張崇威，李華岑，陳 薔，彭 麗，張振宇，吳志明

(1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008；2.濟源市畜產(chǎn)品質量監(jiān)測檢驗中心，河南濟源，459000)

四環(huán)素類藥物屬于對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌均敏感的人工合成抗生素[1-2]，作用機理為其與細菌核蛋白體的30 s亞基團結合，阻止aa-tRNA同核蛋白體結合，從而阻止肽鏈延伸和細菌蛋白質合成[3]，作為一類廣譜抗生素已被廣泛應用于畜禽等養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的疾病治療中。但由于養(yǎng)殖戶的濫用、盲用、不遵守休藥期使用等多種原因，四環(huán)素類藥物及其代謝物易在肝腎中富積并隨乳汁分泌排出而流入食物鏈[4]，并且作為飼料添加劑，造成雞蛋中藥物殘留問題不斷增多，影響牙齒及骨骼發(fā)育、腸道菌群失調(diào)、細菌耐藥以及環(huán)境污染等諸多問題[5]，因此，國內(nèi)外都對四環(huán)素類藥物殘留實施了嚴格的監(jiān)控[6]，我國在GB31650-2019中也明確規(guī)定：牛/羊奶中土霉素、金霉素、四環(huán)素單個或組合最大殘留限量為100 μg/kg，雞蛋中土霉素、金霉素、四環(huán)素單個或組合最大殘留限量為400 μg/kg，多西環(huán)素為泌乳期禁用。目前尚無牛奶及雞蛋中同時檢測4種四環(huán)素類化合物殘留檢測的國標，且相關文獻也較少，因此，對建立一種同時適用于牛奶及雞蛋中4種四環(huán)素類藥物殘留檢測方法具有重要意義?，F(xiàn)有相關國家標主要為GB/T 21317-2007 動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法與高效液相色譜法、農(nóng)業(yè)部1025號公告-12-2008 雞肉、豬肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測-液相色譜串聯(lián)質譜法。前者定量限偏高，已與目前高靈敏度儀器不相符，且適用范圍不包含雞蛋基質，后者適用范圍缺少多西環(huán)素物質。目前文獻報道的方法主要有微生物法[7-10]、免疫檢測法[11-13]、毛細管電泳法[14-16]、薄層色譜法[17]、高效液相色譜法[1,3,18-24]、液質聯(lián)用法[25-30]，近年由于固相萃取柱(SPE)結合液相色譜串聯(lián)質譜儀的普及，以及其高通量、高靈敏度、高效率的特性，越來越成為殘留檢測的主要手段。現(xiàn)有國標及文獻報道的四環(huán)素類殘留檢測的提取液均以水相Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液為主，對于含有較細固體顆粒的樣品，極易造成在前處理過程中SPE小柱凈化濃縮時嚴重堵柱現(xiàn)象，無法繼續(xù)過柱，造成實驗失敗。部分國標或文獻采取部分提取液過柱的方法從而減少堵柱現(xiàn)象，但這大大降低了方法的靈敏度。本研究從優(yōu)化前處理過程：將提取液過快速濾紙，并在HLB小柱內(nèi)添加脫脂棉的方法，可將全部提取液凈化濃縮，從而提高方法靈敏度，為四環(huán)素類殘留的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 Waters Acquity UPLC - Xevo TQ-S 三重四極桿串聯(lián)質譜儀(配電噴霧離子源)(waters公司)；ES3200型天平(感量0.01 g)(METTLER公司)；S470-K型酸度計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；3K-30型臺式高速冷凍離心機(德國sigma公司)；TARGIN TECH VX-03多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；TTL-DC II型24位水浴氮吹儀；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；KQ 5800 B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；IKA MS3 Basic圓周振蕩器(廣州儀科實驗室技術有限公司)。

1.2 對照品與試劑 四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素標準品均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量分別為95.0%，97.6%，92.1%，85.2%。乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)，優(yōu)級純；磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)，分析純；檸檬酸(C6H8O7·H2O)，分析純。Mcllvaine-Na2EDTA緩沖鹽：將37.2 g C6H8O7·H2O，27.6 g Na2HPO4·12H2O，37.2 g Na2EDTA·2H2O溶于1000 mL水中，混勻即得。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，購自Fluck公司；HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，用前在管中加入適量脫脂棉)，天津市天興達科技有限公司；水為一級水。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 分別精密稱取4種四環(huán)素類藥物各約10 mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL四環(huán)素類藥物的標準貯備液。準確吸取0.1 mL標準貯備液至另一10 mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成10 μg/mL標準工作液。

1.3.2 樣品采集與制備 雞蛋采自超市，牛奶采自奶牛養(yǎng)殖基地。經(jīng)檢測均無四環(huán)素類藥物殘留。將雞蛋蛋清蛋黃均質勻漿，同牛奶分別置于50 mL離心管備用。

1.3.3 樣品前處理 提?。喝≡嚵? g(精確至±0.05 g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液10 mL，振蕩10 min，低溫(5 ℃)14000 r/min離心10 min，吸取上層液體于另一50 mL離心管中。重復用10 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取1次，合并提取液并混勻，低溫(5 ℃)14000 r/min離心10 min，取雞蛋試樣上清液備用；奶試樣上清液經(jīng)快速濾紙過濾后備用。凈化：固相萃取柱依次用甲醇、水各3 mL活化，備用液過柱，用水3 mL，5%甲醇(V/V)3 mL淋洗，抽干，甲醇3 mL洗脫，抽干，收集洗脫液于帶刻度的玻璃管中，于45 ℃下氮氣吹至液體小于1 mL，加30%甲醇至1.00 mL，渦旋混勻，溶液濃度超出曲線范圍時需用空白基質復溶液(按該處理方法處理空白樣品至“加30%甲醇至1.00 mL”混勻即得)稀釋至溶液濃度在曲線濃度范圍內(nèi)，過0.22 μm 微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

1.3.4 儀器條件 色譜參考條件：色譜柱為Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫條件

質譜參考條件：離子源：電噴霧(ESI)離子源；掃描方式：正離子；檢測方式：多反應離子監(jiān)測(MRM)；電離電壓：3.3 kV；錐孔電壓：25 V；源溫：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h；定性、定量離子對、離子源、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子及對應的錐孔電壓和碰撞能量

1.3.5 基質標準曲線的制備 準確量取標準溶液(1.3.1項)適量，用30%甲醇稀釋成濃度為100 ng/mL的標準中間液。分別準確量取標準中間液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL于空白基質洗脫液液中(空白基質洗脫液：按1.3.3項方法處理樣品至“甲醇3 mL洗脫”時所收集的液體即為空白基質洗脫液，下同)，并同樣品同步處理后供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。按對照溶液濃度及相應峰面積作標準曲線，并計算回歸方程及相關系數(shù)。

1.3.6 方法靈敏度確定 采用空白樣品中添加目標化合物的方法，依據(jù)特征離子質量色譜峰信噪比S/N≥3 的濃度為方法檢測限，S/N≥10的濃度為方法定量限，添加適量標準溶液于2 g空白試樣中，制備得到一定濃度的添加樣品，經(jīng)前處理后檢測，在相應的保留時間，空白試樣對所測藥物無干擾，測定靈敏度。

1.3.7 準確度和精密度的測定 采用標準添加法，分別準確稱取空白樣品2 g，添加一定體積的標準工作溶液，使樣品中各藥物濃度分別為LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL(土霉素、四環(huán)素及金霉素)與LOQ、2LOQ、10LOQ(多西環(huán)素)，按1.3.3項方法處理后進行測定，一日內(nèi)每種藥物每個添加濃度取5個平行樣品分別進行測定，重復測定3 d，外標法基質標準曲線定量，計算回收率和批內(nèi)、批間相對標準偏差(RSD)。

2 結果與分析

2.1 基質匹配標準曲線 準確量取濃度為100 ng/mL的混合標準中間液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL于空白基質洗脫液(1.3.5項)中，N2吹至小于1 mL，加30%甲醇至1.00 mL，充分混勻，過微孔濾膜，作為基質匹配標準溶液上機測定。以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，基質匹配標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，4種藥物的回歸方程及相關系數(shù)r見表3，由表3可見，4種藥物在5～100 μg/kg的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)r均大于0.9990。圖1為空白雞蛋中添加濃度為10 μg/kg的特征離子質量色譜圖。

表3 回歸方程相關系數(shù)

圖1 空白雞蛋中添加10 μg/kg四環(huán)素類藥物特征色譜圖

2.2 方法靈敏度 按1.3.3項所述方法進行處理，依據(jù)特征離子質量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢測限，S/N≥10的濃度為方法定量限，得出四環(huán)素類化合物在雞蛋及牛奶中的檢測限均為2 μg/kg，定量限均為5 μg/kg?？瞻纂u蛋中添加5 μg/kg四環(huán)素類藥物的特征離子質量色譜圖見圖2。

圖2 空白雞蛋中添加5 μg/kg四環(huán)素類藥物特征色譜圖

2.3 方法準確度及精密度 在空白雞蛋及牛奶中添加土霉素、四環(huán)素、金霉素的LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL及多西環(huán)素LOQ、2LOQ、10LOQ等不同濃度的添加量進行回收率實驗，結果匯總見表4、表5，可知，四環(huán)素類藥物在該添加濃度水平范圍內(nèi)，在雞蛋基質中回收率范圍為81.5%～110.0%之間，在牛奶基質中回收率81.2%～109.8%之間，批內(nèi)批間RSD均小于11.4%。結果表明本方法定量準確，重復性好。

表4 空白雞蛋中添加四環(huán)素類藥物回收率試驗結果

續(xù)表

表5 空白牛奶中添加四環(huán)素類藥物回收率試驗結果

3 討論與結論

3.1 提取溶劑及添加量的選擇 考慮到四環(huán)素類藥物具有較強的極性，易與金屬離子螯合形成配合物[31]，影響其溶解性，且易與生物樣品中的蛋白質形成共軛物，以上兩點造成提取困難，回收率低，同時還需考慮到沉淀蛋白的操作，因此，提取生物樣品時往往需加入金屬絡合劑和強酸或酸性去蛋白試劑，Mechael[32]等報道了沉淀蛋白的多種處理方式，如溶劑萃取、有機溶劑與酸性化合物混合提取、1%三氯乙酸等，本研究在考慮這些方法的同時，也考察了乙酸鋅和亞鐵氰化鉀(1∶1)、硫酸銨、低濃度硫酸水溶液等，均不同程度使回收率明顯降低，甚至無法檢測到目標物，例如加入硫酸水溶液，而有機溶劑易造成蛋白變性，提取率低。因此，擬采用含金屬絡合劑的酸性水相提取液。本方法參考了國家標準(GB/T 22990-2008、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-12-2008、GB/T 21317-2007)、美國農(nóng)業(yè)部FSIS官方的分析方法以及其他的相關文獻，提取液采用了Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)進行提取。依據(jù)GB/T 27404-2008實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測中附錄F檢測方法確認的技術要求，本研究對已制定最高殘留限量的四環(huán)素、土霉素、金霉素的添加量在LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL水平，對禁用物質多西環(huán)素的添加量在LOQ、2LOQ、10LOQ水平，且回收率均滿足該規(guī)范的要求。

3.2 凈化條件選擇 參照國標GB/T 21317-2007、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-12-2008等，本試驗優(yōu)先選擇規(guī)格為60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱，但在試驗過程中出現(xiàn)嚴重堵柱現(xiàn)象，通過對比Waters HLB與國產(chǎn)HLB固相萃取柱，同時采用低溫高速離心，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)HLB 柱過柱過程優(yōu)于Waters HLB。在過濾環(huán)節(jié)，本研究比較了定性濾紙與定量濾紙的差別，定量濾紙出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，而快速定性濾紙過濾效果明顯且過程順利，同時在凈化柱內(nèi)添加脫脂棉后，堵柱現(xiàn)象明顯改善，取得了滿意效果。但雞蛋過濾紙后，在過固相萃取柱時出現(xiàn)了嚴重堵柱現(xiàn)象，反而未過濾紙的提取液比較容易過萃取柱，考慮為雞蛋式樣中的脂溶性物質較多，利于試樣的過柱，故雞蛋采取提取液經(jīng)高速冷凍離心后直接過柱。此操作使得四環(huán)素類藥物在雞蛋及牛奶中回收率范圍在81.2%～110.0%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于11.4%，定量限為5 μg/kg。優(yōu)于E Yoshida[31]等報道 的牛奶基質中四環(huán)素類藥物回收率范圍為70%～120%、變異系數(shù)小于25%、定量限為10 μg/kg以及Michael[32]等報道的雞蛋基質中四環(huán)素類回收率范圍為45%～55%、定量限為10～50 μg/kg。凈化效果顯著。

3.3 質譜條件優(yōu)化 將適當濃度的四環(huán)素類單標溶液進樣，以正離子模式進行一級質譜圖掃描，發(fā)現(xiàn)各化合物的[M+H]+峰較強，選擇[M+H]+作為母離子，進行子離子掃描，并從中選擇響應值較高的兩個子離子分別是定量離子和定性離子。根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質至少需要3個識別點(IP)，因此，分別選擇了母離子以及對應的兩個響應較強的子離子作為定性定量依據(jù)，這樣一個母離子1個IP點，對應兩個子離子分別1.5個IP點，滿足3個IP點的要求，符合了歐盟有關法規(guī)的要求。另外，實驗比較了氮氣吹干后加1.00 mL 30%甲醇復溶及氮氣吹至小于1.00 mL后加30%甲醇定容至1.00 mL，后者方法回收率明顯提高，考慮原因為四環(huán)素類特別是多西環(huán)素藥物在高熱干燥的環(huán)境下分解速度加快。

4 實際樣品檢測

采用本方法對市場上購買的98批雞蛋及100批牛奶樣品進行檢測分析，結果顯示：9批雞蛋樣品檢出土霉素，結果為5.68～53.2 μg/kg，3份雞蛋檢出金霉素，結果為8.51～26.5 μg/kg，3批雞蛋檢出多西環(huán)素，結果為11.6～256 μg/kg。1批牛奶檢出多西環(huán)素，結果為11.1 μg/kg。說明在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中存在使用該類藥物的現(xiàn)象，此方法可用于雞蛋及牛奶中四環(huán)素類化合物殘留的測定，降低食品安全隱患。

本研究通過優(yōu)化樣品提取凈化分離條件，建立了利用液相色譜-串聯(lián)質譜檢測雞蛋及牛奶中四環(huán)素類藥物殘留量的方法，與國標GB/T 21317-2007及農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號公告-12-2008方法相比，提高了方法靈敏度，彌補了國標方法適用基質范圍窄的問題，重現(xiàn)性好，操作簡便，能夠滿足對雞蛋及牛奶中四環(huán)素類藥物殘留分析檢測，為獸藥殘留檢測工作提供技術支持。