孫爽　胡穎　陸晶宇　楊章旗　陳虎

摘要：? MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、代謝、應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)等生物過程發(fā)揮重要作用。為探究馬尾松R2R3-MYB基因結(jié)構(gòu)及功能，該研究以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為研究區(qū)域，從中篩選獲得了17個馬尾松R2R3-MYB基因，利用生物信息學對基因進行理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化樹等分析，同時利用熒光定量PCR技術(shù)分析基因的組織特異性以及在花發(fā)育時期和非生物脅迫下的表達模式。結(jié)果表明：（1）17個PmMYBs亞細胞定位于細胞核，均無跨膜結(jié)構(gòu)，且均含有Motif1、Motif2保守基序。系統(tǒng)發(fā)育進化樹將馬尾松PmMYBs劃分為9個亞家族，且與火炬松、白云杉等裸子針葉植物關(guān)系較近。（2）17個基因均屬于組成型表達，但在不同組織的表達量不同;所有基因均參與了花發(fā)育和非生物脅迫，不同基因在花發(fā)育不同時期的表達存在差異，有7個基因可能參與了雌雄性狀轉(zhuǎn)變;大部分基因響應(yīng)非生物脅迫上調(diào)表達，但響應(yīng)脅迫的時間存在差異;少數(shù)基因在脅迫中下調(diào)表達，尤其是PmMYB11基因在所有脅迫中均明顯下調(diào)表達。該研究較系統(tǒng)地分析了馬尾松R2R3-MYB基因的結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進化及其在花發(fā)育時期和非生物脅迫下的表達模式，為深入探究馬尾松R2R3-MYB基因的功能及逆境響應(yīng)機制提供了參考。

關(guān)鍵詞： 馬尾松， R2R3-MYB， 生物信息學分析， 非生物脅迫， 基因表達

中圖分類號：? Q943文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2022）04-0580-15

Characteristics， evolutionary and expression analysis?of R2R3-MYB genes in Pinus massoniana

SUN Shuang HU Ying LU Jingyu YANG Zhangqi CHEN Hu

（ 1.? Engineering Research Center of Masson Pine of State Forestry Administration， Engineering Research Center of Masson Pine of Guangxi，

Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation， Guangxi Forestry Research Institute， Nanning 530002，

China;

2. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541006， Guangxi，

China;

3. Forestry College of? Guangxi University， Nanning 530000， China ）

Abstract：? MYB transcription factors play important roles in plant growth and development，metabolism，responses to biotic and abiotic stresses. In order to explore the structure and function of R2R3-MYB genes in Pinus massoniana， we identified 17 R2R3-MYB genes based on the transcriptome dataset of P. massoniana， and then investigated their physical and chemical properties， phylogenetic relations， gene tissue specificity with qRT-PCR， and expression patterns of these genes in the development process of flower organs and under different abiotic stresses. The results were as follows： （1） Seventeen PmMYBs subcellular were predicted to locate in cell nucleus， without transmembrane structure. They all contained Motif1 and Motif2 conserved motifs. These 17 PmMYBs genes could be divided into nine subgroups according to phylogenetic analysis， which were closely related to gymnosperms such as Pinus taeda and Picea glauca. （2） The expression patterns of PmMYBs genes in different tissues and under salt stress， drought stress， lead stress and low temperature stress were validated by qRT-PCR. As a result， a total of 17 genes were constitutive expressed， but the expression levels were different in different tissues. All genes appeared to be involved in flower development. Seven MYB genes seemed to be involved in the transformation of male and female traits as they were differently expressed in different stages of flower development. Moreover， those genes may also be involved in abiotic stress responses， as most of the genes were up-regulated under abiotic stress. Their unique expression patterns may suggest that they function at different stages of stress. A few genes were down-regulated under stress， especially PmMYB11 gene. This study systematically analyzes the characteristics， evolutionary and expression patterns of R2R3-MYB genes in Pinus massoniana during flower development and abiotic stress， and provides a reference for further study on the function and stress response mechanism of R2R3-MYB gene in P. massoniana.

Key words： Pinus massoniana， R2R3-MYB， bioinformatics analysis， abiotic stress， gene expression

MYB類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量之多，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，該家族基因均含有一類特有保守結(jié)構(gòu)域，MYB結(jié)構(gòu)域由1～4個串聯(lián)且非重復的R基序組成（牛義嶺等，2016）。R基序是由50～53個氨基酸組成，折疊形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)（Kranz et al.，2010）。根據(jù)其含有MYB結(jié)構(gòu)域數(shù)量，可分為1R-MYB/MYB-related（1個R基序）、R2R3-MYB（2個R基序）、3R-MYB（3個R基序）、4R-MYB（4個R基序）四類（Dubos et al.，2010）。Wang等（2021）研究表明MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用，參與植物應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)等生物過程。小麥MYB10-D基因通過調(diào)控類黃酮途徑和增強ABA生物合成來延緩小麥發(fā)芽，從而提高發(fā)芽PHS（穗發(fā)芽 Pre-harvest sprouting）抗性（Lang et al.，2021）;AtMYB14能提高擬南芥抗寒能力（Chen et al.，2013）;蘋果MdMYB121基因能提高轉(zhuǎn)基因煙草對高鹽、干旱和低溫的抗逆性（曹忠慧，2013）。R2R3-MYB型是植物中存在最多的MYB轉(zhuǎn)錄因子亞型，目前已在擬南芥（Chen et al.，2006）、楊樹（ 馮波等，2017）等植物中鑒定出大量R2R3-MYB基因，其在植物激素響應(yīng)、逆境響應(yīng)等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。菠蘿多個R2R3-MYB基因受乙烯利處理誘導表達（陳哲等，2019）;穿心蓮ApMYBs可能通過ABA調(diào)控干旱脅迫（李靜宇等，2021）;擬南芥AtMYB74基因主要受RdDM途徑（RNA介導的DNA甲基化）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，應(yīng)答鹽脅迫（Xu et al.，2015）。

馬尾松（Pinus massoniana）是我國重要的鄉(xiāng)土速生用材樹種，具有一定耐旱、抗瘠薄能力（楊章旗等，2009; 譚健暉等，2017）。目前，干旱等各種非生物脅迫因子對林木生長和發(fā)育造成了嚴重影響，制約著林業(yè)生產(chǎn)發(fā)展。在馬尾松響應(yīng)干旱脅迫（全文選和丁貴杰，2017）、磷脅迫（王慶竹等，2019）等非生物脅迫的抗逆生理機理、抗逆基因克隆等方面取得一定進展。在生理水平上，馬尾松幼苗通過調(diào)整自身生長，減弱光合作用，同時調(diào)節(jié)抗氧化性酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及內(nèi)源激素含量等，抵御干旱脅迫（胡曉健等，2020;張金鳳等，2021）;在鋁脅迫下，馬尾松幼苗通過調(diào)節(jié)自身保護酶的合成，積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以抵御鋁脅迫（張盛楠，2016）。在分子水平上，馬尾松PmAOX基因與花發(fā)育過程及抗逆性有關(guān)（孫曉波等，2020），PmPAP1基因（吳艷等，2017）、PmMYB169基因（李慧平等，2018）、PmWRKY164基因（王慶竹等，2019）具有提高植株耐低磷脅迫能力。然而，對于馬尾松MYB基因應(yīng)答非生物脅迫響應(yīng)機制的研究相對匱乏。因此，通過對馬尾松MYB基因進行生物信息學、表達模式等分析，對闡明MYB基因的功能和調(diào)控機制具有重要意義。本研究以前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為研究區(qū)域，依托生物信息學軟件，采用熒光定量PCR分析方法，通過對PmMYBs基因的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化水平、表達模式等進行分析，擬探討以下問題：（1）馬尾松R2R3-MYB蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域等基因特征;（2）馬尾松R2R3-MYB蛋白的系統(tǒng)進化;（3）馬尾松R2R3-MYB基因在不同組織中的特異性表達水平;（4）馬尾松R2R3-MYB基因在花發(fā)育時期和不同非生物脅迫下的表達模式。通過本研究以期為進一步深入解析馬尾松R2R3-MYB基因功能及其在花發(fā)育和非生物脅迫過程中的響應(yīng)機制提供參考，同時為馬尾松抗性分子育種提供基因資源。

1材料與方法

1.1 實驗材料

不同組織（根、莖、葉）和非生物脅迫處理材料來自半年生馬尾松全同胞幼苗，不同發(fā)育時期花材料來自馬尾松種質(zhì)資源庫（南寧市林科所國家馬尾松良種基地，編號為桂GC105）的同一無性系。在雌雄球花現(xiàn)蕾期至成熟期階段，分5次采集不同發(fā)育階段的雌雄球花材料（編號為F1-F5、M1-M5）。雌球花樣品中，F(xiàn)1-F5對應(yīng)雌花發(fā)育初期（長2 mm）、前期（長 4 mm）、中期（長5 mm）、后期（長7 mm）、授粉期（長7 mm且已顯深紅色）5個階段。雄花樣品中，M1-M5對應(yīng)雌花發(fā)育初期（長2 mm）、前期（長3 mm）、中期（長5 mm）、后期（長7 mm）、授粉期（長9 mm且已顯深紅色）5個階段。雄花變異材料采集時間對應(yīng)雌球花發(fā)育的第2至第5個樣時期（編號為BT2-BT5）。

1.2 實驗處理

以半年生馬尾松全同胞幼苗為材料，幼苗生長于8 cm直徑的種植袋，培養(yǎng)基質(zhì)為椰糠∶黃心土∶泥炭土（6∶3∶1）。篩選生長一致的幼苗置于人工氣候箱中培養(yǎng)15 d適應(yīng)環(huán)境后（溫度27 ℃、相對濕度60%、光周期12 h），分別以300 mmol·L^-1NaCl、30% PEG-6000和10 mmol·L^-1Pb（NO₃）₂溶液對苗木進行鹽脅迫、干旱脅迫、鉛脅迫處理（姜國斌等，2007;劉菲等，2018;閆閃閃，2020;陳璇等，2021），低溫脅迫將苗木移至4 ℃人工氣候箱進行處理。根據(jù)預實驗結(jié)果，由于在脅迫第7天時，馬尾松幼苗存活率低，已到脅迫耐受末期，因此，本實驗在開始處理的第1天、第4天和第7天采集同一部位針葉樣本，以正常澆水處理作為對照，對照組每2 d澆1次水，每個處理30株苗，采集的所有樣品置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

RNA提取按多酚多糖植物RNA提取試劑盒說明進行（天根公司，北京），逆轉(zhuǎn)錄采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行（寶生物公司，大連），具體步驟按說明書進行，最終將所有樣品濃度調(diào)至50 ng·μL^-1。

1.4 數(shù)據(jù)來源

馬尾松序列來源于前期課題組馬尾松三代全長轉(zhuǎn)錄組、抗蟲轉(zhuǎn)錄組（Yang et al.，2016）、側(cè)枝分化轉(zhuǎn)錄組（Chen et al.，2021）和花發(fā)育轉(zhuǎn)錄組（未發(fā)表）;擬南芥、火炬松、白云杉的R2R3-MYB蛋白序列來源于PlantTFBD數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)。

1.5 馬尾松R2R3-MYB基因生物信息學分析

在以上轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，篩選R2R3-MYB基因，從Pfam數(shù)據(jù)庫下載MYB基因結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型（PF00249）后，使用HMMER軟件鑒定MYB基因，去除冗余序列和非全長序列后，利用NCBI BLAST進行序列比對，同時以NCBI檢索命名為依據(jù)，最終獲得了完整的17條R2R3-MYB蛋白序列。利用ExPASy在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/）分析基因分子質(zhì)量、等電點、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì);WoLF PSORT（https：//psort.hgc.jp/）進行亞細胞定位分析;TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu);SOPMA預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services /NetPhos/）分析磷酸化位點;MEGA 7軟件的Neighbor-Joining （NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并利用iTOL（https：//itol.embl.de/）美化進化樹;WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制保守區(qū)域特征圖;MEME（https：//meme-suite. org/meme/）分析基因保守基序，并利用TBtools（Chen et al.，2020）進行結(jié)果可視化。

1.6 實時熒光定量PCR

以上述處理所得植物樣本，利用Primer Premier 5設(shè)計基因熒光定量PCR引物（表1），以PmUBI4、PmCYP、PmTUBA基因分別作為組織特異性、 非生物脅迫、 花發(fā)育的內(nèi)參基因 （Chen et al.，2016）。QIAGEN的qRT-PCR檢測試劑盒進行熒光定量分析，根據(jù)說明書配制反應(yīng)體系。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min，1個循環(huán);95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，每樣品進行3次技術(shù)重復。使用2^-ΔΔCt法計算基因相對表達量，利用SPSS軟件進行方差分析，用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1 PmMYBs生物信息學分析

2.1.1 PmMYBs理化性質(zhì)分析以前期轉(zhuǎn)錄組所得數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，最終獲得了17個馬尾松R2R3-MYB基因，通過生物信息學軟件預測蛋白長度、分子質(zhì)量、等電點。表2結(jié)果顯示，PmMYBs蛋白編碼196（PmMYB13）～533（PmMYB8）個氨基酸;PmMYBs蛋白分子量在22.48（PmMYB13）～59.06（PmMYB8） kDa之間。PmMYBs蛋白理論等電點（pI）在4.83（PmMYB1）～9.72（PmMYB10）之間，平均pI為7.08，其中8個PmMYBs蛋白pI<7，為偏酸性;9個PmMYBs蛋白pI>7，為偏堿性。不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，屬不穩(wěn)定蛋白，17個PmMYBs蛋白中，僅PmMYB7平均疏水值>-0.5，為親水蛋白，其余均<-0.5，為疏水蛋白。所有基因亞細胞定位于細胞核，均無跨膜結(jié)構(gòu)（表2）。PmMYBs蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，說明無規(guī)則卷曲是PmMYBs蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成部分，其次是α螺旋，而延伸鏈和β轉(zhuǎn)角相對較少（表3）。利用NetPhos 3.1預測PmMYBs蛋白質(zhì)磷酸化位點，結(jié)果表明，各基因均存在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點，且磷酸化位點數(shù)為絲氨酸>蘇氨酸>酪氨酸（表4）。

2.1.2 PmMYBs系統(tǒng)進化與功能預測從PlantTFBD數(shù)據(jù)庫及NCBI數(shù)據(jù)庫下載擬南芥（AtMYB，44條）、火炬松（PtMYB，7條）、白云杉（PgMYB，13條）R2R3-MYB蛋白序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1）。參考擬南芥MYB基因家族的分類方法（Dubos et al.，2010），最終將17個PmMYBs劃分為9個亞家族，同一亞家族的基因具有較高的同源性，序列也具有相似性，且基因功能上可能存在相似性。進化樹顯示馬尾松與同為裸子植物的火炬松、白云杉進化關(guān)系相比被子植物擬南芥更近。擬南芥作為模式植物，其MYB基因的功能研究相對充分，基于擬南芥各亞家族基因的功能（喬孟等，2009; 樊錦濤等，2014），對PmMYBs基因進行功能預測：S2亞家族的PmMYB12，S11亞家族的PmMYB11，S13亞家族的PmMYB1、PmMYB8及S22亞家族的PmMYB6、PmMYB7和PmMYB9，以上4個亞家族的基因可能與生物脅迫和非生物脅迫有關(guān);S4亞家族成員的PmMYB5、PmMYB10、PmMYB13、PmMYB14、PmMYB22，S5亞家族的PmMYB30，S6亞族的PmMYB35及S16亞家族的PmMYB2、PmMYB4可能與初生和次生代謝如花青素的合成、類黃酮的合成有關(guān);S21亞家族的PmMYB3可能與植株的生長發(fā)育過程有關(guān)，如細胞壁合成、腋生分生組織發(fā)育等。

2.1.3 PmMYBs蛋白保守基序分析利用MEGA7和WebLogo對17個馬尾松R2R3-MYB分別進行多序列比對和保守區(qū)域特征圖繪制（圖2）。圖2結(jié)果表明，R2結(jié)構(gòu)包括3個極度保守的色氨酸（W），每兩個色氨酸殘基間隔19個氨基酸殘基。R3結(jié)構(gòu)包括2個極度保守的色氨酸（W），第一個色氨酸被苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）及亮氨酸（L）取代，第2個色氨酸和第3個色氨酸殘基間隔18個氨基酸殘基。除保守色氨酸外，在R2、R3結(jié)構(gòu)中還存在其他相對保守氨基酸，如R2結(jié)構(gòu)存在保守甘氨酸（G）、谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）、亮氨酸（L）、精氨酸（R）、賴氨酸（K）、絲氨酸（S）、半胱氨酸（C）、天冬酰胺（N）和脯氨酸（P）殘基;R3結(jié)構(gòu)存在保守谷氨酸（E）、組氨酸（H）、甘氨酸（G）、天冬酰胺（N）、異亮氨酸（I）、精氨酸（R）、蘇氨酸（T）、天冬氨酸（D）和賴氨酸（K）。以上這些氨基酸殘基與維持PmMYBs轉(zhuǎn)錄因子螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。

對保守基序分析發(fā)現(xiàn)，其中Motif1和Motif2為R2、R3結(jié)構(gòu)域，與用WebLogo繪制的特征圖一致（圖3）。圖3結(jié)果表明，6個保守基序中Motif5分布在N端， 僅Motif6分布在C端。各亞家族成員除都有Motif1、Motif2外，S4亞家族還含有Motif3、Motif4、Motif5;S6、S11、S13亞家族還含有Motif3、Motif4;S2、S5、S16亞家族還含有Motif4;Motif6是S22亞家族所獨有的。同一亞家族成員保守基序基本一致，說明其功能上可能既具有相似性，也存在同一亞家族蛋白保守基序不一致，這可能是進化過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生變異所致。

2.2 PmMYBs基因表達分析

2.2.1 PmMYBs基因組織表達特異性分析利用熒光定量PCR技術(shù)對PmMYBs基因雖在根、莖、葉中表達進行分析（圖4）。圖4結(jié)果顯示，PmMYBs各基因在不同組織中均被誘導表達，但表達水平存在差異，多數(shù)基因在根和莖中的表達水平最高，少數(shù)基因在葉中表達水平最高。其中，PmMYB2和PmMYB10均表現(xiàn)為葉中表達量最高，而莖和根中表達量較低;PmMYB4、PmMYB5、PmMYB9、PmMYB11、PmMYB12、PmMYB14、PmMYB22、PmMYB30和PmMYB35均表現(xiàn)為根中表達量顯著高于葉和莖中的表達量;PmMYB1、PmMYB3、PmMYB6、PmMYB7、PmMYB8和PmMYB13均表現(xiàn)為莖中表達水平最高，而葉和根中的表達量較低。

2.2.2 PmMYBs基因在雌雄球花發(fā)育中的表達特征采用熒光定量PCR技術(shù)檢測PmMYBs基因在雌雄球花發(fā)育中的表達特征，圖5結(jié)果顯示，在雄球花、雌球花及在雄花變異發(fā)育過程中，馬尾松MYB基因的表達模式存在差異。在雄花發(fā)育過程中10個PmMYBs基因（PmMYB2/3/4/6/10/12/13/14/30/35）在M1或M2階段（雄花發(fā)育初期）表達量最高，隨著花的發(fā)育表達量整體呈現(xiàn)降低趨勢;PmMYB8在M3階段（雄花發(fā)育中期）達到表達量最高值，為M1階段表達量的3.47倍，隨后2個階段逐漸下調(diào);3個PmMYBs基因（PmMYB1/7/9）整體呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在M4階段（雄花發(fā)育中后期）達到最高表達水平，PmMYB1和PmMYB9在雄球花M4階段是表達量很高，分別比M1階段上升16.1倍和5.9倍;3個PmMYBs基因（PmMYB5/11/22）在雄球花發(fā)育過程中呈現(xiàn)先上升后下降再上升，并在M5階段（雄花發(fā)育后期）到達最高值。在雌球花發(fā)育過程的表達情況：6個PmMYBs基因（PmMYB1/2/6/9/10/35）在F1或F2階段（雌花發(fā)育初期）表達水平最高，隨后降低;PmMYB7和PmMYB30均先呈現(xiàn)緩慢上升并在F3階段（雌花發(fā)育中期）表達量最高，隨后降低;7個PmMYBs基因（PmMYB3/4/5/8/12/13/22）在F4階段（雌花發(fā)育中后期）的表達量顯著高于其他階段。PmMYB11和PmMYB14到F5階段（雌花發(fā)育后期）表達量最高。在雄花變異發(fā)育過程的表達情況：PmMYB1、 PmMYB13和PmMYB35在雄花變異BT2階段（雄花變異發(fā)育初期）表達量最高，隨后逐漸降低，并在BT5階段上升;PmMYB5、PmMYB7、PmMYB11和PmMYB22在BT3階段（雄花變異發(fā)育中期）有很高的表達量，為BT2階段表達量的5.42倍、2.61倍、7.69倍、6.67倍，均顯著高于雄球花和雌球花各發(fā)育階段的表達水平;10個PmMYBs基因（PmMYB2/3/4/6/8/9/10/12/14/30）均在雄花變異BT5階段（雄花變異發(fā)育后期）有較高的表達水平?？梢姡R尾松MYB基因在花發(fā)育過程中的表達模式存在差異性。

2.3 PmMYBs基因在非生物脅迫下的表達分析

對PmMYBs基因在鹽脅迫、 干旱脅迫、鉛脅迫和低溫脅迫下表達模式進行研究，圖6結(jié)果顯示，PmMYBs基因在4種非生物脅迫處理下均被誘導表達，但不同基因在不同脅迫處理和脅迫時間下存在顯著差異。在鹽脅迫處理下，PmMYB1、PmMYB5和PmMYB22基因均在第1天表達量比對照明顯上調(diào)表達，隨后下調(diào)表達。PmMYB2、PmMYB3、PmMYB4、PmMYB6、PmMYB7、PmMYB9、PmMYB10、PmMYB30和PmMYB35基因均在脅迫第4天時表達量達到最高值，分別為對照的12.39倍、11.12倍、1.13倍、7.13倍、3.92倍、7倍、5.19倍、1.9倍和1.61倍，整體呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)趨勢。PmMYB14基因在鹽脅迫第7天表達水平最高，并顯著高于對照及脅迫第1天和第4天的表達。以上13個基因?qū)}脅迫都有明顯響應(yīng)，而PmMYB8、PmMYB11、PmMYB12和PmMYB13基因在鹽脅迫處理下，整個過程表達量均明顯低于對照，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。

在干旱脅迫處理下，PmMYB1、PmMYB5、PmMYB9、PmMYB10、PmMYB12、PmMYB13、PmMYB14、PmMYB30、PmMYB35基因在脅迫第1天相對表達量呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢并到達最高值，隨后下調(diào)表達。PmMYB2、PmMYB4、PmMYB6和PmMYB7基因在脅迫第4天表達量達到最高值，呈現(xiàn)顯著增高趨勢，分別為對照的14.38倍、2.73倍、7.02倍和4.99倍，整體呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)趨勢。PmMYB3基因隨脅迫處理的進行上調(diào)表達并在干旱脅迫第7天到達最高值。而PmMYB8、PmMYB11和PmMYB22基因在干旱脅迫處理下呈現(xiàn)明顯下調(diào)表達。

在鉛脅迫處理下，PmMYB3、PmMYB12和PmMYB14基因在脅迫第1天表達量到達最高值。PmMYB1、PmMYB2、PmMYB5、PmMYB6、PmMYB7、PmMYB8、PmMYB10和PmMYB35基因先上調(diào)表達并在鉛脅迫第4天表達量達到最高值，隨后表達水平降低。在脅迫第7天，PmMYB9和PmMYB30基因表達量達到最大值，以上基因在鉛脅迫處理下均表現(xiàn)為上調(diào)表達。而PmMYB4、PmMYB11、PmMYB13和PmMYB22基因在鉛脅迫處理過程中下調(diào)表達，其中PmMYB13基因在脅迫第1天下調(diào)表達，第4天上調(diào)表達到對照水平，隨后又下調(diào)表達。

在低溫脅迫處理下，PmMYB3、PmMYB4、PmMYB5、PmMYB6、PmMYB9、PmMYB12、PmMYB13、PmMYB14、PmMYB22、PmMYB30、PmMYB35基因在低溫脅迫第1天表達量到達最高，隨后下調(diào)表達。PmMYB2和PmMYB7基因在低溫脅迫第4天表達量最高。PmMYB1和PmMYB10基因在脅迫過程中上調(diào)表達并在脅迫第7天表達量到達最高值。而PmMYB8和PmMYB11基因在整個過程為下調(diào)表達。

綜上所述，17個馬尾松R2R3-MYB基因在4種非生物脅迫處理下均被誘導表達，其中PmMYB2基因在各處理下均呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達，而PmMYB11基因在所有脅迫中均下調(diào)表達。由此推測，上述17個基因均可能參與馬尾松應(yīng)答鹽脅迫、干旱脅迫、鉛脅迫及低溫脅迫。

3討論與結(jié)論

本研究通過生物信息學分析獲得了17個馬尾松R2R3-MYB基因，并對其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化等進行分析。理化性質(zhì)分析顯示，半數(shù)R2R3-MYB蛋白質(zhì)偏酸性，均屬于不穩(wěn)定蛋白外，除PmMYB7為親水蛋白外，其余均為疏水蛋白。亞細胞定位結(jié)果顯示均位于細胞核，這與宋婉玲等（2021）研究結(jié)果一致，表明基因主要在細胞核內(nèi)行使功能。17個R2R3-MYB蛋白含有R2和R3典型結(jié)構(gòu)域，說明本研究基因均為R2R3-MYB類。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，將PmMYBs劃分為9個亞家族，并發(fā)現(xiàn)PmMYBs基因與火炬松、白云杉關(guān)系較近，這與蔡瓊等（2016）研究結(jié)果馬尾松PmPIP1與挪威云杉親緣關(guān)系最近一致，說明裸子植物親緣關(guān)系較近。保守基序分析發(fā)現(xiàn)在同一亞家族基因所含有保守基序基本一致，這與越橘（Vaccinium corymbosum ‘Jersey）R2R3MYB類基因分析結(jié)果一致（宋楊等，2015），同時越橘S5和S4家族成員基因分別在越橘果實發(fā)育過程中表達模式基本一致。因此推測，同一亞家族基因功能具有相似性。

馬尾松R2R3-MYB基因在不同組織和雌雄球花發(fā)育不同階段的表達模式不同。大部分基因在根和莖中表達水平偏高，推測可能在根和莖發(fā)育中具有重要功能;同時發(fā)現(xiàn)同一亞家族基因在各組織中表達模式相同，這與楊梅MYB基因組織表達特異性結(jié)果基本一致（Cao et al.，2021），進一步表明同一亞家族成員可能具有相似的功能。李戌彥等（2021）研究發(fā)現(xiàn)不同MYB基因可能具有調(diào)控不同發(fā)育時期山楂花色的功能，本研究發(fā)現(xiàn)不同R2R3-MYB基因可能參與不同階段雌雄球花發(fā)育過程。在雄球花發(fā)育過程中，10個基因在M1和M2階段（發(fā)育初期）表達量最高，隨后表達降低;在雌球花發(fā)育過程中分別有6個和7個基因在F1、F2和F3階段（發(fā)育初中期）表達量最高，說明馬尾松R2R3-MYB基因在花發(fā)育初期和中期以及花粉形成過程中發(fā)揮重要作用，這與亞洲百合（王雪倩等，2019）、山楂花（李戌彥等，2021）研究結(jié)果類似。在雄花變異發(fā)育過程中10個基因在最后一個階段BT5（發(fā)育后期）表達量最高，7個基因在發(fā)育初期表達量最高，推測7個基因在雌雄性狀變異過程中發(fā)揮作用，而后表達量高的10個基因行使了雌球花發(fā)育的功能。綜上結(jié)果顯示，同一亞家族的基因在花發(fā)育過程中表達模式會存在差異，表明不同馬尾松R2R3-MYB基因在花的不同發(fā)育階段中可能發(fā)揮不同的生理及調(diào)節(jié)作用。

馬尾松R2R3-MYB基因在非生物脅迫下的表達分析結(jié)果顯示，馬尾松R2R3-MYB基因響應(yīng)多種脅迫處理，大部分馬尾松R2R3-MYB基因在脅迫第1天和第4天響應(yīng)表達，在處理后期表達降低，表明這些基因為前期調(diào)控基因;而少數(shù)基因在脅迫第7天表達最高，因此推測不同基因在各脅迫過程中行使不同的功能。其中大部分基因?qū)γ{迫處理存在響應(yīng)，這與草莓（Li et al.，2021），木麻黃（Wang et al.，2021）研究基本一致。本研究通過與擬南芥構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，馬尾松S21亞家族的PmMYB3與擬南芥S21亞族的AtMYB117和AtMYB52聚為一類，Park等（2011）研究表明AtMYB52基因過表達株系抗旱、耐鹽且參與ABA應(yīng)答，與此相同的是本研究結(jié)果顯示PmMYB3在4個非生物脅迫下均會上調(diào)表達，因此認為PmMYB3正向調(diào)控4種非生物脅迫，且可能參與ABA信號通路轉(zhuǎn)導。同理，本研究中馬尾松S22亞家族的3個基因在脅迫下均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，與車永梅等（2021）研究結(jié)果一致，表明S22亞家族基因參與生物脅迫和非生物脅迫，進一步表明同一亞家族成員可能具有相似功能。S13亞家族的PmMYB1、PmMYB8與擬南芥S13亞家族的AtMYB86和AtMYB50相近，因此認為PmMYB1、PmMYB8可能與抗旱、鉛耐受等有關(guān)（任永兵，2010），在本研究中PmMYB1基因正向調(diào)控應(yīng)答4種非生物學脅迫，而PmMYB8僅在鉛脅迫中表達水平升高為正向調(diào)控，在其他3個脅迫下均表達量低于對照為負向調(diào)控，表明同一亞家族的2個基因表達模式有很大不同。在蘋果研究中有類似結(jié)果，蘋果S22亞家族的MdMYB155能被NaCl、PEG及低溫脅迫所誘導，而同一家族的MdMYB185只能被PEG脅迫所誘導（曹忠慧，2013），說明同一亞家族的基因功能上可能存在差異性。在鹽脅迫下擬南芥S11亞家族的AtMYB102基因被誘導表達（Mito et al.，2010），本研究中S11亞家族的PmMYB11在4個非生物脅迫處理中均下調(diào)表達，起負調(diào)控作用，這與AtMYB102基因表達模式相反，因此推測由于物種間差異較大，因此基因的功能可能存在差異。S5亞家族基因可能與類黃酮合成、根發(fā)育有關(guān)（劉忠麗等，2012），本研究結(jié)果顯示PmMYB30基因在根中的表達量明顯高于葉和莖中的表達，說明PmMYB30基因可能與根的發(fā)育有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)PmMYB30基因均正向調(diào)控4種脅迫，PmMYB30基因是否參與類黃酮的合成有待進一步研究。擬南芥AtMYB15基因負調(diào)控CBFS基因表達，使得植株抗寒性降低（Agarwal et al.，2006），本研究中S2亞家族的PmMYB12基因在低溫脅迫下顯著上調(diào)表達，推測PmMYB12基因在馬尾松抵御冷脅迫過程中發(fā)揮重要作用。S6和S16亞家族的PmMYBs可能與花青素的合成有關(guān)（ Huang et al.，2015; Velten et al.，2017），S4亞家族的PmMYBs可能參與木質(zhì)素的合成（Kim，2016），結(jié)合本研究結(jié)果，這3個亞家族的多數(shù)基因正向響應(yīng)非生物脅迫，而這些PmMYBs基因是否參與花青素和木質(zhì)素的合成，有待進一步深入研究。綜合上述結(jié)果，17個馬尾松R2R3-MYB基因參與干旱等4種非生物脅迫，但在各脅迫處理過程中的表達水平、表達模式都各不相同，說明基因家族響應(yīng)脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復雜多樣，多種模式相互作用，以抵御逆境。

目前，裸子植物的R2R3-MYB基因功能研究相對較少，關(guān)于馬尾松R2R3-MYB基因在生長發(fā)育調(diào)控及應(yīng)答非生物脅迫的響應(yīng)機制還不清楚。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組獲得馬尾松R2R3-MYB基因，并對其進行了生物信息學及表達模式分析，為深入研究PmMYBs參與花發(fā)育和應(yīng)答非生物脅迫的分子機制提供參考和理論基礎(chǔ)。

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（責任編輯蔣巧媛）