張道寶，徐建國(guó)

顱咽管瘤(craniopharyngioma,CP)是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，任何年齡均可發(fā)病，但其常見(jiàn)的發(fā)病年齡呈雙峰分布，即主要有6～14歲和50～70歲兩個(gè)高發(fā)年齡段，同時(shí)CP是兒童最常見(jiàn)的鞍區(qū)占位性病變[1--2]。CP在病理學(xué)上可分為兩種亞型，即造釉細(xì)胞型顱咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma，ACP)和鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤(papillary craniopharyngioma，PCP)[3]。CP的侵襲性研究已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，目前取得了一定進(jìn)展，但是仍有很多不足。已有研究證實(shí)miR-200家族在腫瘤侵襲中起到重要作用，本研究初步探討了miR-200家族在CP組織中的表達(dá)情況及其意義。

1 材料和方法

1.1 材料 收集四川大學(xué)華西醫(yī)院2017年6月—2018年12月經(jīng)手術(shù)切除的ACP、PCP新鮮標(biāo)本各30例作為研究對(duì)象，并且選取同時(shí)期在華西醫(yī)院神經(jīng)外科因顱腦外傷而行開(kāi)顱手術(shù)切除的30例失活腦組織作為對(duì)照組。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法 HE染色觀察各組組織的病理變化；免疫組化法檢測(cè)各組組織中E-cadherin和β-catenin的變化；qRT-PCR測(cè)定各組組織中miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-200c-3p、miR-429-3p、miR-141-3p及ZEB1、ZEB2、CTNNB1相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組HE染色情況 首先，對(duì)照組、PCP組和ACP組均有各自明顯的組織特征:對(duì)照組細(xì)胞分布均勻，無(wú)異常增生；PCP組由單一的多邊形密集排列的鱗狀上皮細(xì)胞(黃色箭頭指示)構(gòu)成；而ACP組具有呈柵欄狀排列的上皮細(xì)胞(紅色箭頭指示)，有漩渦狀細(xì)胞簇(藍(lán)色箭頭指示)等特點(diǎn)。再次是腫瘤與周圍組織交界的特點(diǎn)：PCP組細(xì)胞與周圍組織交界線比較平整，沒(méi)有見(jiàn)到明顯向周邊組織延伸的跡象；而ACP組呈“指樣”或“島樣”深入周圍腦組織，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，侵襲性明顯(如黑色箭頭所示)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HE病理染色結(jié)果

2.2 免疫組化法檢測(cè)各組E-cadherin和β-catenin變化 根據(jù)鏡下染色深淺，與PCP相比，ACP的β-catenin的表達(dá)略有升高，且分布在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細(xì)胞膜上(圖2A), 與之相反的是，ACP相對(duì)于PCP，E-cadherin的表達(dá)下降了(圖2B)。

A：β-catenin在ACP主要在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)(黑色箭頭)，且表達(dá)較正常神經(jīng)組織(藍(lán)色箭頭)及PCP(紅色箭頭)中升高； B：E-cadherin在ACP(黑色箭頭)的表達(dá)較在PCP(紅色箭頭)的表達(dá)降低

2.3 各組中miR-200家族成員相對(duì)表達(dá)水平 各組miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)水平比較，ACP組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組miRNA-200b的相對(duì)表達(dá)水平比較，ACP組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組miRNA-200c的相對(duì)表達(dá)水平比較，ACP組低于對(duì)照組，也低于PCP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組miRNA-429的相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組miRNA-141的相對(duì)表達(dá)水平比較，ACP組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

*/#表示P<0.05，**/##表示P<0.01，***/###表示P<0.001；*：normal vs ACP，#：PCP vs ACP

2.4 qRT-PCR測(cè)定各組侵襲相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平 各組ZEB1、ZEB2、CTNNB1的相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ACP組高于對(duì)照組，也高于PCP組。見(jiàn)圖4。

*：與normal相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；#：與PCP相比；#表示P<0.05，##表示P<0.01

3 討 論

多數(shù)CP在組織學(xué)上為良性腫瘤，惡性CP罕見(jiàn)，但在臨床病程中卻有著與惡性腫瘤相似的特征。術(shù)后易復(fù)發(fā)是CP，特別是ACP的一個(gè)重要特點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，CP術(shù)后患者經(jīng)過(guò)10年隨訪，其復(fù)發(fā)率可高達(dá)到90%[4]。本研究對(duì)3組標(biāo)本分別進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，正常腦組織細(xì)胞分布均勻，無(wú)異常增生；PCP組織由單一的多邊形密集排列的鱗狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，與周圍組織交界線比較平整，沒(méi)有見(jiàn)到明顯向周邊組織延伸的跡象；而ACP組織具有呈柵欄狀排列的上皮細(xì)胞，具有漩渦狀細(xì)胞簇等特點(diǎn)，呈“指樣”或“島樣”深入周圍腦組織，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，侵襲性明顯。

目前在人類基因組中，已發(fā)現(xiàn)一千多種miRNA，通過(guò)基因調(diào)控調(diào)著大約30%以上的人類基因[5]。miRNA參與對(duì)細(xì)胞各種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，包括正常細(xì)胞的增殖分化、凋亡，并和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系[6-8]。miRNA-200家族與許多腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miRNA-200家族共有5個(gè)成員組成，根據(jù)其“種子序列”不同又可分為兩個(gè)亞族：miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-200a、miRNA-200b及miRNA-429，前者共同序列“AAUACU”；后者為“AACACU”, 兩者之間相差一個(gè)核苷酸(C和U)，因它們擁有不同的“種子序列”，所以具有不同的結(jié)合特異性，調(diào)節(jié)的靶基因也有細(xì)微的差別，但它們?nèi)杂性S多共同的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等多種腫瘤中，miRNA-200家族的表達(dá)明顯低于腫瘤附近的正常組織[9-16]。本研究利用qRT-PCR測(cè)定各組miRNA-200家族的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織組相比，ACP組中miRNA-200家族表達(dá)整體趨勢(shì)是下降的，其中miRNA-200c的下降最為明顯，差異性顯著。而PCP相比于正常腦組織，其miRNA的表達(dá)雖然略有下降，但是并不明顯，也沒(méi)有特別突出的亞型。與PCP相比，ACP中miRNA-200家族整體也是下降的，同樣是miRNA-200c這個(gè)亞型下降最為明顯。本研究結(jié)果說(shuō)明miRNA-200家族在CP，特別是ACP中表達(dá)明顯下降，可能起到類似于抑癌基因的作用。

miRNA-200家族主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，是上皮細(xì)胞的標(biāo)志物[17]，同時(shí)在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過(guò)程中扮演了重要角色。E盒結(jié)合鋅指蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)是重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，包括ZEB1/ZEB2，可以直接抑制E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表達(dá)[18]。miRNA-200家族可直接抑制ZEB1/ZEB2，進(jìn)而調(diào)控EMT[19]。Oba等[20]通過(guò)miRNA與ZEB-2的mRNA3′UTR互補(bǔ)序列分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-200家族對(duì)ZEB-2作用顯著，與對(duì)照組相比，能抑制ZEB-2 80%的活性。miRNA-200家族過(guò)表達(dá)后，可結(jié)合在ZEB1/ZEB2的3′UTR區(qū)使其靶向降解，并使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，從而抑制EMT的發(fā)生，降低腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。同時(shí)，ZEB1/ZEB2也能直接抑制miRNA-200家族的轉(zhuǎn)錄，兩者之間形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)路，起到相互抑制的作用。本研究利用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定各組ZEB1/ZEB2的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，ACP組中ZEB1/ZEB2表達(dá)整體趨勢(shì)是上調(diào)的，其中ZEB2的上調(diào)最為明顯，差異性顯著；而PCP相比于正常組織，ZEB1/ZEB2變化不顯著；與PCP相比，ACP的組織中ZEB1/ZEB2表達(dá)整體也是上調(diào)的；由此可知，在ACP中ZEB1/ZEB2的表達(dá)明顯上調(diào)。利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CP中E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果表明ACP組相對(duì)于PCP組，E-cadherin的表達(dá)下降了。綜上，在ACP中，存在這樣一個(gè)通路，隨著miRNA-200家族表達(dá)明顯下調(diào)，導(dǎo)致ZEB1/ZEB2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使E-cadherin的表達(dá)受到了明顯抑制。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)由原癌基因CTNNB1編碼，是一種多功能、高度保守的細(xì)胞骨架蛋白。β-catenin可以存在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，研究發(fā)現(xiàn)正常神經(jīng)細(xì)胞中的β-catenin主要在細(xì)胞膜中表達(dá)，而ACP中β-catenin在細(xì)胞膜內(nèi)低表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)過(guò)表達(dá)，并且這些細(xì)胞多位于實(shí)體瘤邊緣浸潤(rùn)性較強(qiáng)的位置[21]。本研究利用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定各組CTNNB1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，ACP組中CTNNB1表達(dá)整體趨勢(shì)是上調(diào)的，差異性顯著；而PCP相比于正常組織，CTNNB1變化不顯著；與PCP相比，ACP的組織中CTNNB1表達(dá)整體也是上調(diào)的；由此可知，在ACP中CTNNB1的表達(dá)明顯上升。通過(guò)免疫組化測(cè)定，與PCP相比，ACP的β-catenin的表達(dá)有升高，且分布在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細(xì)胞膜上。綜上，在ACP中，隨著miRNA-200家族表達(dá)的明顯下調(diào)，其與靶基因CTNNB1的結(jié)合減少，導(dǎo)致CTNNB1表達(dá)上調(diào)，使其編碼蛋白β-catenin的表達(dá)升高。

相對(duì)于正常腦組織，ACP組中miRNA-200家族表達(dá)整體下降，其中miRNA-200c的下降最為明顯，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)表達(dá)整體上調(diào)，其中ZEB2的上調(diào)最為明顯；PCP相比于正常腦組織，miRNA-200家族的表達(dá)略有下降，但是并不明顯，也沒(méi)有特別突出的亞型，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)變化不顯著；與PCP相比，ACP組織中miRNA-200家族整體下降，同樣是miRNA-200c這個(gè)亞型下降最為明顯，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)的表達(dá)整體上調(diào)。ACP的β-catenin的表達(dá)升高，且分布在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在細(xì)胞膜上。ACP相對(duì)于PCP，E-cadherin的表達(dá)下降。綜上所述，miRNA-200家族在CP中可能起到類似于抑癌基因的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。