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魚腥草多糖對MA104和MARC145細(xì)胞活力影響的比較研究

2022-05-16 13:23李秀麗任衛(wèi)科王建國鄢明華
中國獸藥雜志 2022年3期
關(guān)鍵詞:計(jì)數(shù)法魚腥草多糖

朱 琪,李秀麗,任衛(wèi)科,江 珊,張 莉,王建國,鄢明華

(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300381)

魚腥草(houttuynia cordata)作為傳統(tǒng)中獸藥在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛,前期研究表明,飼料中添加魚腥草有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、提高生產(chǎn)性能等多重功效,從而達(dá)到抗病提高畜禽生產(chǎn)力的目的[1-3]。魚腥草多糖(houttuynia cordata polysaccharide, HCP)是魚腥草中提取的天熱有效成分,其中單糖組成主要為木糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖[4-5],研究表明其具有廣譜的抗病毒作用,對多種病毒均有不同程度的抑制作用[6-7]。非洲綠猴腎細(xì)胞MA104及其單克隆得到的MARC145細(xì)胞是多種病毒的宿主,在體外研究中可以作為病毒復(fù)制的載體,尤其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),牛/豬輪狀病毒(bovine/porcine rotavirus, RV)和禽傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)等有很好的適應(yīng)性[8-10]。探明HCP對MA104和MARC145細(xì)胞的毒性作用,以期為HCP體外藥理研究提供試驗(yàn)支撐,為進(jìn)一步研究其藥理作用機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 魚腥草多糖的提取與配制 魚腥草購自安國市友鑫中藥材銷售有限公司。

魚腥草除雜、干燥、粉碎過40目篩,準(zhǔn)確稱量8 g,加入400 mL純凈水,水浴加熱80 ℃回流提取6 h,重復(fù)三次;合并所得過濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮定容至40 mL(得魚腥草水提物),取20 mL濃縮液加入100 mL 95%乙醇進(jìn)行醇沉過夜,待第2天有大量醇析物時(shí),棄去上清液后,將醇析物水浴蒸干得魚腥草粗多糖;粗多糖蒸餾水定容至30 mL,加入等量體積的Sevage試劑(氯仿﹕正丁醇=4∶1,體積比) 混合震蕩30 min,離心取上清液,重復(fù)3次,多糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法,以葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較得出多糖濃度,計(jì)算公式如下:多糖得率=C×V×N/m×100%(C多糖濃度;V藥品測試體積;N稀釋倍數(shù);m原料藥初始質(zhì)量)。

魚腥草多糖含量的測定:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,取分析純無水葡萄糖干燥至恒重。精密稱量60 mg,置于100 mL容量瓶中,加水定容,超聲混勻,得葡萄糖對照品溶液。用移液槍取葡萄糖對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,分別置于50 mL的容量瓶中,加水定容并超聲混勻,得對照品梯度溶液D1、D2、D3、D4、D5,備用。取對照品梯度溶液D1、D2、D3、D4、D5各2 mL于試管中,各加4%苯酚溶液1 mL混勻再迅速加入硫酸7 mL,搖勻。40 ℃水浴30 min,取出再冰浴5 min。以蒸餾水調(diào)零于490 nm處測定吸光度值,每組平行測定三次,取均值。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。多糖含量的測定,方法同上,代入得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,計(jì)算濃度以及干燥產(chǎn)物的多糖含量。多糖提取流程圖如圖1所示。

圖1 魚腥草多糖提取流程圖

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng) MA104和MARC145細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞保藏中心。

復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37 ℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 RPM條件下離心4 min,棄去上清液,補(bǔ)加2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。檢查細(xì)胞活力計(jì)數(shù)凍存,檢測細(xì)胞和相關(guān)試劑支原體陰性備用,利用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測活細(xì)胞率,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

細(xì)胞生長培養(yǎng)基:DMEM(高糖型,含4500 mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺,和110 mg/L丙酮酸鈉,不含碳酸氫鈉)+8%胎牛血清+ 1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的培養(yǎng)液,調(diào)pH值為7.4;細(xì)胞維持培養(yǎng)基:DMEM+4%胎牛血清;凍存液:細(xì)胞生長培養(yǎng)基+10%胎牛血清+10% DMSO;消化液:0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

細(xì)胞培養(yǎng)條件:溫度37 ℃;95%空氣;5% CO2;濕度90%以上。細(xì)胞傳代培養(yǎng),復(fù)蘇細(xì)胞每管接種T25培養(yǎng)瓶一個(gè),細(xì)胞在剛長成細(xì)胞單層時(shí)記錄并及時(shí)進(jìn)行消化傳代。按1∶3傳代,細(xì)胞接種密度為1×105cells/mL,觀察記錄長成單層的時(shí)間。

1.3 細(xì)胞生長曲線的繪制 分別用細(xì)胞平板計(jì)數(shù)法和MTT法繪制細(xì)胞生長曲線:將長成單層的MA104/MARC145細(xì)胞從培養(yǎng)瓶內(nèi)消化下來,吹打均勻后按0.5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每天取6孔細(xì)胞,消化后計(jì)數(shù)并取平均值,連續(xù)監(jiān)測9 d;同時(shí)另鋪板用MTT法檢測各孔OD值,以天數(shù)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)/OD值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 魚腥草多糖對細(xì)胞活力的影響 根據(jù)細(xì)胞生長曲線確定對數(shù)生長期為試驗(yàn)階段,配制梯度濃度的HCP溶液(0、0.005、0.05、0.5、5、50 mg/mL),將梯度濃度的HCP溶液孵育細(xì)胞24 h,MTT法檢測細(xì)胞活力,每孔加MTT溶液10 μL,繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后,加入DMSO液(100 μL/孔),室溫下,平板置在微孔板震蕩器上震蕩10 min,使結(jié)晶物溶解。酶標(biāo)儀檢測各孔OD值(λ=570 nm),記錄結(jié)果[11]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(x±s)表示,以P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。圖集均由GraphPad Prism 6.0繪圖軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草多糖提取率 魚腥草原藥提取多糖通過以料液比1∶50,80 ℃熱水回流浸提6 h,5倍乙醇沉淀,Sevage 法除蛋白,真空冷凍干燥獲得。經(jīng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測多糖濃度C為4.36 mg/mL,根據(jù)公式算得HCP提取率為8.18%。

2.2 細(xì)胞生長曲線繪制 由圖2可知,細(xì)胞平板計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線圖呈S型,有明顯的潛伏期、對數(shù)生長期和衰退期;MA104細(xì)胞峰值出現(xiàn)在第7天,而MARC145細(xì)胞峰值為第8天,MA104細(xì)胞的對數(shù)生長期為第4至第7天,而MARC145細(xì)胞對數(shù)生長期為第4至第8天。由圖3所示,MTT法測得細(xì)胞生長曲線結(jié)果與圖2細(xì)胞平板計(jì)數(shù)法相似。

圖2 細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制MA104和MARC145細(xì)胞生長曲線圖

圖3 MTT法繪制MA104和MARC145細(xì)胞生長曲線圖

2.3 梯度濃度魚腥草多糖對MA104和MARC145細(xì)胞活力的影響 由圖4可知,50 mg/mL的HCP對MA104細(xì)胞活力有抑制作用,且OD值顯著低于對照組(P<0.05);HCP濃度為0.05、0.5、5 mg/mL組細(xì)胞OD值顯著高于對照組(P<0.05), 0.005 mg/mL HCP細(xì)胞OD值與對照組無顯著顯著(P>0.05)。

由圖5可知,50 mg/mL的HCP對MARC145細(xì)胞活性有抑制作用,且OD值極顯著低于對照組(P<0.01);HCP濃度為0.05、0.5、5 mg/mL的三組細(xì)胞OD值與對照組比較顯著提高(P<0.05);HCP濃度為0.005 mg/mL的細(xì)胞組,OD值與對照組差異不顯著。

圖4 魚腥草多糖對MA104細(xì)胞活力的影響

圖5 魚腥草多糖對MARC145細(xì)胞活力的影響

2.4 魚腥草多糖對MA104和MARC145細(xì)胞形態(tài)的影響 由圖6可知,0 mg/mL的HCP(正常對照)處理24 h后,MA104和MARC145細(xì)胞形態(tài)正常,呈明顯的鋪路石樣;0.5 mg/mL的HCP處理24 h后,MA104和MARC145細(xì)胞形態(tài)正常,比正常對照細(xì)胞間隙更緊密,折光率也更高;50 mg/mL的HCP處理24 h后,MA104和MARC145細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變圓皺縮,個(gè)別細(xì)胞脫壁;500 mg/mL的HCP處理24 h后,MA104和MARC145細(xì)胞破裂聚集,產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片,只見個(gè)別細(xì)胞貼壁,形態(tài)呈煎蛋樣壞死。

圖6 魚腥草多糖對MA104和MARC145細(xì)胞形態(tài)的影響(200×)

3 討論與結(jié)論

MTT法可直接檢測活細(xì)胞中線粒體酶活性,MTT結(jié)晶形成的量和細(xì)胞數(shù)成正比,從而反映細(xì)胞數(shù)量和活力,因此,MTT法檢測細(xì)胞活力更直接。本試驗(yàn)同時(shí)運(yùn)用細(xì)胞平板計(jì)數(shù)法和MTT法檢測細(xì)胞活力,結(jié)果顯示兩種方法繪制的細(xì)胞生長曲線基本相似,MTT法更方便直觀,且在臨床應(yīng)用廣泛[12]。因此,下一步藥效學(xué)試驗(yàn)選取MTT法檢測細(xì)胞活力。

本研究表明,高濃度HCP(50 mg/mL)對MA104和MARC145細(xì)胞活力有明顯抑制作用,本試驗(yàn)觀察到細(xì)胞形態(tài)明顯收縮,可能與多糖改變細(xì)胞滲透壓有關(guān);0~0.005 mg/mL的HCP對MA104和MARC145細(xì)胞活力無顯著影響;0.05~5 mg/mL的HCP對MA104和MARC145細(xì)胞活力有明顯促進(jìn)作用。前人研究表明,魚腥草粗提物對MARC145細(xì)胞最大安全作用質(zhì)量濃度為1.563 mg/mL[13],本研究表明小于等于5 mg/mL的HCP對MARC145細(xì)胞安全,說明同濃度的HCP比粗提物對MARC145細(xì)胞更安全,毒副作用更低。不同制備方法配制成20 mg/mL的HCP對三種病毒均有抑制作用,且對RD細(xì)胞和Hep2細(xì)胞無毒副作用[6],說明HCP對多種細(xì)胞具有較高的安全性,適用范圍更廣。300 μg/mL HCP對人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠白血病細(xì)胞L1201的生長均有顯著的抑制作用[14],提示其對細(xì)胞的影響具有雙向調(diào)節(jié)作用。因此,本研究表明,梯度濃度的HCP對MA104和MARC145細(xì)胞活力的影響,可篩選促生長最佳濃度劑量范圍和毒性劑量,為進(jìn)一步開展后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

HCP(0~5 mg/mL)對MA104和MARC145細(xì)胞無毒性作用,為深入研究HCP的藥理機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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