李洵珣，金 晨，陳 康，程玉瑤，張慶熙，田曉丹，陳 志，張 凌

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院、2.現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 南昌 330004)

中藥可以通過多成分多靶點(diǎn)多通道協(xié)同作用，但由于其成分較為復(fù)雜、作用機(jī)理多不明確等問題，很難通過傳統(tǒng)的實(shí)驗方法來系統(tǒng)且全面地進(jìn)行分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于藥物、疾病的相關(guān)靶點(diǎn)基因以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)分析方法。能夠從整體角度揭示藥物的作用機(jī)理、協(xié)同作用和動態(tài)特征，這些特征與中醫(yī)治療整體理論的特征相一致，可為新藥研發(fā)節(jié)約成本，使實(shí)驗更具有針對性。此外，分子對接是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測進(jìn)行進(jìn)一步分析的手段，使用高精度對接模擬和分子路徑圖顯示配體的選擇性，解釋配體如何作用于復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，從而評估蛋白質(zhì)配體的結(jié)合潛力。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法探討豐城雞血藤治療TNBC的作用機(jī)制，并體外實(shí)驗驗證。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；Swiss Target Prediction (www.swissadme.ch/)；Gennecards(https://www.genecards.org/)；OMIM(https://omim.org/)；String(https://string-db.org/)；Bioinformatics & Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)；Uniprot(http://www.uniprot.org/)；PDB(https://www.rcsb.org/);Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Metascape(http://metascape.org/)；Cytoscape3.7.2；R3.6.1；AutoDockTools；Discovery Studio。

1.2 豐城雞血藤中藥活性成分及靶點(diǎn)篩選通過文獻(xiàn)挖掘[6-11]以及中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行活性成分篩選。文獻(xiàn)以“豐城雞血藤”、“成分”等為檢索詞在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫以及萬方數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索得到。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索豐城雞血藤中的活性成分，根據(jù)中藥成分藥代動力學(xué)(ADME)參數(shù)對活性成分進(jìn)行篩選，將藥物口服生物利用度(OB)≥30%以及類藥性(DL)≥0.18作為參考標(biāo)準(zhǔn)。SwissTargetPrediction可通過Chemdraw繪制活性成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行代入，設(shè)置屬性為homosapiens(人類)，篩選其中probability>0.1的活性成分的靶基因進(jìn)行收集，一共得到豐城雞血藤共38個潛在活性成分。

1.3 TNBC疾病靶點(diǎn)篩選在Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫中，以“triple-negative breast cancer”為關(guān)鍵詞，獲取TNBC疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)篩選利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics網(wǎng)站中Draw Venn Diagrams分析工具導(dǎo)入豐城雞血藤活性成分和TNBC疾病的靶點(diǎn)，通過取交集的方法獲取豐城雞血藤活性成分與疾病共同靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.5 豐城雞血藤治療TNBC分子蛋白靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將豐城雞血藤治療TNBC有效活性成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建豐城雞血藤活性成分治療TNBC分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 豐城雞血藤治療TNBC蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及核心靶點(diǎn)篩選將豐城雞血藤活性成分與疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“人類”，設(shè)定最低相互作用閾值高等置信度(>0.9)，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，最終獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)。將得到的tsv文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中，利用Network Analyzer功能，根據(jù)節(jié)點(diǎn)degree值篩選出排名靠前的靶點(diǎn)。

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本組研究對象的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計工作,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計量數(shù)據(jù),以t檢驗;計數(shù)資料采用[n(%)]表示,采用卡方檢驗。若p<0.05,則表示組間數(shù)據(jù)對比差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)GO功能富集分析使用Metascape數(shù)據(jù)庫，根據(jù)豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)，進(jìn)行GO富集分析。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度(P<0.05，Q<0.05)，分別選取排名靠前的20條GO生物過程、細(xì)胞組成、分子功能，繪制柱狀圖。

1.8 豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)KEGG富集分析使用Metascape數(shù)據(jù)庫，根據(jù)豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)，進(jìn)行KEGG富集分析。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度(P<0.05，Q<0.05)，選取排名靠前的20條KEGG通路，繪制氣泡圖。

1.9 豐城雞血藤治療TNBC疾病的重要活性成分和核心靶點(diǎn)對接驗證從Uniprot數(shù)據(jù)庫以及PDB數(shù)據(jù)庫中搜索靶點(diǎn)蛋白的PDB ID，同時在Pubchem數(shù)據(jù)庫下載對應(yīng)成分的三維結(jié)構(gòu)。使用AutoDockTools1.5.6對豐城雞血藤活性成分以及篩選得到Degree前11個核心靶點(diǎn)進(jìn)行對接，最后利用分子可視化工具DiscoveryStudio對其對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，并以圖片形式展現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 豐城雞血藤中藥活性成分和靶點(diǎn)篩選初步篩選得到豐城雞血藤治療TNBC的38個有效中藥成分，分別編號為FC1-FC38(Tab 1)，豐城雞血藤靶點(diǎn)388個，TNBC靶點(diǎn)3 919個，以及豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)277個(Fig 1)。

Tab 1 List of active ingredients of Callerya nitida var. hirsutissima

Fig 1 Venn diagram of active ingredient targets and disease targets

2.2 豐城雞血藤治療TNBC分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在Cytoscape3.7.2中導(dǎo)入豐城雞血藤治療TNBC的活性成分和對應(yīng)靶點(diǎn)，構(gòu)建分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，包括317個節(jié)點(diǎn)，2 232條邊。表明豐城雞血藤抗TNBC機(jī)制或是基于多成分、多基因、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。

2.3 豐城雞血藤治療TNBC的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及核心靶點(diǎn)篩選根據(jù)互作節(jié)點(diǎn)個數(shù)(degree值)大小進(jìn)行核心靶點(diǎn)的篩選(Tab 2)，得到了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Fig 2)，其中顏色越深、圓形直徑越大，代表該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的相關(guān)性越明顯，在網(wǎng)絡(luò)中處于越重要的地位。篩選出了磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基α(PIK3CA)、磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1)、有絲分裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)、酪氨酸蛋白激酶(SRC)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)等蛋白?；プ黝l次越高，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間相互作用越大，degree越大，在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。其中PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、SRC、AKT1的degree值排名前五，提示可能為豐城雞血藤活性成分治療TNBC核心靶點(diǎn)。

Tab 2 Targets of Callerya nitida var. hirsutissima in treatment of TNBC

Fig 2 PPI network diagram of core targets

2.4 豐城雞血藤治療TNBC的靶點(diǎn)GO功能富集分析將豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分析與通路富集分析，進(jìn)行GO功能富集分析，共獲得生物過程(biologicalprocess，BP)2 668個，主要涉及對多種酶的調(diào)控，無機(jī)物質(zhì)與細(xì)胞的反應(yīng)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化過程；細(xì)胞組成(cellularcomponent、CC)141個，主要涉及蛋白激酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)蛋白激酶復(fù)合物等；分子功能(molecularfunction，MF)286個，主要涉及蛋白激酶活性、蛋白激酶結(jié)合、生長因子結(jié)合。將各功能排名前十的生物過程、細(xì)胞組成和分子功能繪制成柱狀圖(Fig 3)。

Fig 3 Bar chart of GO enrichment analysis of Callerya nitida var. hirsutissima active ingredients against TNBC

2.5 豐城雞血藤治療TNBC靶點(diǎn)KEGG富集分析根據(jù)富集程度和顯著性，篩選出了主要的20條KEGG通路(Fig 4)，主要涉及PI3K-AKT信號通路、細(xì)胞周期、HIF-1信號通路、甲狀腺激素信號通路、FoxO信號通路、癌癥中的中心碳代謝、癌癥中的MicroRNA等與治療TNBC有關(guān)的通路。

2.6 豐城雞血藤治療TNBC的重要中藥活性成分和核心靶點(diǎn)對接驗證通過文獻(xiàn)查找以及參考分子靶點(diǎn)的分布情況篩選出31種中藥活性成分與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行對接(Fig 5)，選擇共有靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗證。采用AutodockTools軟件將豐城雞血藤活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接分析，一般認(rèn)為配體與受體蛋白結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生相互作用可能性越大。當(dāng)結(jié)合能絕對值>4.25則表示具有一定活性，>5.0表示有較好結(jié)合活性，而>7.0則可推測其有強(qiáng)烈結(jié)合活性。結(jié)果見Fig 6,7。

Fig 4 The bubble chart of KEGG enrichment analysis of anti-Triple-negative breast cancer target of Callerya nitida var. hirsutissima active ingredient(The x-axis is the enrichment quantity, and the Y-axis is the pathway)

Fig 5 Molecule docking heat map

Fig 6 Luteolin and PIK3CA

Fig 7 Betulinic acid and CDK1

3 體外TNBC細(xì)胞實(shí)驗驗證

3.1 藥物來源豐城雞血藤三氯甲烷提取物由本課題組經(jīng)70%乙醇提取3次，再利用三氯甲烷萃取得到，經(jīng)LC-MS以及核磁共振鑒定其部分成分為刺芒柄花素、8-甲雷杜辛、黃氏醌以及 (2S) -1-O-heptatriacontanoyl glycerol等[4]。

木犀草素(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號：CY191104-06)，白樺脂酸(上海吉至生化科技有限公司，批號：B38540)

3.2 細(xì)胞來源人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(武漢普諾賽生物有限公司)，傳至3-10代用于實(shí)驗。

3.3 豐城雞血藤有效成分抑制細(xì)胞增殖情況使用MDA-MB-231細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和雙抗(青霉素10 000 kU·L-1，鏈霉素10 000 mg·L-1)，置于37 ℃，5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。利用CCK-8法檢測木犀草素、白樺脂酸以及豐城雞血藤三氯甲烷部位提取物對TNBC細(xì)胞的半數(shù)有效抑制率(IC50)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草素、白樺脂酸以及豐城雞血藤三氯甲烷萃取部位對MDA-MB-231細(xì)胞抑制率隨作用時間、作用濃度增加而增加，見Fig 8。木犀草素作用24 h時，其IC50為84.76 μmol·L-1；作用48 h時，其IC50為39.98 μmol·L-1。白樺脂酸作用24 h時，其IC50為49.27 μmol·L-1；作用48 h時，其IC50降低為25.95 μmol·L-1。豐城雞血藤三氯甲烷萃取部位作用24 h時，IC50為197.4 mg·L-1；作用48 h時，其IC50為139.4 mg·L-1。見Fig 8。

Fig 8 The inhibitory effects of betulinic acid, luteolin and Callerya nitida var. hirsutissima chloroform extracts on TNBC cell proliferation

3.4 劃痕實(shí)驗將細(xì)胞接種至背面已畫上3條均勻橫線的6孔板中,待細(xì)胞覆蓋后,用200 μL槍頭垂直于所畫橫線進(jìn)行畫線。用1 mL PBS沖洗2遍，加入2 mL無血清DMEM配置的含藥培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別于0、6、18 h于倒置顯微鏡下觀察，如Fig 9所示。

3.5 豐城雞血藤有效成分相關(guān)蛋白表達(dá)情況通過收集各組經(jīng)藥物處理24 h的細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。將處理好的蛋白樣品上樣進(jìn)行電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完畢將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜3次，每次10 min，二抗孵育2 h，洗膜，顯色。

結(jié)果表明，經(jīng)低、中劑量木犀草素、白樺脂酸以及中劑量組豐城雞血藤三氯甲烷部位提取物處理的TNBC細(xì)胞能明顯降低VEGFA、AKT、PIK3CA、CDK1、CDK4的表達(dá)，見Fig 10。

Fig 10 Effects of luteolin, betulinic acid and chloroformextract of Callerya nitida var. Hirsutissima on VEGFA,AKT, PIK3CA , CDK1, CDK4

4 討論

乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制可能與遺傳因素、基因突變、機(jī)體免疫功能下降、神經(jīng)功能異常等均有一定關(guān)系。中醫(yī)認(rèn)為，其內(nèi)在根源主要在于人體臟腑陰陽失調(diào)，或者受到正氣內(nèi)虛給其帶來的明顯影響，并且致病關(guān)鍵根源可能在于痰濁、氣郁、熱毒侵蝕或者出現(xiàn)瘀血現(xiàn)象。并且在近年來一些關(guān)于三陰性乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn),運(yùn)用中醫(yī)藥方法治療有一定成效,因此豐城雞血藤治療TNBC具備中醫(yī)理論基礎(chǔ)的支持。

本研究通過分析發(fā)現(xiàn)豐城雞血藤治療TNBC潛在活性成分主要為木犀草素、白樺脂酸等。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可通過抑制NF-κB/c-Myc的激活，進(jìn)而抑制hTERT轉(zhuǎn)錄來抑制端粒酶活性，起到抑制乳腺癌增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[12]。白樺脂酸處理后的細(xì)胞可導(dǎo)致葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)過表達(dá)，過表達(dá)的GRP78激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)壓力傳感器PERK。隨后的eIF2α磷酸化導(dǎo)致β-catenin表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致c-Myc介導(dǎo)的糖酵解受到抑制，從而達(dá)到抗乳腺癌發(fā)展的作用[13]。在PPI蛋白互作結(jié)果中可知，PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、SRC、AKT1、STAT3、HSP90AA1、APP、CDK1、HDAC1、ESR1的節(jié)點(diǎn)較大，推測這些節(jié)點(diǎn)可能是治療TNBC的主要靶點(diǎn)。通過Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO以及KEGG富集分析，在GO功能富集分析中主要涉及對多種酶的調(diào)控、無機(jī)物質(zhì)與細(xì)胞的反應(yīng)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等過程；以及在KEGG通路富集分析中主要涉及PI3K-AKT信號通路、細(xì)胞周期、HIF-信號通路、甲狀腺激素信號通路、FoxO信號通路、癌癥中的中央碳代謝、癌癥中的MicroRNA等與治療TNBC有關(guān)的通路。均提示豐城雞血藤治療TNBC的潛在作用機(jī)制多集中在影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及凋亡等生物過程。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及實(shí)驗驗證發(fā)現(xiàn),豐城雞血藤可通過多化合物、多靶點(diǎn)、多通路作用于TNBC。PIK3CA以及PIK3R1均屬于PI3K基因家族的成員。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路的失調(diào)有助于腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展。PIK3CA突變可導(dǎo)致HR+/HER2-轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后較差[14]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),刺激AKT信號通路在乳腺腫瘤中發(fā)揮促癌作用[15-16],當(dāng)藥物抑制AKT信號傳導(dǎo)可使細(xì)胞周期阻滯從而達(dá)到抑制。臨床研究中也將CDK4抑制劑作為治療的手段之一[17]。研究還發(fā)現(xiàn)接受免疫治療的非轉(zhuǎn)移性乳腺癌相比，轉(zhuǎn)移性乳腺癌中CCNA2的表達(dá)增加，并且研究中CCNA2在癌組織中的表達(dá)較正常對照升高，提示抑制CCNA2的表達(dá)可抑制TNBC的轉(zhuǎn)移[18]。研究也發(fā)現(xiàn)新血管形成是腫瘤形成的必要條件之一，VEGFA作為一種血管內(nèi)皮生長因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中將起到至關(guān)重要的作用。因此，在治療上可考慮從抑制血管生長、細(xì)胞增殖以及侵襲等途徑抑制TNBC的發(fā)展。

在體外驗證實(shí)驗中，利用CCK-8法測定豐城雞血藤三氯甲烷部位萃取物以及單體化合物木犀草素、白樺脂酸對細(xì)胞增殖的抑制率，結(jié)果顯示均有一定的抑制作用，其中白樺脂酸以及木犀草素能在低濃度對TNBC細(xì)胞增殖有抑制作用。Western blot檢測蛋白表達(dá)可知，在給藥濃度范圍內(nèi)各組均能抑制VEGFA、AKT、PIK3CA、CDK1、CDK4的表達(dá)，可通過PI3K-AKT通路以及周期蛋白阻滯細(xì)胞周期，也可通過抑制VEGFA的表達(dá)以及細(xì)胞增殖，在生物體內(nèi)可抑制血管生長，也進(jìn)一步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥研究提供一種新方法，為藥理研究提供了理論基礎(chǔ)以及實(shí)驗依據(jù)。