孫 莉，陸定艷，劉 歡，何俊奇，孫 佳，王永林，李勇軍，楊 暢，劉 亭

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴陽 550004)

細(xì)胞色素P450家族2亞家族A成員13(cytochrome P450 family 2 subfamily A member 13，CYP2A13)在肺、支氣管等人呼吸道組織中特異性表達(dá)。由于CYP2A13可以高效代謝活化4-甲基亞硝胺-1-3-吡啶基-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK]、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)等前致癌物，從而使其產(chǎn)生致癌性，不少研究認(rèn)為CYP2A13與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。因此，構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的細(xì)胞系，并利用此細(xì)胞系篩選能被CYP2A13代謝活化的前致癌物，對(duì)肺癌的預(yù)防具有重要意義。目前，已報(bào)道的CYP2A13的外源表達(dá)系統(tǒng)主要是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[3-4]。細(xì)菌作為原核生物，其蛋白翻譯后的折疊和修飾過程過于簡單，因此表達(dá)的蛋白與哺乳動(dòng)物蛋白結(jié)構(gòu)相差較多，會(huì)造成所表達(dá)的CYP450酶活性缺失。此外，CYP2A13的細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要是用于體外代謝實(shí)驗(yàn)[5]，不能直接用于基于細(xì)胞毒的毒物篩選。因此，本文擬構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(chinese hamsters ovary，CHO)，以達(dá)到既能表達(dá)CYP2A13蛋白供體外代謝實(shí)驗(yàn)用，又能在細(xì)胞水平上篩選前致癌物的目的。

細(xì)胞色素P450氧化還原酶(NAPDH-cytochrome P450 oxidoreductase，POR)是細(xì)胞色素P450家族發(fā)揮活性的重要蛋白，可將NAPDH的兩個(gè)電子傳遞給CYP酶，使其發(fā)揮代謝活性[6-7]。研究表明，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)只有在雙表達(dá)POR和CYP450酶的條件下，CYP450酶才能發(fā)揮代謝活性[5]。但是，CHO是否需要共表達(dá)POR尚未有相關(guān)研究報(bào)道。因此，本文采用操作簡單、易于篩選的Flp-In CHO細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13的CYP2A13-CHO細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13和POR的CYP2A13-POR-CHO細(xì)胞，并從中篩選代謝活性較好的細(xì)胞系，為體外研究CYP2A13代謝活化的前致癌物提供有利的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 Flp-In CHO細(xì)胞株由浙江大學(xué)陳樞青教授贈(zèng)送；POR-Flp-In CHO由課題組構(gòu)建保存。

1.1.2主要試劑 pcDNA5/FRT載體由浙江大學(xué)陳樞青教授贈(zèng)送；Ham′s F12培養(yǎng)基(8120286)、胰蛋白酶(1917558)購自Gibco公司；TRIzol試劑(204203)購自Ambion公司；胎牛血清(FBSCN00419-2)購自AusgeneX公司；潮霉素B(H044-57US)、LipofectamineTM2000(2173562)購自Invitrogen公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(20190910)、牛血清白蛋白Ⅴ(bovine serum albumin，BSA)(A8020)、ECL Plus超敏發(fā)光液(27A069)、RIPA裂解液(MA0151-Dec-18E)購自索萊寶公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab205718)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(ab6789)、兔抗CYP2A13多克隆抗體(ab135703)、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(ab8245)購自Abcam公司；AFB1(2J0I16)購自青島普瑞邦生物工程有限公司；NNK(BCCB1513)購自Sigma公司；PVDF膜(R7CA8782A)購自Millipor公司；pcDNA5/FRT-CYP2A13由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成；熒光定量試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(AK81979A)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(AJ91603A)購自TaKaRa公司；水溶性四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS)(0000408248)購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；PCR引物由上海恒英公司合成，引物如下：GAPDH上游物為5′-CATCATCTCCGCCCCTTCTG-3′，下游引物為5′-CATGGACCGTGGTCATGAGT-3′；CYP2A13上游引物為5′-CCTGGTGATGACCACCC-3′；下游引物為5′-CGTGGATCACTGCCTCTG-3′。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)； 低溫高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白快速轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 用含10%胎牛血清的Ham’s F12完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80%匯合度時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，傳代比例為1 ∶3。

1.2.2CYP2A13-CHO和CYP2A13-POR-CHO細(xì)胞系構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長期的Flp-In CHO和POR-Flp-In CHO細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5×108個(gè)·L-1，以2 mL/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，用0.25 μg pcDNA5/FRT-CYP2A13質(zhì)粒(同時(shí)以不含CYP2A13基因的pcDNA5/FRT空載體作為陰性對(duì)照)及2.25 μg輔助質(zhì)粒pOG44與8 μL LipofectamineTM2000混合液轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，向培養(yǎng)基中加終濃度為500 mg·L-1的潮霉素B進(jìn)行陽性克隆的篩選。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)CYP2A13 mRNA表達(dá)水平 利用RNA裂解液TRIzol將細(xì)胞充分裂解，提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系：2 μL cDNA，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，12.5 μL TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min，(94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)×40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4Western blot檢測(cè)CYP2A13蛋白表達(dá)水平 利用RIPA裂解液提取總蛋白并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取20 μg蛋白樣品變性后進(jìn)行SDS-PAGE，然后在蛋白轉(zhuǎn)印儀的作用下，恒壓25 V、30 min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下5% BSA封閉3 h，一抗(兔抗CYP2A13多克隆抗體，稀釋度1 ∶200；小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度1 ∶5 000)于4 ℃孵育過夜。1× TBST洗膜后，分別加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG或辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，1 ∶2 000)，室溫下孵育2 h。1× TBST洗膜后，將ECL Plus超敏發(fā)光液均勻滴加在PVDF膜上避光反應(yīng)1 min，然后放入凝膠成像儀中顯影曝光。使用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5MTS法測(cè)定AFB1、NNK對(duì)CYP2A13-CHO細(xì)胞、CYP2A13-POR-CHO的細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長期的Flp-In CHO空白細(xì)胞(CHO)、Flp-In CHO空載體細(xì)胞(vehicle-CHO)、CYP2A13-CHO細(xì)胞和CYP2A13-POR-CHO細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將上述4種細(xì)胞分別稀釋至密度為1.0×108個(gè)·L-1，以100 μL/孔接種到96孔板中培養(yǎng)24 h后，加入AFB1(0、20、30、40 μmol·L-1)和NNK(0、40、80 μmol·L-1)的完全培養(yǎng)基。藥物作用24 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基和5 μL的MTS，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h后，用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值(A)，按照公式計(jì)算存活率。存活率/%=(A給藥-A培養(yǎng)基/A空白-A培養(yǎng)基)×100%。

2 結(jié)果

2.1 CYP2A13-CHO、CYP2A13-POR-CHO的CYP2A13的表達(dá)水平明顯升高相比于CHO和vehicle-CHO祖細(xì)胞，CYP2A13-CHO細(xì)胞和CYP2A13-POR-CHO細(xì)胞的CYP2A13 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高(Fig 1, 2)。

Fig 1 The mRNA expression of CYP2A13 in different groups n=3 )

Fig 2 The protein expression of CYP2A13 in different groups n=3)

2.2 NNK、AFB1對(duì)CYP2A13-CHO和CYP2A13-POR-CHO細(xì)胞具有較強(qiáng)毒性作用各濃度的AFB1、NNK對(duì)CHO和vehicle-CHO沒有殺傷作用。但是，在AFB1和NNK作用下，CYP2A13-CHO和CYP2A13-POR-CHO的存活率都明顯降低。相同給藥濃度下，AFB1和NNK對(duì)CYP2A13-CHO的殺傷作用明顯強(qiáng)于CYP2A13-POR-CHO細(xì)胞(Tab 1，2)。

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居第一，已成為危害人類健康的重大疾病之一[8-9]。研究表明，CYP2A13作為一種在氣管和肺粘膜中選擇性表達(dá)的CYP450酶，可高效代謝AFB1和NNK等前致癌物，與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[1-2,10-11]。因此，構(gòu)建一個(gè)篩選能被CYP2A13代謝活化的前致癌物的工具至關(guān)重要。

Flp-In CHO是將FRT位點(diǎn)植入到CHO細(xì)胞染色體改造而來的細(xì)胞株，只需運(yùn)用特殊的載體(pcDNA5/FRT)就可將所轉(zhuǎn)染的cDNA定點(diǎn)整合到FRT位點(diǎn)，從而保證了所轉(zhuǎn)染的外源基因具有相同的表達(dá)效率[12]。因此該細(xì)胞株只需通過潮霉素B的壓力篩選，即可得到穩(wěn)定且均一表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，省去了篩選單克隆的時(shí)間，大大提高了效率[13-14]。課題組前期通過慢病毒轉(zhuǎn)染，已成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)POR的POR-Flp-In CHO細(xì)胞系。因此，本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了CYP2A13-CHO和CYP2A13-POR-CHO兩種體外重組細(xì)胞系，并比較了兩者的代謝活性。

本研究發(fā)現(xiàn)AFB1和NNK均可對(duì)CYP2A13-CHO和CYP2A13-POR-CHO兩種細(xì)胞系產(chǎn)生毒性作用，且CYP2A13-CHO對(duì)NNK、AFB1的敏感性高于CYP2A13-POR-CHO。POR是一個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上重要的黃素蛋白[15]，其可將NAPDH的電子轉(zhuǎn)移至肝微粒體細(xì)胞色素P450氧化酶，是CYP450酶的唯一電子供體，在CYP450對(duì)底物的代謝活化過程中起著必不可少的作用[16-17]。CYP2A13只有在POR提供電子的前提下才能發(fā)揮代謝活化前致癌物的作用。但有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)單轉(zhuǎn)染CYP2A13的細(xì)胞系的代謝活性反而要高于雙轉(zhuǎn)染CYP2A13/POR細(xì)胞系的代謝活性。

有研究發(fā)現(xiàn)大鼠POR蛋白的晶體結(jié)構(gòu)同人的POR蛋白類似，同樣可將來自NADPH的電子依次傳遞給黃素腺嘌呤二核苷和黃素單核苷，最終將電子傳遞給CYP450酶的亞鐵離子，使其對(duì)底物產(chǎn)生代謝作用[18]。序列分析表明，中國倉鼠的POR和人POR序列相似，我們推測(cè)CYP2A13也可利用CHO表達(dá)的POR，從而代謝激活前致癌物NNK、AFB1產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。相較CYP2A13-CHO，CYP2A13-POR-CHO轉(zhuǎn)入較多的外源基因(POR和eGFP)，對(duì)細(xì)胞本身產(chǎn)生了較大負(fù)擔(dān)，使CYP2A13的表達(dá)量降低，從而導(dǎo)致其對(duì)NNK、AFB1的敏感性不高。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一株CYP2A13表達(dá)較高且活性較好的CYP2A13-CHO細(xì)胞系，為篩選CYP2A13代謝激活的前致癌物提供了工具。