中，序列之間親緣性與Blast結(jié)果相符合。同時(shí)，此次實(shí)驗(yàn)測(cè)到的M15與PDAX2序列分別位于不同分支，其遺傳距離較大。

3 討論

我國(guó)國(guó)土遼闊，植物資源豐富，很多植物內(nèi)生真菌的研究表明，每種植物中都蘊(yùn)藏著豐富的內(nèi)生真菌資源，但是由于特殊的環(huán)境和很多藥用植物內(nèi)生真菌在人工培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)，使得我國(guó)的植物內(nèi)生真菌研究還不是很深，因此植物內(nèi)生真菌亟待開發(fā)和挖掘[7]。現(xiàn)有基因工程和生物技術(shù)的快速發(fā)展，為研究植物內(nèi)生真菌提供了便利，進(jìn)一步加強(qiáng)了人類對(duì)植物內(nèi)生真菌的探究，同時(shí)在尋找新的抗菌抗癌物質(zhì)新藥、尋找酶類等方面具有深遠(yuǎn)的意義[2]。

在本次的研究中，只是進(jìn)行了形態(tài)鑒定和分子鑒定，對(duì)于小白芨研究還有很大的空白需要填充，內(nèi)生真菌的資源非常豐富，由于條件有限，本研究只分離鑒定到2株。陳青青等[7]以湖北鐘祥、陜西安康的小白芨為樣品，分離到內(nèi)生真菌24株，其分離到的菌株種類更多，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相差較大，經(jīng)分析，出現(xiàn)差異的原因可能如下：（1）二者的實(shí)驗(yàn)材料地域結(jié)構(gòu)相差較大，小白芨的內(nèi)生環(huán)境、生理狀況相差較大，造成內(nèi)生真菌相差較大；（2）實(shí)驗(yàn)材料采集的季節(jié)不同，造成內(nèi)生真菌的種類也不同；（3）二者所采實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量的不同也會(huì)造成很大的差異。小白芨內(nèi)生真菌研究很多關(guān)鍵性的問(wèn)題有待解決，特別是應(yīng)該加強(qiáng)內(nèi)生真菌的鑒定這一方面，充分了解內(nèi)生真菌和宿主的關(guān)系，提高小白芨種的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)也為保護(hù)小白芨的種質(zhì)資源做好基礎(chǔ)性工作。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)云南宣威產(chǎn)小白芨的研究，分離和鑒定出2株真菌，均為青霉屬菌株。通過(guò)分子生物學(xué)鑒定到種，M15為青霉屬雷斯青霉（Penicillium raistrickii），PDAX2為青霉屬波蘭青霉（Penicillium polonicum）。M15產(chǎn)生蛋白酶、果膠酶和脂肪酶，PDAX2產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和果膠酶。