趙忠偉 李妍 王紀(jì)偉 李冬梅

(長(zhǎng)春大學(xué)特殊教育學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022)

桂枝加龍骨牡蠣湯出自張仲景《金匱要略》，該書(shū)記載“夫失精家，少腹弦急，陰頭寒……男子遺精，女子夢(mèng)交，桂枝加龍骨牡蠣湯主之”原文中，因陰陽(yáng)兩虛導(dǎo)致的陰陽(yáng)不交的男子遺精、女子夢(mèng)交，是該方的主治之證。在老年人群中，不寐的病因病機(jī)主要是老年人的臟腑陰陽(yáng)兩虛導(dǎo)致的陽(yáng)不入陰、心腎難以相交而致其不寐。“異病同治”理論是中醫(yī)學(xué)治療疾病的常用方法之一，即不同疾病的相同證型可用同一種治療方法?；谏鲜?，在“異病同治”理論的指導(dǎo)下，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐作用機(jī)制展開(kāi)新的研究。

1 資料與方法

1.1構(gòu)建復(fù)方中藥、成分、靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖 將桂枝加龍骨牡蠣湯復(fù)方中的桂枝、白芍、生姜、甘草、大棗輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)收集上述中藥活性化學(xué)成分，以藥代動(dòng)力學(xué)原理為依據(jù)〔2〕，藥物口服利用率(OB)≥30%，類(lèi)藥性指數(shù)(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選符合條件的化合物〔3〕。在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb,org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取礦物類(lèi)藥物龍骨、牡蠣可信度高的蛋白作為候選靶點(diǎn)。同時(shí)在PubMed搜索相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)成分及靶點(diǎn)等進(jìn)行有效補(bǔ)充，利用Uniprot(http://www.Uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。制作復(fù)方中藥、活性化學(xué)成分、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape(V3.7.2)軟件，應(yīng)用軟件的Network插件，對(duì)導(dǎo)入數(shù)據(jù)進(jìn)行Degree(度值)分析后，構(gòu)建中藥、活性化學(xué)成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2獲取老年人不寐靶標(biāo)基因 基于DisGeNET(人類(lèi)疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù))網(wǎng)站(https://www.disgenet.org/)與GenesCards(人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù))網(wǎng)站(http://www.genecards.org/)，以不寐的英文疾病名稱(chēng)“insomnia”為關(guān)鍵詞，選擇屬性為“Homo sapiens”(智人)篩選疾病靶標(biāo)。

1.3獲取復(fù)方靶點(diǎn)——疾病靶標(biāo)基因的交集 借助VENNY2.1在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析作圖網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/)工具，將上述1.1、1.2中的藥物靶點(diǎn)基因與疾病靶標(biāo)基因進(jìn)行交集，構(gòu)建復(fù)方靶點(diǎn)基因與疾病靶標(biāo)基因交集圖。

1.4構(gòu)建蛋白互作(PPI)分析網(wǎng)絡(luò)圖 將1.3中獲得的中藥靶點(diǎn)基因與疾病靶標(biāo)基因的交集基因?qū)隨TRINGV11.5(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)平臺(tái)，利用Multiple Proteins by Names做PPI分析，Score值設(shè)置為最高0.9，其他均為系統(tǒng)默認(rèn)值，再將該平臺(tái)分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape(V3.7.2)軟件，經(jīng)過(guò)Degree分析后，在Network插件做PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5GO功能與KEGG富集分析 基于DAVIDV6.8生物信息學(xué)資源網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)篩選的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能與KEGG富集分析〔4〕。在DAVIDV6.8網(wǎng)站中提交71個(gè)核心靶點(diǎn)基因，選擇物種為“Homo sapiens”(智人)，選擇P<0.05的分析結(jié)果，根據(jù)DAVIDV6.8數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到的GO功能與KEGG富集結(jié)果，在微生信線(xiàn)上服務(wù)平臺(tái)網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)導(dǎo)入DAVIDV6.8分析數(shù)據(jù)做可視化處理〔5〕。

1.6藥物-代謝產(chǎn)物-疾病靶點(diǎn)-KEGG通路-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為更進(jìn)一步說(shuō)明桂枝加龍骨牡蠣湯“異病同治”治療老年人不寐的作用機(jī)制，運(yùn)用Cytoscape(V3.7.2)軟件，將中藥及其有效活性成分對(duì)應(yīng)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選得到核心靶點(diǎn)及基因通路富集分析所得有效通路及疾病做可視化網(wǎng)絡(luò)處理。

2 結(jié) 果

2.1復(fù)方中藥的有效成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn) 本文共收集桂枝加龍骨牡蠣湯復(fù)方藥物有效活性化學(xué)成分151種，其中桂枝7種、白芍13種、生姜5種、甘草92種、大棗29種、龍骨2種、牡蠣3種，合并去重后119種，預(yù)測(cè)目標(biāo)靶點(diǎn)276種，桂枝加龍骨牡蠣湯復(fù)方各中藥部分有效活性化學(xué)成分見(jiàn)表1。

桂枝加龍骨牡蠣湯成分與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)之間作用關(guān)系見(jiàn)圖1，圖中綠色圓圈代表復(fù)方中藥，不同顏色正六邊形代表中藥的有效成分，其中以A、B、C與數(shù)字組合的表示為多種中藥共有的活性化學(xué)成分，藍(lán)色菱形表示預(yù)測(cè)靶基因。

2.2疾病相關(guān)靶點(diǎn)收集 在DisGeNET和GenesCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“insomnia”為關(guān)鍵詞，在DisGeNE選取P值<0.05與老年人不寐相關(guān)的靶基因，在GenesCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Score”的中位數(shù)為界值，選取“Score”≥其中位數(shù)的基因作為老年人不寐相關(guān)的靶基因，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)合并去重，共獲得與老年人不寐疾病相關(guān)聯(lián)靶標(biāo)基因1 599個(gè)。

表1 桂枝加龍骨牡蠣湯藥物部分有效活性化學(xué)成分

圖1 復(fù)方各中藥成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3繪制復(fù)方預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶標(biāo)韋恩圖 將桂枝加龍骨牡蠣湯各中藥成分的276個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與老年人不寐疾病1 599個(gè)相關(guān)靶標(biāo)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入VENNY2.1線(xiàn)上服務(wù)平臺(tái)，得到桂枝加龍骨牡蠣湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與老年人不寐疾病相關(guān)靶標(biāo)交集，共得到交集靶點(diǎn)71個(gè)。

2.4PPI分析與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將桂枝加龍骨牡蠣湯中中藥活性化學(xué)成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與老年人不寐疾病靶基因的71個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING蛋白互作分析平臺(tái)，得到PPI關(guān)系圖，見(jiàn)圖2，圖中共有71個(gè)節(jié)點(diǎn)，每一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)靶點(diǎn)蛋白，蛋白與蛋白之間的作用關(guān)系以直線(xiàn)連接的方式表示〔6〕，網(wǎng)絡(luò)連接密度越高說(shuō)明蛋白與蛋白之間的關(guān)系越密切，為進(jìn)一步篩選核心蛋白提供了理論依據(jù)。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)下載可在Cytoscape(V3.7.2)打開(kāi)的并能作圖分析的數(shù)據(jù)〔7〕，運(yùn)用Cytoscape(V3.7.2)插件進(jìn)行度值(Degree)分析，Degree越高說(shuō)明該蛋白的關(guān)鍵性越強(qiáng)，其中蛋白激酶(AKT1)、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF)、IL-10、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK3)、 低聚果糖(FOS)、雌激素(ESR1)、TP53、IL-1α、電壓依賴(lài)性鈣通道L型(CAV1)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1α的Degree≥7，故上述11個(gè)基因可能作為桂枝加龍骨牡蠣湯的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3，圖中按照Degree的分析結(jié)果，圓圈越大、顏色越深，越靠近中間代表其關(guān)鍵性越強(qiáng)。

圖2 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 Cytoscape PPI可視化網(wǎng)絡(luò)

2.5GO功能與KEGG富集分析 運(yùn)用DAVIDV6.8數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站，選擇物種為“Homo sapiens”，對(duì)11個(gè)核心靶標(biāo)基因進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析，富集條件為P<0.05，其他項(xiàng)目默認(rèn)原始設(shè)置，GO功能富集分析核心基因主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、以RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、基因表達(dá)正調(diào)控及炎性反應(yīng)等。KEGG富集分析得出桂枝加龍骨牡蠣湯異病同治干預(yù)老年人不寐主要憑借癌癥通路、乙型肝炎、TNF腫瘤壞死因子通路及MAPK轉(zhuǎn)運(yùn)通路等通路完成。把上述數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入微生信線(xiàn)上服務(wù)平臺(tái)制作GO功能富集分析氣泡圖、KEGG富集分析柱狀圖，見(jiàn)圖4、圖5。圖4橫坐標(biāo)代表基因數(shù)、縱坐標(biāo)分別BP、CC、MF功能結(jié)果，圓圈越大則表示關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)基因數(shù)越多，隨著P值由大到小，顏色由綠色向紅色過(guò)度，圖5橫坐標(biāo)代表通路中的基因數(shù)，縱坐標(biāo)表示KEGG通路，顏色隨P值的減小由藍(lán)色向紅色過(guò)度。

圖4 GO功能富集分析結(jié)果

圖5 KEGG富集分析結(jié)果

2.6中藥-活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 把KEGG通路分析篩選的核心通路、核心靶點(diǎn)基因、有效活性成分及其對(duì)應(yīng)的中藥，整理并構(gòu)建中藥、成分、靶點(diǎn)基因、通路與疾病關(guān)系數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape(V3.7.2)軟件中，構(gòu)建復(fù)方中藥-活性成分-靶點(diǎn)基因-通路-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6，圖6中綠色圓形代表復(fù)方的中藥，不同顏色的正六邊形代表活性成分、藍(lán)色菱形代表核心靶點(diǎn)，綠色三角形代表KEGG核心通路的部分通路，凹三焦形則表示疾病，復(fù)方中藥、活性成分、靶點(diǎn)基因、通路、疾病之間的關(guān)系以直線(xiàn)連接。

圖6 復(fù)方中藥-成分-靶點(diǎn)-通路

3 討 論

基于“異病同治”理論與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐的機(jī)制分析，發(fā)現(xiàn)桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐的主要化學(xué)成分可能是槲皮苷、山奈酚、(+)-兒茶酸等 。槲皮苷其主要成分為槲皮素化學(xué)式為C15H10O7，是一種廣泛存在自然界的植物次生代謝物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌及具有保護(hù)心血管作用。有研究〔8〕表明炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10在槲皮素的作用下，其表達(dá)量可被降低，進(jìn)而可說(shuō)明槲皮素具有抗炎的作用，同樣有研究〔9〕表明，在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，槲皮素可降低炎癥因子IL-6及TNF的表達(dá)而改善大鼠關(guān)節(jié)的腫脹程度。山奈酚又稱(chēng)山奈素或山奈黃酮醇，其分子式為C15H10O6，在可食用的植物中黃酮類(lèi)化合物其位列第三，山奈酚的藥理作用主要有抗抑郁、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腦缺血損傷、抗驚厥、抗癡呆等作用。近年有一項(xiàng)研究〔10〕表明山奈酚及衍生物具有抗炎作用，以脂多糖及大腸桿菌提取物干預(yù)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，使其產(chǎn)生促炎物質(zhì)TNF-α、IL-6，前列腺素及亞硝酸鹽，山奈酚及衍生物則可顯著的降低炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。另一項(xiàng)對(duì)四葉草提取物的抗炎作用的研究中，通過(guò)高效液相色譜和飛行的時(shí)間色譜發(fā)現(xiàn)，四葉草的提取物中的山奈酚衍生物紫云英苷具有明顯的抗炎作用〔11〕。(+)-兒茶酸又名(+)-兒茶素是茶葉的主要活性成分，可有效改善認(rèn)知功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞通路及細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平和炎癥的發(fā)生等。

根據(jù)PPI分析蛋白激酶B(AKT)1、IL-6、TNF、MAPK3和ESR1等可能為關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。AKT1，是AKT信號(hào)通路的核心調(diào)控因子之一，控制細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活，有研究〔12〕表明：圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠患者的肝郁分級(jí)與匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)量表(PSQI)及AKT信號(hào)通路(PI3K)/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)下的PI3K、AKT、磷酸化(P)AKT的蛋白表達(dá)量及其基因含量、IL-1β、TNF-α水平均為中度正相關(guān)性。IL-6是細(xì)胞炎性因子，在人類(lèi)的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)都有IL-6的參與，國(guó)外的一項(xiàng)研究〔13〕顯示，在對(duì)失眠患者的血液監(jiān)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著失眠程度的改變，失眠患者血液中的IL-6的含量也隨之發(fā)生改變，且與失眠的程度呈正相關(guān)。針刺聯(lián)合足少陽(yáng)膽經(jīng)推拿對(duì)氣郁質(zhì)失眠患者，治療后觀察組患者血清IL-6、多巴胺(DA)水平低于對(duì)照組，而血清5-HT水平高于對(duì)照組，表明針刺聯(lián)合足少陽(yáng)膽經(jīng)推拿可改善患者睡眠結(jié)構(gòu)，改善其睡眠質(zhì)量〔14〕。TNF在睡眠-覺(jué)醒周期的作用中，在睡眠中樞與覺(jué)醒中樞協(xié)同作用下，由內(nèi)分泌、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)的共同參與完成。有研究〔15〕表明TNF可直接作用于下丘腦的上核神經(jīng)元，通過(guò)影響神經(jīng)、內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)失眠。同樣有實(shí)驗(yàn)表明TNF參與睡眠的免疫調(diào)節(jié)中有代表性的細(xì)胞因子，內(nèi)源性的TNF含量變化隨睡眠的變化而呈節(jié)律性的改變〔16〕。MAPK3是MAPK激酶的信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要組成部分，在細(xì)胞外刺激引起的細(xì)胞反應(yīng)級(jí)聯(lián)中起重要作用。有研究〔17〕指出阿爾茨海默病小鼠的血液中，常伴有MAPK表達(dá)的升高，當(dāng)失眠及焦慮癥狀緩解后，MAPK的表達(dá)也隨之降低。Scharfman等〔18〕認(rèn)為ESR1可以通過(guò)作用于表達(dá)ER的GABA能中間神經(jīng)元，促進(jìn)鄰近神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，或者通過(guò)與位于BDNF基因上的ESR1反應(yīng)元件相互作用．誘導(dǎo)BDNF的表達(dá)。同時(shí)，已有多項(xiàng)臨床研究表明BDNF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能參與了睡眠的自我平衡調(diào)節(jié)過(guò)程。根據(jù)GO富集分析結(jié)果顯示，桂枝加龍骨牡蠣湯基于“異病同治”的理論基礎(chǔ)治療老年人不寐主要涉及與生物過(guò)程有關(guān)，主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等的生物過(guò)程。

KEGG通路分析結(jié)果得知，桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐可能與癌癥通路、TNF通路、MAPK信號(hào)通路等通路有關(guān)，上述通路為AKT1、IL-6、TNF、MAPK3和ESR1等核心靶點(diǎn)的主要通路。其中TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是由機(jī)體重要的細(xì)胞因子TNFR-1和TNFR-2誘發(fā)的通路，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活、炎癥和免疫等作用〔19～21〕。目前越來(lái)越多研究推測(cè)免疫激活相關(guān)的細(xì)胞因子分泌與精神類(lèi)疾病的密切相關(guān)，TNF、IL-1β等炎性細(xì)胞因子可通過(guò)激活下丘腦室旁核中含CRH神經(jīng)元，促使腺垂體釋放皮質(zhì)醇信號(hào)通路(ACTH)，從而活化下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁癥。同時(shí)，HPA軸的失調(diào)也是失眠的機(jī)制之一。癌癥通路與MAPK信號(hào)通路同樣是TNF、AKT1及MAPK3等因子的主要通路，同樣通過(guò)細(xì)胞的存活、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，作用于神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，通過(guò)調(diào)節(jié)與失眠有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及DA等物質(zhì)干預(yù)失眠。

綜上,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，構(gòu)建桂枝加龍骨牡蠣湯“異病同治”的理論治療老年人不寐的方劑-中藥-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病的生物網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)桂枝加龍骨牡蠣湯119種入血成分，71個(gè)靶點(diǎn)可能與老年人不寐具有相關(guān)性，主要涉及60條相關(guān)通路，并根據(jù)大量文獻(xiàn)分析，初步探討了桂枝加龍骨牡蠣湯治療老年人不寐的分子機(jī)制，體現(xiàn)了中醫(yī)藥組方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特色，為進(jìn)一步開(kāi)展探究老年人不寐的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。