陳小康，孫文清，王 康，張又枝,2，張玉霖,2?

（1. 湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100 ；2. 鄂南特色中藥湖北省工程研究中心，湖北 咸寧 437100）

京尼平苷是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，它是中藥梔子干燥果實(shí)中的主要活性成分。京尼平苷在其他植物中也廣泛存在，如肉蓯蓉、杜仲、牛膝、黃毛耳草等[1]。京尼平苷具有降血糖、抗抑郁、抗癌、抗炎、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用[2-5]。目前報(bào)道的檢測(cè)京尼平苷血藥濃度的方法多為高效液相色譜法[6]（HPLC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]（LC-MS/MS）。本文在既有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化改進(jìn)建立一種能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)小鼠血漿中京尼平苷血藥濃度的方法，繪制京尼平苷在小鼠體內(nèi)隨時(shí)間代謝的平均血藥濃度-時(shí)間曲線，得到其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為相關(guān)研究和臨床用藥提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀 器 液 相 色 譜- 質(zhì) 譜 儀（LC-MS/MS 8040）（由日本島津公司生產(chǎn)），1730R 微量高速冷凍離心機(jī)（由丹麥labogene 公司生產(chǎn)）、AUY220 型電子天平（由日本島津公司生產(chǎn)）。

1.1.2 試劑 HPLC 級(jí)乙腈、甲酸（由美國(guó)Fisher公司生產(chǎn)），京尼平苷（HPLC ≥98% ；批號(hào)：G101668 ；由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供），芍藥苷（HPLC ≥98% ；批號(hào)：B21148 ；由上海源葉生物科技有限公司提供）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明鼠27 只（體重為20 ～25 g），購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK( 京)2016-0002。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定條件、溶液配制與血樣處理

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-乙酸銨（5 mmol/L，含0.05% 甲酸）（30:70）；流速：0.8 mL/min ；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.1.2 主要質(zhì)譜條件 液相質(zhì)譜-電噴霧離子源（ESI），離子多反應(yīng)離子（MRM）檢測(cè)；接口電壓：4.5 kV；霧化氣流量：3 L/min；干燥氣流量：15.0 L/min；DL 溫度：250℃；CID 氣：230 kPa。定量離子對(duì)：京尼平苷：m/z 406.2 ～227.2（CE ：-15）；芍藥苷：m/z 498.4 ～179.15（CE ：-20）。

1.2.1.3 京尼平苷儲(chǔ)備液的配制 精密稱(chēng)取1.5 mg的京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品，用44.0 μg/mL 的芍藥苷內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行超聲溶解，稀釋成含內(nèi)標(biāo)的105.0 μg/mL京尼平苷儲(chǔ)備液。

1.2.1.4 血漿樣品的處理 取100 μL 血漿樣品，加入300 μL 內(nèi)標(biāo)溶液（利用其溶劑乙腈沉淀蛋白），渦旋振蕩5 min，在4℃下離心（13 000 r/min）處理10 min，取上清液300 μL。在上清液中加入100 μL 的蒸餾水，渦旋混勻后經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，按照擬定條件進(jìn)行測(cè)定和分析。

1.2.2 分析方法考察

1.2.2.1 專(zhuān)屬性 分別取處理好的空白血漿、空白血漿+ 內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿+ 內(nèi)標(biāo)溶液+ 京尼平苷質(zhì)控樣品、昆明鼠以150 mg/kg 的劑量灌胃京尼平苷后采集的血漿樣品，按擬定條件進(jìn)行測(cè)定和分析，得到色譜圖。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 分別精密量取一定量的京尼平苷儲(chǔ)備液，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至300 μL，制得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在各溶液中加入100 μL 的空白血漿后，制成濃度分別為6037.5 ng/mL、3150.0 ng/mL、1575.0 ng/mL、787.5 ng/mL、3 7 8.0 n g/m L、1 2 6.0 n g/m L、6 3.0 n g/m L、31.5 ng/mL、15.75 ng/mL、7.35 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，并按照1.2.1.4 項(xiàng)“血漿樣品處理”方法自渦旋振蕩5 min，記錄峰面積。以京尼平苷與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，以京尼平苷濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)線性回歸處理（1/x2）。

1.2.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 配制并測(cè)定高（1575.0 ng/mL）、 中（378.0 ng/mL）、 低（63.0 ng/mL）及定量下限（7.35 ng/mL）4 個(gè)濃度的京尼平苷質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度均有5 個(gè)樣本，連續(xù)測(cè)定3 d，考察該方法的精密度和準(zhǔn)確度。

1.2.2.4 提取回收率 取空白血漿100 μL，加入300 μL 的乙腈，渦旋振蕩5 min，在4℃下離心（13 000 r/min）處理10 min，取上清液100 μL。在上清液中加入京尼平苷儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液，制得京尼平苷濃度為1575.0 ng/mL、126.0 ng/mL、15.75 ng/mL 的血漿樣品。取血漿樣品300 μL，加入蒸餾水100 μL，渦旋混勻，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，按擬定條件進(jìn)行測(cè)定和分析。配制相同濃度的質(zhì)控血漿樣品并進(jìn)樣分析。測(cè)定京尼平苷峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，分別為A 和B，提取回收率=B/A%。

1.2.3 藥物體內(nèi)研究 按照給藥后取血時(shí)間的不同將27 只昆明鼠分為5 min 組、15 min 組、25 min組、35 min 組、45 min 組、55 min 組、120 min 組、240 min 組、360 min 組，每組各有小鼠3 只。將所用小鼠禁食不禁水12 h 后用150 mg/kg 的京尼平苷灌胃，各組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)眼眶取血后，用含有肝素鈉的EP 管收集全血，在4℃的離心機(jī)中以10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心20 min，按照1.2.1.4項(xiàng)“血漿樣品處理”方法進(jìn)行處理。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，用GraphPad Prism 9 軟件繪制平均血藥濃度- 時(shí)間曲線，用R 語(yǔ)言[8]按照非房室模型估算各組小鼠主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 分析方法評(píng)價(jià)

2.1.1 專(zhuān)屬性 在擬定條件下，京尼平苷和內(nèi)標(biāo)（芍藥苷）的保留時(shí)間分別為4.23 min、4.98 min，化合物峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)、內(nèi)標(biāo)（芍藥苷）和京尼平苷之間互不干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 京尼平苷在7.35 ～6037.5 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方 程：y=0.0124x+0.72，（r2=0.999），定 量 下 限為7.35 ng/mL（S/N ＞10）。

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 京尼平苷定量下限的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為14.06%，日間RSD為15.85%，準(zhǔn)確度為89.34% ；高、中、低濃度京尼平苷的日內(nèi)RSD 均＜10.31%，日間RSD均＜13.03%，準(zhǔn)確度在95.65% ～102.34% 之間。這表明，該檢測(cè)方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

2.1.4 提 取 回 收 率 京 尼 平 苷 低、 中、 高 濃度的提取回收率分別為（85.61±1.20）%、85.06±3.93）%、（89.31±5.07）%。 這 表 明，京尼平苷的提取回收率良好且比較穩(wěn)定。

2.2 藥物體內(nèi)研究

用京尼平苷為昆明鼠灌胃后其平均血藥濃度- 時(shí)間曲線見(jiàn)圖1。其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：t1/2=49.5 min、Cmax=3151.27 ng/mL、Tmax=25.0 min、MRT（mean residence time， 平 均 滯 留 時(shí)間）=70.76 min、AUC0-∞=208427.3 ng·mL-1·min-1、AUC0-t=256305.6 ng·mL-1·min-1。

圖1 昆明鼠體內(nèi)京尼平苷平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用HPLC-MS/MS 法檢測(cè)小鼠體內(nèi)京尼平苷的血藥濃度時(shí)，在流動(dòng)相中添加0.05%甲酸時(shí)的檢測(cè)效果最佳。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈占50%時(shí)，京尼平苷和內(nèi)標(biāo)芍藥苷的色譜峰在4.2 min 時(shí)發(fā)生重疊。通過(guò)降低乙腈所占的比例，兩個(gè)色譜峰漸漸分離。當(dāng)乙腈所占的比例為30% 時(shí)，京尼平苷和芍藥苷的色譜峰具有較好的峰形且出峰時(shí)間良好，最終的色譜條件為乙腈- 乙酸銨（5 mmol/L，含0.05% 甲酸）（30:70）。本試驗(yàn)在血漿樣品的處理上，借鑒了相關(guān)文獻(xiàn)[7,9]中的處理方法。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的已有條件，以氮?dú)獯蹈纱嬲婵諠饪s溶劑進(jìn)行樣品濃縮時(shí)，發(fā)現(xiàn)樣品的處理較為繁瑣費(fèi)時(shí)，且可能使誤差產(chǎn)生的幾率增加。通過(guò)對(duì)本試驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，使處理血漿樣品的時(shí)間大幅減少且簡(jiǎn)化了操作步驟。在處理血漿樣品的最后，為了避免待測(cè)樣品因檢測(cè)樣本數(shù)量較大、等待時(shí)間長(zhǎng)而導(dǎo)致有機(jī)相揮發(fā)，特在上清液中加入了100 μL 的蒸餾水。本研究用LC-MS/MS 測(cè)定并建立了小鼠體內(nèi)京尼平苷平均血藥濃度隨時(shí)間變化的曲線，并得出了相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，能夠?yàn)榫┠崞杰赵谛∈篌w內(nèi)的相關(guān)研究提供參考數(shù)據(jù)。

綜上所述，采用LC-MS/MS 并以上文中的色譜條件檢測(cè)小鼠體內(nèi)京尼平苷血藥濃度的價(jià)值較高，具有操作簡(jiǎn)單、專(zhuān)屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性和精密度高等優(yōu)點(diǎn)。