生物合成高能化學(xué)物質(zhì)

2022-05-12 07:52陳子鵬趙鈺沁王宸王秀秀魏煒趙勁

大學(xué)化學(xué) 2022年3期

陳子鵬，趙鈺沁，王宸，王秀秀，魏煒，趙勁,＊

1南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京 210023

2南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023

2020年9月，習(xí)近平總書記在第75屆聯(lián)合國大會(huì)一般性辯論上提出，中國力爭2030年實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰，并努力爭取2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和[1]，2021年的政府工作報(bào)告中，這一重大戰(zhàn)略決策再度被提及[2]。對于實(shí)現(xiàn)“碳中和”目標(biāo)，生物合成技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用起到不可或缺的作用[3]，與化學(xué)合成相比，生物合成可以實(shí)現(xiàn)從原料源頭上降低碳排放。生物合成依賴于各種酶，酶催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)條件溫和，并且生成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)專一[4]，可以實(shí)現(xiàn)較好的原子經(jīng)濟(jì)性，并降低能耗[5]。目前，世界上主要的能源供應(yīng)來源于化石燃料，其他高能物質(zhì)的生產(chǎn)也依賴于化學(xué)合成，污染高，碳排放量大。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)，自然界中存在可以合成能源物質(zhì)、含能材料的生物，并已經(jīng)破解出相當(dāng)一部分生物合成途徑[6,7]，這將為人們更好地應(yīng)用生物合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排指明方向。

本文將從能源物質(zhì)、含能材料和天然高能物質(zhì)三個(gè)方面入手，選取氫氣、丁三醇、氧化偶氮化合物和多聚磷酸鹽幾種代表性高能物質(zhì)，分析討論它們的生物合成途徑以及與之相關(guān)的關(guān)鍵金屬酶。

1 能源物質(zhì)的生物合成——?dú)錃?/h2>
能源物質(zhì)中，氫氣是當(dāng)之無愧的清潔能源，但基于裂解水的制氫技術(shù)耗能較高，并且設(shè)備容易腐蝕，基于石油/煤化工的制氫技術(shù)碳排放高[8]，幸運(yùn)的是，自然界中存在具有產(chǎn)氫能力的氫化酶(Hydrogenase)，對這類酶的研究為制氫工業(yè)開辟了一條新的道路。
氫化酶是金屬酶，根據(jù)其金屬離子的不同可分為[Fe]氫化酶、[NiFe]氫化酶和[FeFe]氫化酶三種[9]。[Fe]氫化酶是一種不含鐵硫簇的氫化酶，具有FeGP輔因子，這種酶存在于產(chǎn)甲烷菌中，可逆地催化methenyltetrahydromethanopterin(methenyl-H4MPT+)與氫氣反應(yīng)，產(chǎn)生methenyl-H4MPT和一個(gè)質(zhì)子(圖1)[10-13]，Methenyl-H4MPT+是產(chǎn)甲烷菌的一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移中間體，這一反應(yīng)是產(chǎn)甲烷菌中將CO2還原成CH4代謝通路的中間環(huán)節(jié)，該反應(yīng)的順利進(jìn)行維系了產(chǎn)甲烷菌的能量代謝過程。
圖1 (a)[Fe]氫化酶的晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:3DAG)[10]；(b)FeGP輔因子；(c)[Fe]氫化酶所催化的可逆產(chǎn)氫反應(yīng)[13]
[FeFe]氫化酶和[NiFe]氫化酶具有鐵硫簇，[FeFe]氫化酶還具有H簇(圖2a)[14,15]。[FeFe]氫化酶存在于厭氧菌中，目前Stripp課題組[16]已闡明其產(chǎn)氫的質(zhì)子傳遞機(jī)理，即當(dāng)缺乏天然發(fā)色團(tuán)的高活性鐵硫酶經(jīng)過光還原后，活性位點(diǎn)輔助因子(H簇)的堿度增強(qiáng)，引發(fā)了不連續(xù)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(圖2b)。
圖2 (a)[FeFe]氫化酶的結(jié)構(gòu)(PDBID:3C8Y)[15]；(b)[FeFe]氫化酶中與質(zhì)子遷移相關(guān)的氨基酸殘基與輔基[16]
[NiFe]氫化酶存在于細(xì)菌和古菌中，這種氫化酶更偏向于將氫氣裂解為質(zhì)子與氫負(fù)離子[17,18]。大腸桿菌中也存在[NiFe]氫化酶，這種酶屬于FHL復(fù)合體，是大腸桿菌厭氧發(fā)酵物產(chǎn)生氫氣的來源(圖3)[19]。
圖3 (a)[NiFe]氫化酶的活性位點(diǎn)[10]；(b)FHL復(fù)合體的結(jié)構(gòu)[19]
在氫化酶產(chǎn)氫的研究實(shí)踐中，研究人員通常將氫化酶與無機(jī)催化劑聯(lián)用，構(gòu)建生物-無機(jī)雜化催化體系(Bio-inorganic hybrid catalytic system)，從而提高酶的產(chǎn)氫效率[20]。由于半導(dǎo)體具有本多-藤島效應(yīng)[21]，研究人員常將半導(dǎo)體與氫化酶聯(lián)用，構(gòu)建半人工光合體系，例如Honda團(tuán)隊(duì)[22]通過在大腸桿菌中表達(dá)[FeFe]氫化酶同時(shí)外加納米TiO2實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)氫，浙江大學(xué)唐?？祱F(tuán)隊(duì)[23]以綠藻為產(chǎn)氫底盤生物，通過向綠藻中加入無定形SiO2引起綠藻硅礦化聚集成生物小球，并加入WO3引發(fā)氫氣產(chǎn)生，南京大學(xué)趙勁和魏煒團(tuán)隊(duì)[24]通過在大腸桿菌表面展示PbrR金屬蛋白使之原位合成CdS半導(dǎo)體量子點(diǎn)并同時(shí)表達(dá)氫化酶Hya，從而實(shí)現(xiàn)大腸桿菌光催化產(chǎn)氫。上海交通大學(xué)樊春海院士團(tuán)隊(duì)[25]通過外加Mg(OH)2誘導(dǎo)綠藻聚集，實(shí)現(xiàn)長期連續(xù)產(chǎn)氫。電催化是制氫的常用策略，也有研究人員將電極或電催化劑與氫化酶聯(lián)用，促進(jìn)產(chǎn)氫[26,27]。
同時(shí)，研究人員也不斷嘗試對產(chǎn)氫酶進(jìn)行人工改造，或嘗試模擬氫化酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)新型產(chǎn)氫催化劑。潘惠杰等[28]模擬[Fe]氫化酶的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了一種新型Mn配合物催化劑，吳驪珠院士團(tuán)隊(duì)[29]模仿[NiFe]氫化酶的活性中心，構(gòu)建了一種NiRu-RuNi二聚體金屬簇催化劑。Armstrong團(tuán)隊(duì)[30]通過將[NiFe]氫化酶口袋中的半胱氨酸替換成硒代半胱氨酸，大大提升了氫化酶的催化效率和氧氣耐受能力。
隨著生物產(chǎn)氫研究的不斷深入，人們對氫化酶的理解不斷加深，將極大促進(jìn)生物產(chǎn)氫從實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)界的轉(zhuǎn)變。特別是生物-無機(jī)雜化催化體系的應(yīng)用，將推動(dòng)產(chǎn)氫技術(shù)不斷向低能耗與低污染前進(jìn)。

2 含能材料的生物合成——1,2,4-丁三醇和氧化偶氮化合物

含能材料(Energetic materials)是指一種或多種化合物，具有易燃或易爆官能團(tuán)，會(huì)劇烈氧化釋放大量能量和遠(yuǎn)超自身體積的氣體[31]。含能材料在民間及軍事上存在很多用途，但其生產(chǎn)主要依賴化學(xué)合成[32]，如著名的梯恩梯炸藥(三硝基甲苯，TNT)、黑索金炸藥(環(huán)三亞甲基三硝胺，RDX)和奧托金炸藥(環(huán)四亞甲基四硝胺，HMX)的生產(chǎn)，需要消耗大量硫酸、硝酸對底物進(jìn)行硝化，生產(chǎn)過程的危險(xiǎn)性較高。近年來隨著生物合成技術(shù)的發(fā)展，含能材料的生物合成也正在啟動(dòng)。

2.1 丁三醇及衍生物

1,2,4-丁三醇(Butane-1,2,4-triol，BT)是一種具有極高價(jià)值的有機(jī)合成中間體，尤其是其可以作為高能燃料和炸藥的前體物質(zhì)。其硝化產(chǎn)物1,2,4-丁基三硝酸酯(BTTN)具有低溫力學(xué)性、沖擊穩(wěn)定性和使用安全性等特點(diǎn)，在武器固體推進(jìn)劑和發(fā)射藥配方中有著極其重要的作用，被視為傳統(tǒng)硝酸甘油的理想替代品[33-38]。諾貝爾發(fā)明炸藥以來，硝化甘油一直在工業(yè)和各種含能材料中占主要地位[36]。因此，為了實(shí)現(xiàn)這一“替代”，BT得到了國內(nèi)外科研工作者的普遍關(guān)注。

目前BT的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用NaBH4還原蘋果酸二酯、Rb/C催化蘋果酸加氫、馬來酸二乙酯/Cu/Cr催化加氫等化學(xué)合成[39,40]。這些方法的工藝條件苛刻，且采用的高壓催化加氫等相對危險(xiǎn)，合成過程中涉及到的汞鹽和大量酸性溶劑會(huì)對環(huán)境有極大的污染。反應(yīng)條件溫和、安全系數(shù)高、對環(huán)境友好的生物合成法成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。

自然界中暫時(shí)還未發(fā)現(xiàn)天然的BT生物合成途徑[36]，但通過合成生物學(xué)方法對天然微生物進(jìn)行改造，BT的生物合成得以實(shí)現(xiàn)。2003年，F(xiàn)rost團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道利用假單胞桿菌和大腸桿菌兩種微生物，以木糖和阿拉伯糖為底物，經(jīng)四步酶促反應(yīng)合成BT[36](圖4)。

圖4 四步酶促法合成BT[36]

迄今為止，以木糖為底物的四步酶促反應(yīng)法仍是最高效的BT生物合成途徑[41]?，F(xiàn)研究人員將BT合成的4個(gè)關(guān)鍵酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，大大簡化了流程工藝[34]。但常用的大腸桿菌宿主存在嚴(yán)重的碳代謝抑制(CCR)，限制了工程菌在混合糖下生長和合成BT[41]，相比而言，克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)由于其生長速度更快，對混合糖的利用率更高[42,43,44]，可以作為優(yōu)化生物合成途徑的首選菌株。其他優(yōu)化手段還包括：(1)敲除旁路基因，抑制分支反應(yīng)；(2)過表達(dá)關(guān)鍵酶；(3)引入分子伴侶蛋白GroES等進(jìn)行輔助折疊；(4)采用反義RNA微調(diào)木糖代謝流以及弱化葡萄糖效應(yīng)。經(jīng)過深入研究，確定了四步反應(yīng)的限速步驟為脫羧步驟，并以優(yōu)化該步的酶菌為重點(diǎn)，使得MDLC、KDCA、kivD等都較過去的催化酶而言有不同程度的提升[45]。此外，底物濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)也都有一定的影響，通過篩選條件進(jìn)行適度優(yōu)化，提高BT生產(chǎn)效率。

2.2 氧化偶氮化合物

氧化偶氮化合物(Azoxy compound)是另一類重要的含能材料，這種含能材料中含有氧化偶氮鍵(azoxy bond，圖5a)，可作為高爆炸藥使用。氧化偶氮鍵的引入可以提高含能材料的密度，并增加含能材料的穩(wěn)定性，使材料的運(yùn)輸、使用更加安全[32,46]。其中，代表性的化合物為4,4’-二氨基-3,3’-氧化偶氮呋咱(3,3’-diamino-4,4’-azoxyfurazan，DAOAF)和4,4’-二硝基-3,3’-氧化偶氮呋咱(3,3’-dinitro-4,4’-azoxyfurazan，DNOAF)(圖5b，5c)[46-48]。這兩種化合物及其衍生物構(gòu)成了主要的氧化偶氮基含能材料[32,48-50]。

圖5 (a)氧化偶氮鍵；(b)DAOAF；(c)DNOAF

除了可用作含能材料外，氧化偶氮化合物還有許多其他功能，例如苯基氧化偶氮化合物可作為液晶材料使用[51]。然而，用作高能材料或液晶材料的氧化偶氮化合物幾乎完全依賴化學(xué)手段進(jìn)行合成，經(jīng)典的合成方法是，使用OXONETM氧化劑或者H2O2氧化前體中的氨基，并使之形成氧化偶氮鍵[52-55]。近年來，通過電化學(xué)催化將硝基苯衍生物氧化成氧化偶氮鍵的方法也層出不窮[56,57]。

氧化偶氮化合物除了可以通過人工化學(xué)合成獲取外，部分天然產(chǎn)物中也含有氧化偶氮結(jié)構(gòu)基元[58]，這些天然產(chǎn)物具有諸如抗菌、抗癌等生物活性，而它們的合成途徑目前沒有完全破解。浙江大學(xué)李永泉團(tuán)隊(duì)[59]在氧化偶氮化合物生物合成途徑的研究中做出了重要的貢獻(xiàn)，他們對苯基氧化偶氮類天然產(chǎn)物——氧化偶氮霉素的生物合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，并挖掘出了關(guān)鍵的金屬酶。

氧化偶氮霉素(Azoxymycins)是李永泉課題組在恰塔努加鏈霉菌L10(Streptomyces Chattanoogensis L10)培養(yǎng)物中分離出的含有氧化偶氮鍵的新型天然產(chǎn)物，分A、B和C三種，通過多維核磁、同位素取代、液相色譜、質(zhì)譜與紫外光譜法確定了這三種天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)(圖6)。鑒于氧化偶氮霉素中含有苯多烯結(jié)構(gòu)，研究人員推定合成途徑中可能存在與酮合成酶AsuC13/14同源的酶，并通過Native BLAST分析了S.Chattanoogensis L10的基因組序列，給出了推定的氧化偶氮霉素合成基因簇(圖7)[59]。

圖6 氧化偶氮霉素A、B、C的結(jié)構(gòu)[58]

圖7 氧化偶氮霉素合成基因簇

深入研究發(fā)現(xiàn)，在敲除azoC基因后，培養(yǎng)物中會(huì)積累氧化偶氮霉素的苯胺前體產(chǎn)物，因此研究人員推定，AzoC酶是形成氧化偶氮鍵的關(guān)鍵酶。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AzoC酶可以催化包括氧化偶氮霉素前體的一系列苯胺衍生物形成氧化偶氮鍵，由此，AzoC酶的功能獲得證實(shí)。通過生物信息學(xué)分析與同源建模發(fā)現(xiàn)，AzoC是一種與N-加氧酶AurF[60]和CmlI[61]高度同源的非血紅素雙鐵離子加氧酶，它們同時(shí)具有兩個(gè)EX28-37DEXXH鐵離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖8)[62]。氧化偶氮霉素合成途徑與關(guān)鍵金屬酶的發(fā)現(xiàn)，為其他氧化偶氮天然產(chǎn)物合成途徑的解析提供了思路，也為氧化偶氮含能材料的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

圖8 AzoC同源建模結(jié)構(gòu)，示鐵離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域[61]

生物合成含能材料仍有許多基礎(chǔ)理論亟待突破，目前含能材料的化學(xué)合成仍作為主要合成方式，伴隨著越來越多的生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)，人們將在未來逐步實(shí)現(xiàn)以更清潔、更高效的生物方法合成含能材料。

3 天然高能物質(zhì)的生物合成——ATP和PolyP

與前述高能物質(zhì)不同，天然高能物質(zhì)指的是含有高能鍵的物質(zhì)，如三磷酸腺苷ATP。此處“高能鍵”并不是物理化學(xué)中所描述的鍵能高、強(qiáng)度大的化學(xué)鍵，而是指在生物化學(xué)反應(yīng)中能釋放出大量能量的化學(xué)鍵，例如ATP中連接γ-磷酸的高能磷酸二酯鍵。普通磷酸酯水解只能釋放出8-16 kJ·mol-1的能量，而ATP中γ-磷酸水解時(shí)高能磷酸鍵的斷裂可釋放33-54 kJ·mol-1的能量[63]。

多聚磷酸鹽(Polyphosphate，PolyP)是一種由正磷酸鹽殘基與高能磷氧鍵組成的結(jié)構(gòu)最為緊湊的生物大分子，是一種廣泛存在于生物體胞內(nèi)的、進(jìn)化上高度保守的儲(chǔ)能高分子材料。根據(jù)多聚磷酸鹽對各類生物生命活動(dòng)的重要意義[64-66]，可將其分為兩大類，即焦磷酸鹽和大分子聚磷酸鹽[65]。

一個(gè)大分子的聚磷酸鹽中含有三個(gè)甚至幾百個(gè)磷酸殘基，其功能和代謝方式也與焦磷酸鹽有著明顯的區(qū)別[65]。1990年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Kornberg團(tuán)隊(duì)[67,68]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了細(xì)菌中的PolyP合成酶——多聚磷酸鹽激酶(Polyphosphate kinase,PPK)，這一發(fā)現(xiàn)使從基因水平操縱生物體內(nèi)PolyP的合成成為現(xiàn)實(shí)。該團(tuán)隊(duì)繼而開發(fā)了多種關(guān)于PolyP的檢測和定量方法[69,70]，為系統(tǒng)性研究PolyP在生物生理活動(dòng)中的作用做出了巨大貢獻(xiàn)。2005年，PPK的結(jié)構(gòu)首次得到確定，通過X射線晶體學(xué)方法可知，PPK是一種以Mg2+為輔因子的二聚體金屬酶(圖9)[71]。

圖9 PPK晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:1XDO)[70]

當(dāng)下對聚磷微生物的了解大部分來自污水處理工程中強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)(Enhanced biological phosphorus removal,EBPR)的廣泛研究[72]，這為PolyP的生物合成路徑提供了靈感。南京大學(xué)楊柳燕團(tuán)隊(duì)利用合成生物學(xué)技術(shù)，采用導(dǎo)入單個(gè)ppk1基因過表達(dá)中拷貝質(zhì)粒的策略，構(gòu)建了一系列工程菌，可通過富集富磷水中的磷元素來制備高聚合度的PolyP，磷元素回收率大于95%[73]。此外，近期也有報(bào)道稱可利用釀酒酵母合成水溶性的食品級的PolyP[74-76]，但關(guān)于vtc1-vtc4基因產(chǎn)物在PolyP合成中的酶活性尚在探索當(dāng)中[77]，幸運(yùn)的是，VTC復(fù)合體的結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，VTC-PolyP復(fù)合體的結(jié)構(gòu)也已經(jīng)獲取(圖10)[78]，這對理解PolyP的生物功能、促進(jìn)PolyP合成工業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

圖10 VTC-PolyP復(fù)合體結(jié)構(gòu)(PDBID:3G3Q)[77]

與化學(xué)合成的低聚合度多聚磷酸鹽(鏈長＜20 Pi)不同，生物合成的多聚磷酸鹽聚合度更高(20 Pi＜鏈長＜700 Pi)，單位負(fù)電荷密度更高[73,77]，更具功能性與特征性。南京大學(xué)趙勁與魏煒團(tuán)隊(duì)[79]發(fā)現(xiàn)，PolyP可與細(xì)胞中的強(qiáng)正電蛋白質(zhì)結(jié)合并引發(fā)相分離現(xiàn)象，意味著PolyP具有未知的生物調(diào)控功能?，F(xiàn)在科學(xué)家已通過實(shí)驗(yàn)表明：PolyP能夠與帶正電荷的聚合物(如：海藻酸、透明質(zhì)酸)、無機(jī)陽離子(如：Ca2+、Mg2+、Sr2+)或基本有機(jī)成分(如：氨基酸、多胺、多肽、蛋白質(zhì))相互作用，加工成水凝膠或納米顆粒，用于人工骨修復(fù)材料和其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[80,81]。

以聚磷酸鹽為代表的天然高能產(chǎn)物，其生物功能仍有許多未解之謎。天然高能物質(zhì)的生物合成的發(fā)展，將大大降低這些物質(zhì)的獲取難度與生產(chǎn)成本，為破解這些科學(xué)問題提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也將為人們提供一批新型的天然高分子材料，助力人類重大疾病的攻克。

4 展望

進(jìn)入21世紀(jì)以來，生物合成技術(shù)雖然得到了長足的發(fā)展，但距離以生物合成替代化學(xué)合成工業(yè)還有著很長的路要走，在高能物質(zhì)生物合成領(lǐng)域，不少生物合成途徑仍等待破解，工業(yè)化生產(chǎn)也亟待突破。目前的瓶頸在于：生物合成能替代的化學(xué)合成技術(shù)太少，不足以應(yīng)對高能化學(xué)物質(zhì)的需求；生物合成成本還較高，需要發(fā)展高效的工藝；由于合成生物學(xué)和能源物質(zhì)結(jié)合剛剛起步，很多應(yīng)用場景還需要拓展。這些挑戰(zhàn)需要我們在未來將基礎(chǔ)研究與應(yīng)用發(fā)展并重，并通過生物合成途徑的基礎(chǔ)研究來促進(jìn)工業(yè)轉(zhuǎn)化，用更高效的酶和更簡捷的路線來實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)能。