于秀文 劉婷 徐晨 李雪松 榮瑋

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

結(jié)直腸癌(CRC) 發(fā)病率居全部惡性腫瘤的第3位、病死率居第5位〔1〕。CRC發(fā)生是一個復(fù)雜過程，在此過程中癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境多種成分相互作用。CD151屬于四跨膜蛋白超家族(TM4SF，也稱tetraspanin)成員，具有連接膜內(nèi)外信號通道，促進(jìn)tetraspanin信號網(wǎng)絡(luò)中結(jié)合蛋白，參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、黏附、遷移、侵襲及信號傳遞等多種功能〔2,3〕。CD151在消化系統(tǒng)腫瘤中差異表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)〔4〕。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)是一種影響腫瘤轉(zhuǎn)移及進(jìn)展的重要蛋白酶〔5,6〕，通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13等或直接降解腫瘤細(xì)胞周圍間質(zhì)并加速血管生成。文獻(xiàn)報道〔7〕內(nèi)皮細(xì)胞連接處，MT1-MMP與CD151及其相關(guān)伴侶整合素α3β1共定位。研究發(fā)現(xiàn)CRC CD151與整合素α3β1的表達(dá)具有協(xié)同作用〔8〕，但CRC組織CD151與MT1-MMP相互作用未見報道。本研究探討CRC CD151與MT1-MMP蛋白及mRNA表達(dá)相關(guān)性及潛在作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1臨床資料 選擇2015年1月至2017年12月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院原發(fā)CRC患者64例根治性切除的新鮮標(biāo)本，術(shù)前均未經(jīng)放療、化療等任何治療。TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期17例，Ⅲ期36例，Ⅳ期4例。所有切除組織在不影響病理診斷的前提下，立即無菌操作一次取材適量的新鮮癌組織并標(biāo)記，取10 mg放入RNase Free EP管內(nèi)，置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)凍存，剩余組織用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色病理診斷證實均為CRC。對照組為對應(yīng)遠(yuǎn)切端正常結(jié)直腸組織64例(距癌邊緣>5 cm，經(jīng)HE證實無癌細(xì)胞浸潤)。

1.2主要試劑 鼠抗人CD151、MT1-MMP多克隆抗體濃縮液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司。CD151、MT1-MMP1及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3免疫組化 采用免疫組化二步法，切片常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2-甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min，枸櫞酸高壓修復(fù)10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 min×3次，一抗(鼠抗人CD151、MT1-MMP多克隆抗體，工作液濃度為1∶600)4 ℃冰箱過夜，次日取出恢復(fù)室溫后，依次滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫各孵育15 min，PBS洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，其余步驟按說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作陰性對照，胃癌組織作陽性對照。

1.4qRT-PCR檢測 取-80℃凍存的腸癌組織按Trizol試劑盒說明抽提組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA的濃度及純度，A260/A280比值在1.8～2.1之間，總RNA樣品置-80℃保存?zhèn)溆?。按照cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得所需cDNA。按照實時定量PCR試劑盒的操作步驟，進(jìn)行PCR，PCR液配制在冰上進(jìn)行，反應(yīng)體系20 μl。CD151：正義鏈：5'-TGACTACATCAGCCTGCTG-3'，反義鏈：5'-AGCAGGATGAAGTACAGGC-3'；MT1-MMP1：正義鏈：5'-CCAATGTTCGAAGGAAGCG-3'，反義鏈：5'-GGGTGTAATTCTGGATGCAG-3'；GAPDH：正義鏈：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，反義鏈：5'-GAGATGGTGATGGGATTTC-3'，共40個循環(huán)。

1.5免疫組化法判定 采用半定量積分法。所有切片采用盲法由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片，CD151和MT1-MMP陽性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀，位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。隨機(jī)觀察10個高倍視野，每個視野記數(shù)100個細(xì)胞，根據(jù)CD151和MT1-MMP陽性細(xì)胞的比率進(jìn)行評定。(1)按陽性細(xì)胞的比率評分：0分為陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)≤5%；1分為5%～20%；2分為21%～50%，3分為51%～75%，4分為75%以上。(2)按染色強(qiáng)度評分：0分為細(xì)胞無棕色顆粒與背景一致；1分為細(xì)胞出現(xiàn)弱棕色或棕黃色顆粒；2分為出現(xiàn)中等強(qiáng)度棕色或棕黃色顆粒；3分為出現(xiàn)強(qiáng)棕色或棕黃色顆粒。(3)總積分=陽性細(xì)胞的比率評分+染色深度評分：0～1分為陰性(-)；2分及以上為陽性(+)。

1.6qRT-PCR法判定 根據(jù)CD151和MT1-MMP基因擴(kuò)增的CT值，以GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法比較CT值。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1遠(yuǎn)切端正常黏膜與CRC CD151和MT1-MMP蛋白的表達(dá) CD151蛋白陽性呈棕褐色顆粒狀，遠(yuǎn)切端正常腸黏膜分布在上皮細(xì)胞基底面和外側(cè)面的細(xì)胞膜，表達(dá)弱，而在CRC組織分布于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫強(qiáng)表達(dá)。遠(yuǎn)切端正常腸黏膜、CRC組織CD151蛋白表達(dá)陽性率(20.3%vs 73.4%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.267，P=0.000)。MT1-MMP蛋白陽性呈棕褐色顆粒狀，位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在正常腸黏膜表達(dá)較弱，而在CRC組織和間質(zhì)中彌漫分布，呈強(qiáng)表達(dá)或僅在間質(zhì)強(qiáng)表達(dá)(圖1)。遠(yuǎn)切端正常腸黏膜、CRC組織MT1-MMP蛋白表達(dá)陽性率(17.2% vs 62.5%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.412，P=0.000)。

2.2CRC CD15蛋白與MT1-MMP蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 CRC組織CD151和MT1-MMP蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)生部位及腫瘤最大直徑無相關(guān)性，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。CD151與CRC的分化程度有關(guān)，見表1。

2.3CRC CD151與MT1-MMP蛋白表達(dá)的相關(guān)性 64例CRC中CD151、MT1-MMP蛋白表達(dá)均陰性13例，陽性36例，CD151陰性MT1-MMP陽性4例，CD151陽性MT1-MMP陰性11例。兩者呈正相關(guān)(r=0.496，P=0.000)。

2.4CRC CD151和MT1-MMP mRNA表達(dá) 遠(yuǎn)切端正常黏膜CD151和MT1-MMP mRNA相對表達(dá)水平(0.780 9±0.092 89、0.567 5±0.067 98)顯著低于CRC(4.221 6±0.320 14、3.937 2±0.310 33；均P=0.000)。

圖1 遠(yuǎn)切端正常黏膜與CRC CD151和MT1-MMP蛋白表達(dá)(免疫組化二步法，×200)

2.5CRC CD151和MT1-MMP mRNA表達(dá)的相關(guān)性 CRC組織CD151和MT1-MMP mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.784，P=0.000)，見圖2。

圖2 CRC CD151和MT1-MMP mRNA表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

CD151是外泌體蛋白中可作為腫瘤標(biāo)志物的跨膜蛋白〔9〕，定位于人染色體11p15.5，全長1 443 kb，編碼253個氨基酸，由一大一小2個細(xì)胞外環(huán)和2個短的細(xì)胞內(nèi)尾端構(gòu)成，大的細(xì)胞外環(huán)與多種整合素相結(jié)合，將整合素接到的各種生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。CD151蛋白在多種癌細(xì)胞表面都有較高表達(dá)，并與腫瘤惡性進(jìn)展、預(yù)后及治療等密切關(guān)系〔2〕。Sandfeld-paaulsen等〔10〕研究認(rèn)為外泌體CD151可作為檢測肺癌的標(biāo)志物。本研究結(jié)果結(jié)果表明CRC CD151 mRNA高于遠(yuǎn)切端正常黏膜，與CD151蛋白表達(dá)結(jié)果相一致，提示CD151基因參與了CRC的發(fā)生、分化，并與侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。文獻(xiàn)報道〔11〕CD151是TM4SF中與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和微血管增生，有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。

MT1-MMP是腫瘤外泌體重要的蛋白酶〔12〕，基因定位于14q11，由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成，編碼582個氨基酸。MT1-MMP在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究認(rèn)為MT1-MMP在肺癌、胃癌、喉癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)量和強(qiáng)度均上調(diào)，并和惡性腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期關(guān)系密切〔13,14〕。本研究結(jié)果提示MT1-MMP基因在mRNA及蛋白水平均參與了CRC的發(fā)生。文獻(xiàn)報道，腫瘤來源的外泌體富含促使細(xì)胞外基質(zhì)降解的MMP，黑色素瘤和纖維肉瘤細(xì)胞來源的外泌體釋放的MT1-MMP可降解膠原蛋白，促進(jìn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移〔15〕。

外泌體四跨膜蛋白在外泌體中形成功能性四跨膜蛋白復(fù)合物，四跨膜蛋白復(fù)合物包含各種蛋白質(zhì)(CD82、CD151、Tspan8)及蛋白酶〔崩解蛋白和金屬蛋白酶(ADAM)、MMPs、MMP誘導(dǎo)劑(EMMPRIN)〕，在細(xì)胞運(yùn)動、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移形成中起重要作用〔16〕。文獻(xiàn)報道CD151可直接與MMPs相互作用，調(diào)節(jié)其在細(xì)胞表面的定位、轉(zhuǎn)運(yùn)，溶酶體降解和蛋白水解活性〔17〕。在處于3D細(xì)胞外環(huán)境的侵襲性癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)CD151-整合素α3β1復(fù)合體通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的產(chǎn)生。苗杰等〔18〕研究食管胃交界部腺癌顯示CD151與MT1-MMP蛋白均呈高表達(dá)，且CD151和MT1-MMP的表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果一致〔18〕。提示二者可能具有協(xié)同作用，共同參與CRC的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。結(jié)合研究結(jié)果，CRC CD151可能通過影響MT1-MMP及整合素α3β1促進(jìn)CRC侵襲和轉(zhuǎn)移〔8〕。Yaez-Mó等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞MT1-MMP通過其血紅素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域與CD151緊密結(jié)合，從而形成整合素α3β1/CD151/MT1-MMP復(fù)合物，敲除CD151基因直接影響MT1-MMP在亞細(xì)胞的定位和整合素α3β1的形成。但腫瘤中CD151與MT1-MMP具體作用機(jī)制及二者的相互作用尚不清楚，在外泌體、腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境這三者之間的關(guān)聯(lián)作用還有待深入研究。