和偉程，李 菊，張瀟文，劉方程，李瓊毅，柏家林，*

(1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室, 甘肅 蘭州 730030; 2.西北民族大學生命科學與工程學院)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美國首次報道，該病是由PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的豬群發(fā)生以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病。其臨床表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)或早產(chǎn)或產(chǎn)木乃伊胎，仔豬出生后1周內(nèi)死亡率超過25%，該病對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟影響。PRRSV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，與乳酸脫氫酶增高癥病毒、馬動脈炎病毒和猴出血熱病毒同屬動脈病毒科,其基因組全長約15kb，含有9個開放閱讀框(ORF)。ORF1a和ORF1b編碼14種不同的非結構蛋白(NSP1～NSP14)。ORF2a、2b、3、4、5、6和7分別編碼糖蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、膜糖蛋白GP5、基質(zhì)蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)等結構蛋白。PRRSV進入宿主細胞由多種分子介導，主要涉及CD163、CD151、唾液酸粘附素(sialoadhesin,Sn)和波形蛋白(vimentin)等多種蛋白參與。CD163和Sn在PRRSV感染中的作用研究較多，但CD151在PRRSV感染中的作用尚不清楚。CD151是四次跨膜蛋白(Tetraspanin)超家族成員，與癌癥增殖有關。研究已證明CD151參與提高細胞對PRRSV的易感性。然而這些研究都沒有提供證據(jù)表明異源CD151蛋白是否能夠支持PRRSV的復制增殖。2003年，David等人報道了一株源于棉鼠肺細胞的PRRSV易感細胞系(美國專利號20030219460)，這表明鼠源細胞可作為PRRSV增殖細胞系。本研究中我們使用大鼠心肌細胞系H9c2作為對象，研究異源蛋白CD151是否支持PRRSV的復制增殖。

1 材料和方法

1.1 細胞和病毒

MARC-145和H9c2細胞購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China center for type culture collection, CCTCC)。MARC-145細胞在含有10%胎牛血清(FBS, ThermoFisher Science, Logan, UT)的DMEM中培養(yǎng)，H9c2細胞在添加10%胎牛血清的MEM中培養(yǎng)。PRRSV毒株是西北農(nóng)林科技大學周恩民教授惠贈的MARC-145細胞適應株SD16(GenBank: JX087437.1)，病毒滴度為106.0 TCID50ml-1。根據(jù)PFU=0.7×TCID50計算噬斑形成單位(Plaque forming unit, PFU)。

1.2 抗體

鼠抗人CD163單克隆抗體(mAb)和鼠抗豬CD169 mAb購自ABD(Abd Serotec, 英國牛津)，小鼠抗波形蛋白mAb購自Sigma(Sigma Aldrich Inc., St Louis, USA)，兔抗CD151多克隆抗體(pAb)購自Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology Inc., 美國德克薩斯州)，二抗Alexa Fluor-488偶聯(lián)親和山羊抗鼠IgG(H+L)和CyTM3偶聯(lián)親和山羊抗兔IgG(H+L)購自Jackson免疫研究實驗室(美國賓夕法尼亞州Jackson ImmunoResearch Laboratory)。

1.3 RNA提取及RT-PCR

用TRIzol試劑(Takara, 中國大連)從H9c2和MARC-145細胞中提取總RNA，用高純度病毒RNA試劑盒(德國羅氏)提取細胞培養(yǎng)上清液中病毒總RNA。用隨機寡聚核苷酸引物、M-MLV逆轉錄酶(Takara, 中國大連)、模板總RNA 0.5 μg組成10 μL逆轉錄體系，反應條件為30℃、10 min；42℃、60 min；75℃、15 min，冰浴2 min。然后使用2.5 μl RT產(chǎn)物作模板在GeneAmp 2720熱循環(huán)儀(美國加州應用生物系統(tǒng)公司)上PCR擴增H9c2和MARC-145細胞中CD151、CD163、Vimentin和Sn及PRRSV N蛋白基因片段，程序為94°C變性10 min；95°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸60 s，25個循環(huán)；72°C變性10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。本實驗中使用的引物如表1所示。

表1 本研究中用于鑒定細胞受體和N基因轉錄本的引物

1.4 間接免疫熒光分析

H9c2和MARC-145細胞接種于玻片上，培養(yǎng)24 h后使用75%乙醇在4 °C固定30 min；然后用含1%牛血清白蛋白的PBS封閉1 h，PBS洗滌細胞；用相應一抗37°C孵育1 h，再用PBS洗滌細胞3次；熒光標記的二抗在37 °C孵育1 h。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole, DAPI; Sigma, MO, USA)室溫下染色5min，LeicaDMI6000B熒光顯微鏡(德國萊卡)觀察細胞中相關蛋白表達情況。

1.5 病毒吸附試驗

為了解PRRSV是否能與H9c2細胞結合，H9c2、MARC-145細胞與3 MOI PRRSV SD16在4℃孵育1 h，用預冷的PBS洗滌細胞5次，反復凍融3次后通過MARC-145細胞滴定法測定與H9c2細胞吸附的感染性病毒數(shù)量TCID50。

1.6 PRRSV感染試驗

將0.01 MOI PRRSVSD16接種于MARC-145和H9c2細胞，37℃孵育1 h后用預溫的培養(yǎng)液輕輕沖洗細胞，然后改用含3%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。于病毒接種后24 h、48 h、72 h和96 h收集細胞培養(yǎng)上清液或細胞裂解細胞，用RT-PCR檢測PRRSVN基因表達。檢測N基因的引物根據(jù)Wang文獻設計。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用GraphpadPRISM5.0程序進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)進行t檢驗以確定MARC-145和H9c2細胞中PRRSV SD16病毒滴度差異，組間統(tǒng)計學分析*表示P<0.05; **表示P<0.01; ***表示P<0.001。

2 結果與分析

2.1 H9c2細胞中受體的鑒定

本研究首先運用RT-PCR和間接免疫熒光技術檢測了這些分子在H9c2中的表達。RT-PCR在H9c2細胞中可檢測到CD151和波形蛋白的轉錄本，但未檢測到CD163和Sn的轉錄本(圖1)。免疫熒光分析結果顯示，CD151和波形蛋白在H9c2(圖2A和圖2D)細胞和MARC-145細胞(圖2F和圖2I)中均有表達，CD163僅在MARC-145細胞中表達(圖2B)，兩種細胞均不表達Sn蛋白(圖2C和2H)。

圖1 RT-PCR鑒定H9c2細胞受體

圖2 間接免疫熒光檢測在H9c2和MARC-145中細胞的PRRSV受體

2.2 PRRSV能夠吸附H9c2細胞

PRRSV進入宿主細胞的第一步是吸附宿主細胞。2012年Feng等人研究表明PRRSV可與CD151結合，因此本研究首先驗證了H9c2細胞是否能吸附PRRSV。4 ℃吸附試驗結果顯示H9c2和MARC-145細胞吸附PRRSV病毒量TCID50無顯著差異(P>0.05)，表明H9c2細胞可以吸附PRRSV病毒(圖3)。

圖3 H9c2和MARC-145細胞的病毒吸附實驗

2.3 PRRSV在H9c2細胞中復制

為了解病毒在H9c2細胞中的復制情況，將PRRSV SD16株以0.01MOI接種于H9c2和MARC-145細胞中，觀察病毒在H9c2和MARC-145細胞中的復制情況。感染后不同時間收集細胞上清和細胞裂解液進行RT-PCR分析。與MARC-145細胞相比，H9c2細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液中均未擴增出PRRSV N基因產(chǎn)物(圖4A和圖4B)。與RT-PCR結果一致，在整個感染過程中沒有觀察到CPE(數(shù)據(jù)未顯示)，這一結果提示PRRSV沒有在H9c2細胞中復制。

圖4 PRRSV在H9c2和MARC-145細胞中的復制

3 討論

本研究探討了H9c2細胞作為PRRSV體外培養(yǎng)新細胞模型的可能性。雖然H9c2表達CD151和波形蛋白，但病毒只能與H9c2細胞結合，不能在H9c2細胞中復制。由于PRRSV是影響?zhàn)B豬場的主要病原體之一，迫切需要找到適宜的細胞模型來研究病毒的致病機理，并開發(fā)更有效的疫苗。許多研究已經(jīng)證明PRRSV的細胞嗜性在一定程度上是由其細胞表面表達的一些蛋白質(zhì)決定的，如唾液粘附素、CD163、CD151和波形蛋白已被證明在使非易感細胞中對PRRSV感染易感中發(fā)揮作用。然而，由于易感性的限制，PRRSV體外只能在豬肺泡巨噬細胞(PAM)和MA-104及其衍生細胞系(MARC-145和CL2621)中增殖培養(yǎng)。

本研究首次在H9c2細胞中鑒定了唾液粘附素(也稱CD169)、CD163、CD151和波形蛋白的表達。H9c2細胞表達CD151和波形蛋白，但不表達CD163和Sn(圖1和圖2)。Provost等人發(fā)現(xiàn)的一種來源于猴腎細胞系SJPL，雖然其來源不是ST-Jude豬肺細胞，但它是PRRSV的易感細胞。該細胞系表達CD151，但不表達Sn和CD163，故CD151可能是PRRSV的結合蛋白。Hochdorfer等人證明CD151與人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)進入相關，我們檢測表明H9c2和MARC-145對PRRSV的吸附能力相同(圖3)。雖然靶細胞上病毒受體的存在是感染易感性的重要決定因素，但其他幾個細胞因素可能在決定病毒復制方面也起著關鍵作用。

CD151在BHK-21細胞對PRRSV的易感性中起重要作用，另外兩個新的易感細胞系SJPL和PEE細胞表達CD151。因此，我們想驗證H9c2細胞是否支持PRRSV復制。雖然H9c2細胞表達CD151和波形蛋白，但接種病毒24、48、72和96 h后H9c2細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液中均未檢測到N基因表達(圖4和圖5)。未能從H9c2中恢復感染性病毒可能是由于某些未知因素缺失或異源CD151的氨基酸序列不同所致。雖然IFA和RT-PCR檢測表明H9c2細胞表達CD151和波形蛋白，但PRRSV只能與其結合而不能進入細胞在其中復制。研究結果表明CD151和波形蛋白不是PRRSV病毒感染不可缺少的因子，可能還有其他分子參與PRRSV感染，H9c2不是適宜PRRSV感染的細胞模型，PRRSV感染細胞趨向性的主要機制仍有待進一步研究。