溫雨欣，巢暉

中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，生物無機(jī)與合成化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006

1 引言

一氧化氮分子(NO)曾是一個(gè)普通的無機(jī)分子，一度被認(rèn)為是廢氣和空氣污染物，人們很難將它與生物體內(nèi)的健康調(diào)控聯(lián)系起來。然而，1998年三位美國科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)“NO在心血管系統(tǒng)中起信號(hào)分子作用”而共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，自此以后，以NO為代表的無機(jī)小分子氣體作為氣體信號(hào)分子在生物體內(nèi)的作用引起了科學(xué)家們的關(guān)注并前赴后繼。早些年科學(xué)家氣體信號(hào)分子的研究主要集中在NO、CO和H2S，如Lippard課題組[1]開發(fā)了一組基于金屬復(fù)合物(Co(II)、Fe(II)、Ru(II)、Rh(III)和Cu(II)復(fù)合物)開啟熒光的NO傳感器；林偉英課題組[2]基于硝基還原反應(yīng)開發(fā)了一種新的CO熒光探針用于檢測(cè)活細(xì)胞溶酶體中的CO，唐波課題組[3]構(gòu)建了一種基于氰的近紅外比率型熒光探針以進(jìn)行快速且高靈敏度地檢測(cè)內(nèi)源性H2S等，這些研究的發(fā)現(xiàn)又在一定程度上促進(jìn)了化學(xué)家們對(duì)活體內(nèi)氣體信號(hào)分子的探索。

但是，盡管化學(xué)家對(duì)上述幾種氣體信號(hào)分子有較為全面且深入的研究，卻對(duì)內(nèi)源性SO2的研究和示蹤鮮有報(bào)道，使得SO2只能以空氣污染物和酸雨的成因長期存在于人們的視野，誤以為其只能外源性產(chǎn)生和攝取而忽略了其在生物體內(nèi)的作用。然而，近年來，隨著生物體內(nèi)檢測(cè)技術(shù)的提高和檢測(cè)范圍的擴(kuò)大，人們逐漸注意到SO2不僅能在生物體內(nèi)內(nèi)源性生成，而且作為氣體信號(hào)分子在生物體中起到調(diào)控作用，調(diào)節(jié)某些mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)并影響生理系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。本文就SO2在生物體內(nèi)的內(nèi)源性生成、生理作用和熒光檢測(cè)三大方面進(jìn)行闡述，旨在向讀者揭示SO2鮮有人知的一面，即作為信號(hào)分子如何在生物體內(nèi)發(fā)揮作用，并綜述了近年來化學(xué)家們對(duì)內(nèi)源性SO2進(jìn)行檢測(cè)和復(fù)雜的代謝循環(huán)示蹤的探索過程。

2 生物體內(nèi)SO2的來源與作用

作為氣體信號(hào)傳送器，SO2在生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用不容小覷，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。與多數(shù)內(nèi)源性活性物質(zhì)相似，內(nèi)源性SO2在不同的生理濃度下發(fā)揮著不同的作用，可分為低濃度的生理調(diào)節(jié)作用和高濃度的毒理作用：在低濃度的時(shí)候，SO2可以起到抗氧化、減少炎癥以及抗抑郁和抗焦慮的作用，特別是在血管調(diào)節(jié)方面，SO2與抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抑制血管硬化的調(diào)節(jié)作用密不可分[1]；但在高濃度的時(shí)候，SO2會(huì)引起某些呼吸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂甚至是癌癥[6]。因此，高效檢測(cè)生物體內(nèi)的SO2顯得尤為重要。

3 生物體內(nèi)SO2的檢測(cè)

3.1 SO2的熒光檢測(cè)原理

這些探針在生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)SO2特異性檢測(cè)最重要的是要有合適的反應(yīng)位點(diǎn)，而SO2與反應(yīng)位點(diǎn)的特異性結(jié)合恰恰是基于我們耳熟能詳?shù)囊恍┗A(chǔ)反應(yīng)，特別是親核加成反應(yīng)，主要可以分為SO2催化乙酰丙酸酯水解、SO2與醛基的加成反應(yīng)和Michael加成反應(yīng)三種(圖1)。

圖1 三種親核加成反應(yīng)的檢測(cè)原理

(1)SO2催化乙酰丙酸酯水解。

化學(xué)家常用乙酰丙酸酯來保護(hù)官能團(tuán)，而熒光可以通過保護(hù)羥基而淬滅[8]，故利用乙酰丙酸酯可被SO2催化而水解的性質(zhì)可以起到“光開關(guān)”的作用，使熒光信號(hào)發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)SO2的存在性檢測(cè)。華中師范大學(xué)馮國強(qiáng)課題組[9]基于乙酰丙酸酯脫保護(hù)的機(jī)理開發(fā)了一種用于亞硫酸鹽陰離子的近紅外(NIR)熒光探針(probe 1)，該探針使用萘的硫化物作為NIR熒光素和兩個(gè)乙酰丙酸基團(tuán)的反應(yīng)點(diǎn)，并對(duì)二甲基亞砜-磷酸(DMSO-PBS)緩沖液中亞硫酸鹽陰離子開啟熒光信號(hào)變化以及做出快速且高選擇性的反應(yīng)。

(2)SO2與醛基的加成反應(yīng)。

山西大學(xué)張永斌課題組[10]基于在弱酸性條件下亞硫酸氫鹽與醛基的特定親核加成反應(yīng)可以形成氫鍵設(shè)計(jì)了一種能在生物體內(nèi)快速有效識(shí)別SO2的熒光探針(NA-CHO)。由于氫鍵的存在，醛連接的肼與SO2結(jié)合形成一個(gè)五元環(huán)，而其他硫醇因空間位阻而不能形成五元環(huán)，故該探針可以在生物體內(nèi)特異性檢測(cè)SO2而不受其他硫活性物質(zhì)的干擾。

(3)Michael加成反應(yīng)。

山西大學(xué)陰彩霞課題組[11]通過Michael加成反應(yīng)成功構(gòu)建了雙位點(diǎn)功能化NIR熒光探針(NIRSP)，該探針能夠用于檢測(cè)生物體內(nèi)SO2濃度的高低，表現(xiàn)出具有紅色熒光響應(yīng)的低濃度SO2和具有藍(lán)色熒光增強(qiáng)功能的高濃度SO2，具體來說，該探針能夠辨別SO2濃度的高低是基于NIR-SP中不飽和C＝C雙鍵(位點(diǎn)1)反應(yīng)性優(yōu)于醛基(位點(diǎn)2)而實(shí)現(xiàn)的，由此我們可以通過SO2結(jié)合不同反應(yīng)位點(diǎn)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)的不同來判別其濃度的高低。

3.2 外源性SO2的熒光檢測(cè)

圖2 熒光探針1的檢測(cè)原理[13]

3.3 內(nèi)源性SO2的熒光檢測(cè)

圖3 熒光探針SP-2與的反應(yīng)原理[14]

圖4 在不同掃描深度(80–160 μm)大鼠腦部海馬體切片內(nèi)亞硫酸鹽的熒光成像[16]

這些實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果在一定程度上為SO2作為生物體內(nèi)信號(hào)分子的觀點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)支撐，同時(shí)也為檢測(cè)內(nèi)源性SO2并進(jìn)行代謝示蹤奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.4 SO2熒光探針的分類

當(dāng)前，隨著時(shí)代的發(fā)展，各種材料的結(jié)合逐漸凸顯出其性能上與眾不同的優(yōu)越性，檢測(cè)SO2的熒光探針的發(fā)展也不僅僅局限于單一的結(jié)構(gòu)和材料，故按材料我們大致可以將其分為金屬配合物熒光探針、有機(jī)小分子熒光探針和納米材料熒光探針三類。

(1)金屬配合物熒光探針。

圖5 金屬配合物熒光探針I(yè)r4[20]

(2)有機(jī)小分子熒光探針。

有機(jī)小分子熒光探針是最常見的檢測(cè)生物體內(nèi)氣體信號(hào)分子的一種探針，通過熒光基團(tuán)和能與目標(biāo)分子發(fā)生特異性反應(yīng)的有機(jī)小分子基團(tuán)雜交，調(diào)節(jié)其在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性從而具有生物成像能力。中南大學(xué)宋相智課題組[19]將帶正電的苯并吡喃和香豆素結(jié)合，開發(fā)了一種具有優(yōu)異水溶性和高選擇性的近紅外熒光探針(Probe 2)(圖6)，該熒光探針可在生物系統(tǒng)中定量和特異性檢測(cè)SO2。

圖6 有機(jī)小分子熒光探針Probe 2

(3)納米材料熒光探針。

石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)是一種性能優(yōu)越的納米碳材料，例如高量子產(chǎn)量、良好的水溶性和生物相容性[21]，且因?yàn)镚QDs和有機(jī)分子探針之間的π-π相互作用，它們之間可能會(huì)存在FRET效應(yīng)[22]，這些均為應(yīng)用于生物成像提供了可能性?；谶@一點(diǎn)，濟(jì)南大學(xué)林偉英課題組[23]開發(fā)了一種獨(dú)特的多比例復(fù)合熒光探針(CP@GQDs-OH)(圖7)，該新型納米材料熒光探針對(duì)SO2具有三種線性比例變化的高選擇性，成功應(yīng)用于檢測(cè)活細(xì)胞和斑馬魚中的SO2，為多比例熒光探針的開發(fā)開辟了新的道路。

圖7 多比例復(fù)合熒光探針CP@GQDs-OH

4 生物體內(nèi)SO2代謝的熒光示蹤

新陳代謝是一個(gè)生物體健康運(yùn)作所必需的生命過程，監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)各物質(zhì)代謝的復(fù)雜過程已成為化學(xué)家和生物學(xué)家所關(guān)注和面臨的重要問題。隨著對(duì)SO2的親核加成反應(yīng)的不斷深入以及聯(lián)合各種協(xié)同機(jī)制，化學(xué)家們不愿僅僅停留在檢測(cè)生物體內(nèi)源性SO2的有無以及含量上，更多的是開始考量SO2在復(fù)雜體系所充當(dāng)?shù)慕巧约八伎既绾螌?duì)SO2在體內(nèi)的代謝進(jìn)行示蹤，以期許更全方位地了解SO2與生物健康的關(guān)系。

山西大學(xué)陰彩霞課題組[24]通過ICT-FRET協(xié)同機(jī)制合理設(shè)計(jì)并利用了一種新的多信號(hào)熒光探針(Mito-CM-BP)同時(shí)檢測(cè)谷胱甘肽(GSH)及其代謝物SO2，該探針實(shí)現(xiàn)了在兩個(gè)獨(dú)立通道中可視化從GSH到SO2的新陳代謝過程并且無光譜交叉干擾(圖8)。具體來說，基于通過哺乳動(dòng)物體內(nèi)的硫磺轉(zhuǎn)移酶(硫轉(zhuǎn)移酶)，Na2S2O3可以結(jié)合GSH從而產(chǎn)生內(nèi)源性二氧化硫衍生物[25]，亞硫酸鹽氧化酶(SUOX)的存在可以將亞硫酸鹽氧化成硫酸鹽[26]的背景，通過與探針預(yù)處理的細(xì)胞與Na2S2O3孵化一段時(shí)間后GSH的消耗過程來評(píng)估Mito-CM-BP監(jiān)測(cè)GSH代謝的能力；然后以RNA干擾降低了細(xì)胞中的SUOX水平為理論基礎(chǔ)，通過敲除siRNA-SUOX后細(xì)胞表現(xiàn)的熒光變化來說明siRNA對(duì)SUOX活性的抑制將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SO2水平的增加，從而表明了該探針能用于實(shí)時(shí)示蹤活細(xì)胞中SO2的新陳代謝過程；最后通過在腫瘤模型中檢測(cè)SO2代謝過程的能力，進(jìn)一步說明了該探針可以作為可視化生物體內(nèi)SO2代謝過程的有力工具。

圖8 Mito-CM-BP的設(shè)計(jì)和檢測(cè)原理[24]

更重要的是，該探針已成功應(yīng)用于活細(xì)胞和小鼠模型中，對(duì)其進(jìn)行SO2的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，闡明了GSH與TST(硫代硫酸轉(zhuǎn)移酶)之間的酶反應(yīng)可以代謝SO2和實(shí)現(xiàn)了對(duì)SO2在SUOX下可以轉(zhuǎn)化為硫酸鹽過程的可視化，推動(dòng)了SO2產(chǎn)生的途徑的闡明并有助于發(fā)現(xiàn)SO2及其衍生物在生命系統(tǒng)中的新作用。

5 結(jié)語

通過上述研究結(jié)果展示，熒光檢測(cè)可以幫助我們?cè)谏矬w內(nèi)對(duì)內(nèi)源性SO2進(jìn)行存在性檢測(cè)和代謝示蹤，更深入地了解SO2與GSH等活性物質(zhì)在生物系統(tǒng)中相互關(guān)聯(lián)的生理功能，為洞悉SO2等氣體信號(hào)分子與生命健康之間的內(nèi)在聯(lián)系提供有力的技術(shù)支撐。