陳蘇蒙，薛 毅，趙程祥，賈 曼，張宏達(dá)，陳 剛*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125；3.天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，天津 300384)

喹諾酮類藥物是動(dòng)物使用最廣泛的抗生素之一，它們?cè)趧?dòng)物中的主要用途是治療細(xì)菌感染、預(yù)防感染和作為食用動(dòng)物的生長(zhǎng)促進(jìn)劑[1-2]。我國(guó)大部分肉雞養(yǎng)殖環(huán)境較差，不法商販為降低肉雞的病死率，存在使用禁用獸藥與抗生素等行為，同時(shí)由于政府監(jiān)管不到位，導(dǎo)致我國(guó)肉雞養(yǎng)殖尚存在較大的食品安全隱患[3]。在動(dòng)物養(yǎng)殖中濫用抗生素，以及在動(dòng)物接受抗生素治療后，或者在藥物代謝排泄之前屠宰藥物動(dòng)物，可能導(dǎo)致這些抗生素及其代謝物殘留在供人類食用的食品中。攝入這種食物可能會(huì)導(dǎo)致健康風(fēng)險(xiǎn)，如過(guò)敏問(wèn)題、毒性問(wèn)題，以及抗生素殘余物通過(guò)食物鏈傳遞給人類時(shí)，導(dǎo)致耐藥菌株的數(shù)量增加而產(chǎn)生的耐藥問(wèn)題[4]。為了規(guī)范這些藥物的使用，制定了動(dòng)物食品中的這些抗生素最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)的一系列政策和措施，包括根據(jù)每個(gè)物種和組織中的MRL，以此來(lái)避免對(duì)消費(fèi)者健康造成風(fēng)險(xiǎn)。然而目前制定的MRL只限制于活性化合物(抗生素)或主要的已知代謝物，而其他未知代謝物和轉(zhuǎn)化物可能通過(guò)與生物物質(zhì)相互作用或自身代謝形成，不包括在食品中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星最大殘留限量(GB31650-2019)法規(guī)中。因此，有必要對(duì)這些未知代謝物和轉(zhuǎn)化物進(jìn)行研究，以了解可能對(duì)人類健康產(chǎn)生的相關(guān)毒性或有害影響，并避免產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果[5-6]。本文綜述恩諾沙星與環(huán)丙沙星兩種常用的喹諾酮類藥物在肉雞體內(nèi)殘留與代謝物檢測(cè)方面(研究方法主要包括：高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、膠體金標(biāo)記單克隆抗體及競(jìng)爭(zhēng)抑制方法)的研究進(jìn)展，并探究恩諾沙星、環(huán)丙沙星在不同品類雞中代謝分布與殘留消除規(guī)律的異同，為進(jìn)一步研究喹諾酮類藥物在不同品種肉雞中的殘留與代謝物檢測(cè)提供參考。

1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在肉雞方面的殘留檢測(cè)研究

1.1 高效液相色譜(HPLC)法 高效液相色譜具有溶質(zhì)擴(kuò)散速度快、在較短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)數(shù)據(jù)的優(yōu)點(diǎn)。高雪梅等[7]選取40日齡，體重為1.5±0.2 kg的黃羽肉雞進(jìn)行100 mg/L恩諾沙星飲水給藥，混飲7 d后，取肌肉、全肝、全腎，經(jīng)處理檢測(cè)后，結(jié)果表明：在肌肉及肝臟停藥后7 d、腎臟停藥后3 d的組織中，恩諾沙星殘留量均低于規(guī)定MRL。并且表明在零休藥期時(shí)，肝臟中的殘留量大于肌肉大于腎臟，藥物在肝臟中消除最為緩慢。Garcia-Ovando H等[8]開(kāi)發(fā)了一種提取和液相色譜測(cè)定雞肌肉中恩諾沙星殘留的技術(shù)。肌肉樣品用二氯甲烷和離心三步提取以從肌肉中分離恩諾沙星，檢測(cè)限(LOD)為0.00048 μg/mL，定量限(LOQ)為0.0039 μg/mL，回收率平均為86.67%。鄭育基[9]建立的HPLC可同時(shí)檢測(cè)雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量，此方法的LOD與LOQ分別為0.01 μg/mL與0.05 μg/mL，回收率在87.26%～106.36%。

Aslam B 等[10]采用HPLC檢測(cè)肉(n=75)和肝臟(n=75)樣品中恩諾沙星殘留，肉類和肝臟樣品中恩諾沙星的總體平均殘留濃度分別為208±55 μg/kg和527±84 μg/kg。該研究表明，52%的肉類和78.7%的肝臟樣本對(duì)恩諾沙星呈陽(yáng)性，58.3%肉和71.2%肝臟樣品殘留濃度高于MRL，使用這種受污染的肉類可能會(huì)引起消費(fèi)者的抵抗，并且對(duì)公共健康構(gòu)成威脅。Verma M K等[11]收集了來(lái)自家禽養(yǎng)殖場(chǎng)和零售市場(chǎng)的雞肉樣品(包括肌肉、肝臟、腎臟和脂肪)。分析結(jié)果顯示，43.58%的肉類樣本對(duì)恩諾沙星呈陽(yáng)性，38.71%肉類樣本對(duì)環(huán)丙沙星呈陽(yáng)性。其中，45.17%的樣品濃度高于恩諾沙星的MRL，50.28%的樣品濃度高于環(huán)丙沙星MRL。因此,可以得出結(jié)論，在雞肉中使用這些抗菌劑對(duì)肉類可能會(huì)造成污染，導(dǎo)致消費(fèi)者產(chǎn)生耐藥性，對(duì)公共健康構(gòu)成威脅[12]。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法 為了獲得更加精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，研究者們將液相色譜與質(zhì)譜法串聯(lián)共同檢測(cè)物質(zhì)的含量[13]。Arslan-Acaroz D等[14]通過(guò)LC-MS/MS方法研究雞肝臟樣品，方法檢測(cè)限為1.17 mg/kg(恩諾沙星)和1.24 mg/kg(環(huán)丙沙星)。分別在39%和31%的樣品中檢測(cè)到恩諾沙星和環(huán)丙沙星，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有雞肉中兩種抗生素殘留水平的總和遠(yuǎn)低于規(guī)定的最大殘留水平。Zamoum R等[15]采用LC-MS/MS法檢測(cè)和鑒定雞肉中磺胺類和喹諾酮類的殘留，151只雞樣品來(lái)自阿爾及利亞中部地區(qū)17個(gè)城市的30個(gè)屠宰場(chǎng)。結(jié)果表明，至少43%的樣品中存在抗生素，喹諾酮類藥物的篩查顯示樣品的污染百分比為26.5%，其中恩諾沙星占19.86%。

潘麗花[16]建立的HPLC-MS/MS方法則可在雞可食性組織中同時(shí)測(cè)定27種喹諾酮類藥物(含恩諾沙星與環(huán)丙沙星)的含量。Martin B S等[17]選取白來(lái)航白羽肉仔雞，進(jìn)行了10 mg/kg的恩諾沙星肌肉注射，經(jīng)HPLC-MS/MS檢測(cè)，藥物殘留量均低于歐盟和日本MRL。孫紅洋等[18]建立的HPLC-MS/MS方法可檢測(cè)恩諾沙星與環(huán)丙沙星在雞蛋及雞可食性組織中的殘留量。此方法的LOD與LOQ分別為1 μg/kg與5 μg/kg，兩種藥物的平均回收率范圍在75.5%～106%之間。

1.3 膠體金標(biāo)記單克隆抗體及競(jìng)爭(zhēng)抑制法 膠體金技術(shù)具有特異敏感性，且其穩(wěn)定性強(qiáng)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制可阻礙底物與酶的結(jié)合，從而判斷出酶的活性部位等。孫曉崢[19]等采用了膠體金標(biāo)記單克隆抗體及競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)肉雞中喹諾酮類藥物，并組裝了檢測(cè)氟喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星等10種)抗生素殘留的膠體金免疫層析試紙條，以供目標(biāo)藥物的快速檢測(cè)。王宵雪等[20]建立了膠體金免疫層析分析方法，15種喹諾酮類藥物及8種常用獸藥對(duì)恩諾沙星免疫膠體金快速檢測(cè)均無(wú)明顯干擾，表明膠體金檢測(cè)氟喹諾酮類抗生素殘留具有良好的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性，且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Ha M S等[21]通過(guò)熒光染料標(biāo)記的微粒與恩諾沙星分子共價(jià)結(jié)合，溶液中的恩諾沙星與微粒固定的恩諾沙星(enroMPs)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合芯片上的抗體，結(jié)合恩諾沙星的微粒會(huì)出現(xiàn)熒光來(lái)檢測(cè)恩諾沙星。在最佳條件下，恩諾沙星實(shí)現(xiàn)了高動(dòng)態(tài)范圍濃度范圍為1～1000 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)限和定量限分別為5 μg/kg和20 μg/kg，明顯低于最大殘留限量。使用簡(jiǎn)單的提取方法，強(qiáng)化牛肉、豬肉和雞肉樣品的回收率為43.4%～62.3%。由于其靈敏度、特異性、簡(jiǎn)單性和快速性，將有助于以高通量方式檢測(cè)和近似定量食品中的恩諾沙星殘留。

1.4 其他檢測(cè)方法 Panzenhagen P H N等[22]研究調(diào)查了恩諾沙星ELISA 檢測(cè)試劑盒與 LC-MS/MS 相比檢測(cè)肉雞組織中恩諾沙星殘留的效率。從6個(gè)不同的屠宰場(chǎng)獲得 72 個(gè)樣品的肉雞組織。ELISA和HPLC被用來(lái)鑒定和量化樣品對(duì)恩諾沙星的污染?？偣?2%的分析樣品含有恩諾沙星ELISA檢測(cè)到的殘留物和22.2%的殘留物被LC-MS/MS檢測(cè)到。所有通過(guò)LC-MS/MS檢測(cè)到的恩諾沙星殘留陽(yáng)性樣品通過(guò)ELISA也呈陽(yáng)性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了ELISA測(cè)試的效率，并建議將其用作家禽組織中恩諾沙星殘留的篩選方法，因?yàn)樗Y(jié)果快、價(jià)格低且適用性強(qiáng)。

Barrón D等[23]提出了一種以馬波沙星為內(nèi)標(biāo)分析雞肌肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的方法。樣品的凈化和預(yù)濃縮通過(guò)固相萃取進(jìn)行，并使用光電二極管陣列檢測(cè)器通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行測(cè)定，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的校準(zhǔn)曲線在10～300 μg/kg范圍內(nèi)呈線性，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的方法回收率分別為74%和54%，這兩種化合物的檢測(cè)限低于25 μg/kg，這允許在所需的最大殘留限下檢測(cè)陽(yáng)性肌肉樣品。Rasheed C M等[24]開(kāi)發(fā)了一種新穎、簡(jiǎn)單、快速、應(yīng)用廣泛且可靠的衍生分光光度法，用于測(cè)定恩諾沙星。一階導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定恩諾沙星的濃度范圍為0.3～31.0 μg/kg，回收率在93.01%～103.67%的范圍內(nèi)，該方法用于測(cè)定不同雞肌肉、肝臟和腎臟樣品中的這些抗生素。

2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在代謝轉(zhuǎn)化方面的研究

陳杖榴等[25]發(fā)現(xiàn)在家禽使用恩諾沙星后，藥物在體內(nèi)廣泛分布，主要通過(guò)腎臟可排泄15%～50%的原形藥物；肝臟為次要代謝消除的途徑，主要代謝物為環(huán)丙沙星，次要代謝產(chǎn)物為恩諾沙星氧化物與葡萄糖醛酸結(jié)合物；環(huán)丙沙星在1.8～2.0 kg肉雞體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為去乙烯環(huán)丙沙星與氧基環(huán)丙沙星。Slana M等[26]利用HPLC法研究了肉雞連續(xù)5 d口服恩諾沙星對(duì)其代謝和排泄的影響，并證實(shí)了恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星、去乙烯恩諾沙星(DES-EF)和去乙烯環(huán)丙沙星(DES-CF)的存在。恩諾沙星飲水給藥后1～13 d，恩諾沙星在第1天至第13天期間主要以母體化合物的形式排出。在第1天至第6天的排泄物中檢測(cè)到環(huán)丙沙星，而少量的去DES-EF與去DES-CF僅分別在第1天至第7天和第1天至第6天排泄。Morales-Gutierrez F J等[27]使用LC-MS技術(shù)鑒定了雞肌肉中恩諾沙星與環(huán)丙沙星的新代謝物與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(TPs)。結(jié)果檢測(cè)出了21種恩諾沙星TPs，6種環(huán)丙沙星TPs，以及14種代謝產(chǎn)物。并表明去乙烯-喹諾酮是最顯著的TPs，以及含量較低的其他代謝產(chǎn)物，如哌嗪環(huán)裂解、芳香環(huán)去氟以及芳香環(huán)去氟雙羥基化后的產(chǎn)物。

圖1 恩諾沙星主要代謝產(chǎn)物

圖2 環(huán)丙沙星主要代謝產(chǎn)物

柳愛(ài)春等[28]的研究發(fā)現(xiàn)恩諾沙星在麻雞黃羽肉雞體內(nèi)轉(zhuǎn)化率高，代謝慢，環(huán)丙沙星在麻雞黃羽肉雞體內(nèi)轉(zhuǎn)化率較低，其中肝臟中主要TPs與恩諾沙星的代謝產(chǎn)物相似，為培氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星及氧氟沙星。而應(yīng)翔宇等[29]在白羽艾維茵肉雞體內(nèi)注射恩諾沙星后的代謝產(chǎn)物中未檢測(cè)出環(huán)丙沙星。對(duì)于恩諾沙星在雞中的主要代謝產(chǎn)物研究結(jié)果不同，推測(cè)可能是由于實(shí)驗(yàn)雞的不同品種或品類導(dǎo)致藥物在雞體內(nèi)的代謝消除速率不同，從而在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)出的代謝物含量有較大差異，致使出現(xiàn)在檢測(cè)時(shí)無(wú)目標(biāo)代謝物的現(xiàn)象。

Turnipseed S B等[30]建立了四極飛行時(shí)間(Q-TOF)液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析獸藥殘留轉(zhuǎn)化的方法，發(fā)現(xiàn)恩諾沙星的主要?dú)埩羰黔h(huán)丙沙星，另一種與恩諾沙星不同的氟喹諾酮類藥物，通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)搜索具有相同分子量的氟喹諾酮化合物，最終證明為培氟沙星損失-CO2和-C4H7NO2的相對(duì)應(yīng)的低質(zhì)量產(chǎn)物離子。ANADO'N A等[31]給健康雞單次靜脈注射和口服環(huán)丙沙星(8 mg/kg)，測(cè)定環(huán)丙沙星及其代謝物的藥代動(dòng)力學(xué)特性。靜脈注射和口服給藥后，血漿濃度-時(shí)間曲線具有二室開(kāi)放模型的特征。環(huán)丙沙星主要轉(zhuǎn)化為氧環(huán)丙沙星和去乙烯環(huán)丙沙星。當(dāng)口服環(huán)丙沙星(連續(xù)3 d 8 mg/kg)時(shí)，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)多的腎臟、肝臟、肌肉和皮膚脂肪組織中含有環(huán)丙沙星及其代謝物惡環(huán)丙沙星和去亞乙基環(huán)丙沙星。Haag G等[32]為了研究肉雞羽毛中恩諾沙星/環(huán)丙沙星殘留的藥代動(dòng)力學(xué)，建立高效液相色譜-熒光法定量測(cè)定肉雞羽毛中殘留的恩諾沙星和環(huán)丙沙星，計(jì)算這些藥物在人類食用前的等待時(shí)間，研究結(jié)果表明在9 d內(nèi)在羽毛中檢測(cè)到這兩種化合物。這種分析方法表現(xiàn)出良好的線性，選擇性，準(zhǔn)確度和精密度，該研究在研究羽毛中恩諾沙星/環(huán)丙沙星殘留方面具有重要應(yīng)用。

3 展 望

經(jīng)上述研究總結(jié)目前制定的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的MRL只限制于原藥形式或主要的已知代謝物的檢測(cè)，恩諾沙星主要代謝物為環(huán)丙沙星、去乙烯環(huán)丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星及氧氟沙星；環(huán)丙沙星主要代謝物為培氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星和去乙烯環(huán)丙沙星，而其他未知代謝物和轉(zhuǎn)化物研究較少，因此，有必要對(duì)這些未知代謝物和轉(zhuǎn)化物建立相關(guān)的研究方法，以完善其相對(duì)應(yīng)的法律法規(guī)。其次發(fā)現(xiàn)在2020版《中國(guó)獸藥典》與GB31650-2019中都未提及環(huán)丙沙星的用法用量，建議進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究并完善相應(yīng)的資料內(nèi)容。最后，發(fā)現(xiàn)抗菌藥物在烏骨雞體內(nèi)的殘留消除時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他品類雞，推測(cè)主要原因是由于氟喹諾酮類藥物通過(guò)堿性氮原子與烏骨雞體內(nèi)的黑色素結(jié)合，導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物在烏雞皮脂及肌肉內(nèi)殘留濃度較高，對(duì)于此現(xiàn)象，將來(lái)可進(jìn)行烏骨雞黑色素基因方面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步分析其代謝消除較慢的具體原因。