陳薇娜，馮 霞，陳丹丹，袁 強(qiáng)，李全清（.杭州師范大學(xué)附屬蕭山醫(yī)院/浙江蕭山醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 0；.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 005；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 005）

決明降脂片由茵陳、何首烏、決明子和桑寄生等加工而成，現(xiàn)代研究表明其具有顯著的保肝、利膽、降血脂、降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[1]。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]未對(duì)制劑所含任何成分進(jìn)行定量分析，以往研究[3-4]僅對(duì)該制劑所含1 ～ 2種成分進(jìn)行了定量分析，難以保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性及有效性。多指標(biāo)[5-6]的定量分析有利于較好地體現(xiàn)其整體性和系統(tǒng)性，本實(shí)驗(yàn)以2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為內(nèi)參物，運(yùn)用高效液相色譜一測(cè)多評(píng)法對(duì)決明降脂片中濱蒿內(nèi)酯、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素進(jìn)行同步檢測(cè)，建立決明降脂片多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，同時(shí)對(duì)3個(gè)廠家15批次決明降脂片進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，以期為全面評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（UltiMate 3000型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Waters 2695型，美國(guó)Waters公司）；SB3200DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XP205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Symmetry Shield C18柱、Welc Xtimate C18柱和Unitary C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）。

對(duì)照品濱蒿內(nèi)酯、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和橙黃決明素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111511-201704、111894-202104、110844-202116和111900-202006，含量依次為99.9%、95.1%、94.8%和99.0%）；3,5-O-二咖啡?？鼘幩岷兔罌Q明子素（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)分別為PRF10031122和PRF8101721，含量依次為98.7%和99.6%）；決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷和決明子苷C（武漢天植生物技術(shù)有限公司，含量均為98.0%）；決明降脂片（山西華元醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司，批號(hào)200102、200103、201101、201103、210302、210802和210803，編號(hào)S1 ～ S7；吉林吉春制藥股份有限公司，批號(hào)200102、210104、210304和200501，編號(hào)S8 ～ S11；長(zhǎng)春人民藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)20201101、20210201、20210301和20210501，編號(hào)S12 ～ S15）；乙腈和甲酸為色譜級(jí)別，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品濱蒿內(nèi)酯、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素適量，用80%甲醇制成0.596、0.318、0.232、0.836、0.510、1.192、0.428、0.254和0.196 mg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液。取上述貯備液用80%甲醇稀釋20倍制得混合對(duì)照品溶液（9種成分質(zhì)量濃度分別為29.8、15.9、11.6、41.8、25.5、59.6、21.4、12.7、9.8 μg·mL-1）。

2.1.2 供試品溶液 取決明降脂片，除去糖衣，研細(xì)，取細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶，加80%甲醇20 mL，超聲處理60 min，放冷，80%甲醇定容，搖勻?yàn)V過，續(xù)濾液為決明降脂片樣品溶液。取按決明降脂片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備的缺茵陳、缺何首烏、缺決明子的陰性樣品，按上述方法制得相應(yīng)的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

Symmetry Shield C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm（0 ～ 25 min測(cè)定濱蒿內(nèi)酯、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岷?,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）[7-11]和284 nm（25 ～ 65 min測(cè)定決明子苷B2、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素）[12-14]；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸，進(jìn)行線性梯度洗脫（0 ～ 10 min，13.0%乙腈；10 ～ 19 min，13.0% → 26.0%乙腈；19 ～ 25 min，26.0% → 50.0%乙腈；25 ～ 55 min，50.0% → 61.0%乙腈；55 ～ 65 min，61.0% → 13.0%乙腈），流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按內(nèi)參物峰計(jì)≥5500。

2.3 專屬性考察

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及供試品溶液在“2.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示決明降脂片樣品溶液中9種成分與相鄰色譜峰的分離度均≥1.5；陰性樣品不干擾各成分檢測(cè)。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液，用80%甲醇分別稀釋一定倍數(shù)制得6個(gè)混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣，以9種成分質(zhì)量濃度和峰面積進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得出9種成分的回歸方程和線性范圍，見表1。

表1 決明降脂片中9種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linearity results of nine components in Jueming Jiangzhi tablets

2.4.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性 取決明降脂片（S1）溶液在“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，得9種成分峰面積的RSD依次為1.01%、1.34%、1.39%、0.77%、0.84%、0.58%、0.91%、1.26%、1.53%，表明儀器精密度良好。取決明降脂片（S1）適量，制備供試品溶液6份，在色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)分析，并計(jì)算含量，得9種成分含量的RSD依次為1.47%、1.62%、1.70%、1.34%、1.46%、0.98%、1.56%、1.75%、1.92%，表明方法重復(fù)性良好。取上述進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)的任一份決明降脂片溶液，在色譜條件下于制備后0、2、4、8、15、24 h進(jìn)樣分析，得9種成分峰面積的RSD依次為0.98%、1.36%、1.44%、0.80%、0.79%、0.56%、0.93%、1.31%、1.49%，表明決明降脂片供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 加樣回收率 取已知待測(cè)成分含量并去除糖衣的決明降脂片（S1），研細(xì)，取細(xì)粉9份，每份0.25 g，精密稱定后均分成3組，精密加入混合對(duì)照品溶液（9種成分質(zhì)量濃度分別為0.461、0.239、0.155、0.659、0.397、0.914、0.332、0.199、0.103 mg·mL-1）0.8、1.0、1.2 mL，再依法制成加樣樣品溶液。依法檢測(cè)，9種成分的平均加樣回收率及RSD分別為99.55%（1.12%）、98.28%（1.35%）、97.82%（1.56%）、100.10%（0.79%）、98.67%（0.90%）、100.06%（0.58%）、97.33%（1.08%）、96.96%（1.32%）、97.86%（1.15%）。

2.4.4 相對(duì)校正因子（?）的計(jì)算 依法進(jìn)樣“2.4.1”項(xiàng)下6個(gè)混合對(duì)照品溶液，用對(duì)照品質(zhì)量濃度與峰面積之比計(jì)算各成分?，即?k/s= ?k/?s=（Wk/Ak）/（Ws/As）=（WkAs）/（WsAk）（其中W和A分別代表質(zhì)量濃度和峰面積，k和s分別代表內(nèi)參物和其他待測(cè)成分）。以2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算其它8種成分與之的平均?及RSD分別為0.781 2（0.56%）、1.247 9（1.89%）、2.124 2（1.60%）、0.841 6（1.46%）、0.721 3（0.96%）、0.898 1（0.78%）、1.685 9（1.37%）、2.883 7（0.44%）。

2.4.5 ?耐用性考察 取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，分別考察儀器（UltiMate 3000型和Waters 2695型高效液相色譜儀）和色譜柱（Symmetry Shield C18、Welc Xtimate C18和Unitary C18）、流速（1.0±0.2）mL·min-1、柱溫（30±5）℃對(duì)?的影響，結(jié)果顯示不同儀器與色譜柱下平均?及RSD分別為0.785 8（0.64%）、1.242 9（1.91%）、2.120 8（1.84%）、0.842 2（1.56%）、0.721 9（1.34%）、0.893 0（1.49%）、1.682 1（1.40%）、2.879 4（0.59%）；不同流速時(shí)平均?及RSD分別為0.775 4（1.18%）、1.242 6（1.90%）、2.122 7（1.74%）、0.845 3（1.58%）、0.715 9（1.25%）、0.895 6（0.82%）、1.686 6（1.66%）、2.881 0（0.68%）；不同柱溫下平均?及RSD分別為0.783 6（0.69%）、1.241 6（1.93%）、2.129 5（1.45%）、0.847 6（1.40%）、0.726 2（1.10%）、0.903 0（1.06%）、1.685 8（1.48%）、2.885 7（0.63%）。

2.5 含量測(cè)定

取15批決明降脂片（S1 ～ S15），依法制備決明降脂片供試品溶液，再依法進(jìn)樣分析，分別運(yùn)用外標(biāo)法（external standard method，ESM）和一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single marker method，QAMS）計(jì)算決明降脂片中各成分的含量，并比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異（表2）。結(jié)果顯示兩種方法無(wú)顯著性差異（P＞ 0.05）。

表2 含量測(cè)定結(jié)果. mg·g-1，n = 3Tab 2 Results of content determination. mg·g-1, n = 3

2.6 化學(xué)計(jì)量學(xué)質(zhì)量分析

將表2中QAMS法數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行聚類分析和主成分分析。聚類分析結(jié)果顯示15批決明降脂片聚為3類，同一廠家的產(chǎn)品聚為一類。主成分分析結(jié)果顯示前3個(gè)主成分代表決明降脂片85.55%的質(zhì)量信息。表明同一生產(chǎn)企業(yè)所生產(chǎn)的決明降脂片產(chǎn)品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，不同生產(chǎn)企業(yè)間決明降脂片產(chǎn)品質(zhì)量有差異，中藥復(fù)方制劑產(chǎn)品質(zhì)量受原藥材種屬、產(chǎn)地、原藥材內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)以及各生產(chǎn)企業(yè)制劑生產(chǎn)所用設(shè)備、質(zhì)控參數(shù)等影響。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分及內(nèi)參物的選擇

決明降脂片由茵陳、何首烏、決明子和桑寄生等加工而成，方中茵陳清利濕熱、利膽退黃，決明子清熱明目、潤(rùn)腸通便，合為君藥；何首烏解毒消癰、潤(rùn)腸通便，桑寄生補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨為臣藥。本試驗(yàn)以茵陳、決明子、何首烏為研究對(duì)象，選擇9種成分為指標(biāo)，采用HPLC-QAMS法進(jìn)行定量分析。選取質(zhì)穩(wěn)價(jià)廉、出峰時(shí)間適中且含量較高的2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為內(nèi)參物。

3.2 提取方式的選擇

本試驗(yàn)在選擇供試品提取方式時(shí)，首先以甲醇[9-11]和乙醇[13]為溶劑，超聲提取后檢測(cè)，結(jié)果以甲醇為溶劑時(shí)，9種成分的提取率較高，進(jìn)而考察了超聲[7-9]和加熱回流[14]，提取時(shí)間：50、60和70 min，同時(shí)摸索了甲醇溶液的濃度（50%[7]、80%[11]和100%[8-10]），結(jié)果顯示80%甲醇為溶劑時(shí)，超聲提取效果最好，提取60、70 min時(shí)，提取效果無(wú)顯著差異，綜合上述條件，選取80%甲醇超聲提取60 min為供試品提取方式。

綜上，本試驗(yàn)采用HPLC-QAMS法對(duì)決明降脂片中9種成分含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，建立了決明降脂片多指標(biāo)成分質(zhì)控模式，同時(shí)對(duì)3個(gè)廠家15批決明降脂片運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)掘復(fù)雜數(shù)據(jù)中潛在的規(guī)律。所建立的方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確可靠，為決明降脂片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了參考依據(jù)。