樊高薇,薛敬東,李警卓

陜西省中醫(yī)醫(yī)院急診科，陜西西安 710003

作為威脅人類健康的傳染性疾病之一，流行性感冒(簡稱流感)不僅發(fā)病率高，同時還有高傳染率、高病死率的特點，尚不能得到有效控制。我國是流感高發(fā)國家之一，我國流感病死率較高，1997年暴發(fā)的H5N1流感病死率高達66%～80%[1]；2009年新型甲型H1N1流感暴發(fā)，因其發(fā)病急，傳播范圍廣，影響了全球200多個國家和地區(qū)；目前流感的治療方式主要為抗病毒治療，疫苗接種的保護率低，且成本較高[2-3]。甲型H1N1流感病毒已經(jīng)成為引起重癥肺炎的病原體之一，而且甲型H1N1流感病毒感染導(dǎo)致的重癥肺炎往往容易進展為急性呼吸窘迫綜合征[2-4]，因此，開展抗甲型H1N1流感病毒藥物的研究仍具有重要意義。臨床常將連花清瘟顆粒用于上呼吸道感染的治療，在新型冠狀病毒肺炎疫情發(fā)生后，連花清瘟顆粒也被用來預(yù)防及治療新型冠狀病毒肺炎，并且取得了較好的治療效果，其可以廣譜抗病毒，通過調(diào)節(jié)多種信號通路抑制病毒對細(xì)胞的侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，在甲型H1N1流感病毒入侵機體的早期，機體會應(yīng)激產(chǎn)生干擾素，干擾素可與細(xì)胞膜特異性受體(IFNAR)結(jié)合[5]，激活Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號通路，使肺炎加重[6]，本研究旨在基于JAK/STAT信號通路，探究連花清瘟顆粒對甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠肺組織的保護效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 SPF級4～6周齡雌性BALB/c小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物許可證號為SCXK(粵)2019-0035，動物質(zhì)量合格證號為44007200052444。甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2儀器與試劑 連花清瘟顆粒購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒購自Thermo Fisher公司；實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購自TaKaRa公司；4%多聚甲醛購自Sigma公司；乙醚購自國藥化學(xué)試劑有限公司；高效RIPA組織裂解液、蛋白酶抑制劑、BSA封閉液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠IgG檢測試劑盒(ELISA)購自南京建成生物工程研究所；蛋白檢測試劑盒(BCA法)購自北京索萊寶科技有限公司；JAK1、STAT3酶標(biāo)兔多克隆抗體購自Sigma公司。二級生物安全柜購自Thermo Fisher公司；BSA223S電子天平購自Sartorius公司；ABI 7500 Real-Time PCR儀購自Applied Biosystems公司；倒置顯微鏡購自Leica公司；垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)印儀購自Bio-Rad公司；全自動數(shù)碼凝膠/化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；超純水儀購自ELGA公司；組織勻漿機購自天根生化科技(北京)有限公司；Tecan Infinite?200 Pro多功能酶標(biāo)儀購自Tecan公司；CUT5062型石蠟旋轉(zhuǎn)式切片機購自SLEE公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自Thermo Fisher公司。

1.3方法

1.3.1甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠模型的建立 將病毒原液稀釋至1、10、100、1 000、10 000倍，每個稀釋倍數(shù)對應(yīng)10只小鼠，通過滴鼻感染小鼠，每只小鼠感染病毒量為20 μL，觀察10 d后各組小鼠的存活情況。另取25只小鼠，每個稀釋倍數(shù)對應(yīng)5只，通過滴鼻感染小鼠，感染5 d后將小鼠用乙醚麻醉，然后摘下眼球，盡量流干血液，斷頸處死，解剖后取出全肺，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后吸干表面水分，稱取肺濕重，60 ℃烘箱內(nèi)放置24 h，稱取肺干重，根據(jù)肺濕干重比評價小鼠肺水腫情況，肺濕干重比值越大，肺水腫越嚴(yán)重。同時，取5只小鼠納入NC組，用同體積的生理鹽水滴鼻，5 d后稱取肺干重、濕重，計算肺濕干重比。根據(jù)造模病毒稀釋倍數(shù)選擇原則，模型鼠應(yīng)選擇有較低存活率(低于50%)，同時肺濕干重比顯著高于NC組的小鼠。

1.3.2分組及給藥干預(yù) 將30只小鼠隨機分為模型組(H1N1組)、連花清瘟顆粒組(LC組)、對照組，每組10只。將H1N1組、LC組小鼠用乙醚輕度麻醉后，用1.3.1確定稀釋倍數(shù)的造模病毒液滴鼻感染小鼠，對照組用同體積的生理鹽水滴鼻。根據(jù)連花清瘟顆粒的說明書，按5 g/kg的給藥劑量，將連花清瘟顆粒溶解后對LC組小鼠進行灌胃給藥5 d，然后再進行H1N1流感病毒液滴鼻造模，感染5 h后繼續(xù)給藥5 d；在LC組給藥的同時，對照組、H1N1組灌胃同體積生理鹽水。

1.3.3小鼠健康狀態(tài)觀察 自感染病毒后，觀察H1N1組、LC組、對照組小鼠健康狀態(tài)，包括毛發(fā)是否順滑，精神狀態(tài)，是否有咳嗽、呼吸困難等。

1.3.4肺組織JAK1、STAT3 mRNA表達水平檢測 感染病毒后5 d，將H1N1組、LC組、對照組小鼠用乙醚麻醉后進行解剖，取小鼠右肺組織約3 cm3，迅速放入無菌EP管中，液氮處理15 min，轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄-PCR試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，用qPCR檢測JAK1、STAT3 mRNA的表達水平，內(nèi)參基因為β-actin。JAK1正向引物5′-GCCAGTGCCCTGAGTTACTT-3′，反向引物5′-GTCTGGATCTTGCCTGGTCA-3′；STAT3正向引物5′-TGTGTGACACCATTCATTGATGC-3′，反向引物5′-TGCCCAGATTGCCCAAAGAT-3′。反應(yīng)體系：qPCR SuperMix 10 μL，正向引物、反向引物各0.4 μL,cDNA模板1 μL,加純水至反應(yīng)體系總體積為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt方法計算表達水平。

1.3.5肺病理組織觀察 取LC組、H1N1組、對照組小鼠左肺組織約3 cm3(避免鑷子劃傷組織)，將組織固定于4%多聚甲醛內(nèi)，24 h后更換多聚甲醛，按照常規(guī)方法對組織進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下觀察病理變化。

1.3.6肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平檢測 稱取對照組、LC組、H1N1組小鼠肺組織各50 mg，加入300 μL提前配制的組織裂解液，勻漿機內(nèi)充分?jǐn)噭颍?0 000×g離心10 min，吸取上清液，采用BCA法檢測蛋白，調(diào)節(jié)水平至100 mg/mL，SDS-PAGE電泳后進行轉(zhuǎn)膜，BSA封閉液封閉，孵育抗體，采用化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒檢測JAK1、STAT3蛋白表達水平。

1.3.7血清IgG水平檢測 將對照組、LC組、H1N1組小鼠摘取眼球后取血，4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜，11 800×g離心10 min，吸取上清液，按照小鼠IgG檢測試劑盒(ELISA)說明書檢測血清IgG水平。

2 結(jié) 果

2.1不同稀釋倍數(shù)病毒液感染后小鼠存活率變化 感染10 d后，NC組無死亡，存活率為100%；稀釋倍數(shù)為1的病毒液感染的小鼠全部死亡，存活率為0%；稀釋倍數(shù)為10、100的病毒液感染的小鼠存活率均為10%；稀釋倍數(shù)為1 000的病毒液感染的小鼠存活率為20%；稀釋倍數(shù)為10 000的病毒液感染的小鼠存活率為70%，根據(jù)小鼠存活率，可將10、100、1 000作為造模備選稀釋倍數(shù)。

每天統(tǒng)計不同稀釋倍數(shù)病毒液感染小鼠和NC組小鼠的死亡數(shù)，稀釋倍數(shù)為1的病毒液感染的小鼠第5天開始出現(xiàn)死亡，存活率持續(xù)下降，第9天存活率為0%；稀釋倍數(shù)為10、100、1 000的病毒液感染的小鼠第6天開始出現(xiàn)死亡，存活率持續(xù)下降；稀釋倍數(shù)為10 000的病毒液感染的小鼠第7天開始出現(xiàn)死亡，存活率一直保持較高水平，見圖1；因此，可在病毒感染第5天，保證小鼠未死亡的前提下觀察各項指標(biāo)。

圖1 不同稀釋倍數(shù)病毒液感染的小鼠及NC組小鼠存活率變化情況

2.2不同稀釋倍數(shù)病毒液感染5 d后小鼠肺濕干重比 感染5 d后，與NC組比較，稀釋倍數(shù)為1、10、100的病毒液感染的小鼠肺濕干重比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)造模病毒稀釋倍數(shù)選擇原則，最終選用稀釋倍數(shù)為100的病毒液進行造模，見表1。

2.3小鼠健康狀態(tài)觀察 對照組小鼠毛發(fā)順滑、光亮，精神狀態(tài)正常，無咳嗽、呼吸困難；H1N1組小鼠毛發(fā)凌亂、暗淡，精神萎靡，伴有咳嗽、呼吸困難；LC組小鼠毛發(fā)凌亂、暗淡，精神萎靡，但咳嗽癥狀相較于H1N1組有所改善。

表1 不同稀釋倍數(shù)病毒液感染5 d后小鼠肺濕干重比與NC組比較

2.43組肺組織JAK1、STAT3 mRNA的表達水平比較 與對照組比較，H1N1組、LC組JAK1、STAT3 mRNA表達水平明顯升高，而相較于H1N1組，LC組JAK1、STAT3 mRNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.5肺組織病理學(xué)變化 對照組小鼠肺組織正常，見圖3A；H1N1組小鼠肺組織出現(xiàn)充血、水腫現(xiàn)象，同時發(fā)生彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤，伴有上皮細(xì)胞脫落、壞死，發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞變形，見圖3B；LC組小鼠相較H1N1組小鼠肺組織水腫、充血現(xiàn)象減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，肺部病變得到緩解，但仍有局部肺泡間隔增厚，見圖3C。

注：A為3組JAK1 mRNA表達水平比較；B為3組STAT3 mRNA表達水平比較；*P<0.05。

注：A為對照組小鼠典型肺組織切片HE染色結(jié)果；B為H1N1組小鼠典型肺組織切片HE染色結(jié)果；C為LC組小鼠典型肺組織切片HE染色結(jié)果。

2.63組肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平比較 與對照組比較，H1N1組小鼠肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而LC組小鼠肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、5。

2.73組血清IgG水平比較 H1N1組小鼠血清IgG水平[(2.75±0.55)ng/mL]明顯高于對照組[(1.15±0.23)ng/mL]，LC組小鼠血清IgG水平為(8.44±0.68)ng/mL，明顯高于對照組、H1N1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為3組肺組織JAK1蛋白表達水平比較；B為3組肺組織STAT3蛋白表達水平比較；*P<0.05。

圖5 3組肺組織JAK1、STAT3蛋白Western blot圖

3 討 論

使用連花清瘟顆粒治療流感具有一定效果。有研究發(fā)現(xiàn)，服用連花清瘟顆?？捎行У挚辜仔虷3N2流感病毒感染，發(fā)揮預(yù)防作用[7]；還有研究以甲型H1N1流感病毒感染的BALB/c小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)服用奧司他韋與連花清瘟顆粒均對感染小鼠的肺指數(shù)提升有明顯的抑制作用[8]。通過查詢PubChem數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)連花清瘟顆粒在體內(nèi)發(fā)揮作用時可涉及細(xì)胞對外部刺激反應(yīng)的抑制、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等方面相關(guān)的140個靶蛋白，相關(guān)蛋白主要為蛋白激酶B、胱天蛋白酶3、絲裂原活化蛋白激酶1、腫瘤因子P53等[9]。同時研究發(fā)現(xiàn)，連花清瘟顆?？商岣咝∈篌w內(nèi)CD4+水平，可提高小鼠血清干擾素-γ的表達，增強小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，從而提高小鼠免疫功能[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，連花清瘟顆?？删徑饣颊呖人浴⒑粑щy等臨床癥狀，對流感的治療效果好，尤其在發(fā)病早期可以明顯減輕患者臨床癥狀，且效果優(yōu)于一般中成藥；而在治療甲型H1N1流感病毒感染方面，連花清瘟顆粒效果顯著，不良反應(yīng)少，安全性更高，同時還可作為預(yù)防用藥[11-14]。本研究結(jié)果顯示，使用連花清瘟顆粒干預(yù)后，甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀得到改善，肺組織切片鏡檢顯示炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，水腫及充血現(xiàn)象得到緩解，說明連花清瘟顆?？捎行ПＷo小鼠肺組織。同時，LC組小鼠血清IgG水平為(8.44±0.68)ng/mL，明顯高于對照組、H1N1組，提示使用連花清瘟顆粒治療可以增強小鼠免疫功能。

探討連花清瘟顆粒治療甲型H1N1流感病毒性肺炎的相關(guān)機制具有重要意義。JAK/STAT通路在甲型H1N1流感病毒性肺炎的進展中起著重要作用[5-6]。JAK1、STAT3蛋白是JAK/STAT信號通路的主要蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，脾臟中具有豐富的JAK1、STAT3蛋白，一旦JAK/STAT信號通路被激活，可直接及間接促進腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥發(fā)生[15-16]。此外，STAT3的高表達直接參與了皮膚病的發(fā)生，如有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者STAT3蛋白的表達顯著上調(diào)[17]；蕁麻疹患者JAK/STAT信號通路被激活，經(jīng)過有效治療后，STAT3 mRNA表達水平顯著下降，基因沉默JAK/STAT信號通路后，患者炎癥癥狀減輕[15,18]。JAK1是非受體酪氨酸激酶；STAT3是STAT家族一員，參與癌細(xì)胞的活化與增殖[19]。有研究指出，抑制STAT3的表達后，線粒體內(nèi)氧化磷酸化活性被抑制，組胺分泌減少，因此，近年來STAT3常作為研究過敏性疾病治療的新靶點[20]。本研究觀察小鼠肺組織JAK1、STAT3的基因轉(zhuǎn)錄及表達水平發(fā)現(xiàn)，采用連花清瘟顆粒干預(yù)后甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠肺組織JAK1、STAT3 mRNA表達水平均明顯降低，提示該藥物可能通過抑制JAK/STAT信號通路發(fā)揮增強小鼠免疫力，降低炎性反應(yīng)水平，保護小鼠肺組織的作用。連花清瘟顆粒在抗流感病毒感染方面有強大功效，在體外實驗中還可抑制流感桿菌，而且由于作用靶點多，所以不易產(chǎn)生耐藥性，其聯(lián)合奧司他韋治療對降低乙型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的作用優(yōu)于奧司他韋單獨治療[21]。

綜上所述，連花清瘟顆粒可以抑制甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠體內(nèi)JAK/STAT信號通路，增強小鼠免疫力，減少小鼠肺組織損傷。