徐 瑩，周 茹，張欣洲，馬華林**

(1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院/深圳市人民醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 深圳 518020;2.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院/深圳市人民醫(yī)院腎內(nèi)科/深圳市腎臟病重點實驗室)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種彌漫性結(jié)締組織疾病，其特征是典型的自身免疫介導(dǎo)的炎癥。盡管使用免疫抑制和新療法后，SLE患者10年生存率有所提高，但仍有部分患者因活動性疾病和內(nèi)部器官嚴重受損而死亡[1]。

外泌體廣泛存在于外周血、尿液、腦脊液和其他體液中[2-4]。因此，我們可以檢測組織、細胞和體液中的外泌體及其含量。該特征對于疾病尤其是腎臟疾病的診斷和臨床治療很重要。許多研究表明circRNA可用于多種疾病的診斷和療效評估的生物標(biāo)志物[5-7]。

本研究以外泌體circRNA為切入點，對SLE患者和正常人群血清外泌體中circRNA的表達情況進行比較，為探究SLE可能的發(fā)病機制及診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院風(fēng)濕免疫科10例女性SLE患者為SLE組，10例來自體檢的女性健康志愿者作為正常對照組(NC組)，SLE組年齡19～52歲，平均(34.2±1.3)歲；NC組年齡20～54歲，平均(33.6±1.5)歲，兩組在性別、年齡等均無差異(P>0.05)，SLE組患者均未使用激素和免疫抑制劑。研究方案經(jīng)暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與對象均簽署知情同意書。

1.2 血清標(biāo)本收集

兩組抽血前一晚22：00后禁食禁水。采血后3 000rpm離心約10min，吸取上層清液保存于-80℃冰箱備用。

1.3 外泌體分離提取

根據(jù)試劑說明書，使用ExoQuick試劑沉淀試劑盒(SBI公司，美國)分離血清中外泌體，分離后將外泌體儲存于-80°C備用。

1.4 血清Exosome circ RNA測序

血清Exosome circ RNA測序詳見圖1，測序由廣州永諾生物科技有限公司完成。提取樣品總RNA并使用DNase I消化DNA后去除rRNA，富集環(huán)狀RNA。將環(huán)狀RNA片段化后用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，接著使用含有dUTP的dNTP合成第二鏈cDNA。使用磁珠對PCR富集的文庫進行片段篩選，質(zhì)控合格后上機測序。QC1：檢測總RNA濃度、純度、完整性；QC2：證實99%以上的rRNA都已被去除；QC3：證實RNA被打斷成200bp左右的片段；QC4：檢測文庫的質(zhì)量濃度、片段大小、摩爾濃度。

圖1 circ RNA基因測序主要實驗過程

1.5 生物信息學(xué)分析

基因本體(Gene Ontology，GO)分析和pathway分析參照我們以前描述的方法[8]。

1.5.1 GO分析

GO數(shù)據(jù)庫包含了基因參與的生物過程、所處的細胞位置、發(fā)揮的分子功能三方面功能信息，并將粗細不同的功能概念組織成DAG(有向無環(huán)圖)的結(jié)構(gòu)。利用GO的知識體系和結(jié)構(gòu)特點，旨在發(fā)掘與基因差異表達現(xiàn)象關(guān)聯(lián)的單個特征基因功能類或多個特征功能類的組合。我們將基因功能分為biological process、cellular component、molecular function共3個大類別。

1.5.2 Pathway分析

與GO分析類似，我們同樣將差異基因使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway數(shù)據(jù)庫映射，并對代謝通路做統(tǒng)計檢驗，P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Total RNA質(zhì)檢和濃度測定結(jié)果

RNA提取和純化后，運用Qubit3.0熒光計對兩組的總RNA進行濃度和純度檢測，結(jié)果見表1。

表1 SLE組和NC組血清外泌體總 RNA 濃度

2.2 circRNA的種類及來源

SLE患者血清外泌體中circRNA的種類較對照組有所減少，來源主要為內(nèi)含子，見表2。

表2 SLE 和NC組血清和尿液中的外泌體 circRNA 種類

2.3 SLE患者和NC患者血清外泌體中circRNA的差異表達

在SLE患者和對照組的血清外泌體間，有121種circRNA物種表現(xiàn)出明顯不同。其中，上調(diào)有54種 (見表3)，下調(diào)有67種(見表4)。這些circRNA大多來自內(nèi)含子。相應(yīng)的基因包括snoU13、SNORA31、SNORA51、SNORD112和其他核小RNA。在表達上調(diào)的circRNA中，chrY：13651007 | 13860076的log2Ratio為27.729，差異最顯著；在表達下調(diào)的circRNA中，chr2：233244474 | 233272478的log2Ratio為-27.111，差異最顯著，對應(yīng)的基因為snoU13。該基因主要表達為核仁小RNA，并在RNA處理和修飾中起作用。

表3 SLE組和NC組比較血清中顯著上調(diào)的circRNAs

表4 SLE組和NC組比較血清中顯著下調(diào)的circRNAs

2.4 生物信息學(xué)分析

使用GO和KEGG途徑分析靶基因的潛在功能。 GO分析表明，靶基因與血清外泌體中的細胞進程，多細胞有機體、色素沉著，發(fā)育過程以及對刺激的反應(yīng)有關(guān)(圖2)。 此外，對于評估的circRNA，獲得了包含靶基因的顯著相關(guān)途徑。我們將差異基因使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway數(shù)據(jù)庫映射，并對代謝通路做統(tǒng)計檢驗，根據(jù)P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果共篩選到29條代謝通路，其中我們列出前20條途徑(圖3)。其中Platelet activation信號通路是SLE發(fā)病機理中的重要信號通路(圖4)。

圖2 SLE患者與對照組血清外泌體相比差異表達circRNA的GO注釋(包括生物過程、細胞成分和分子功能)

圖3 SLE患者與對照組比較血清外泌體中差異表達circRNAs預(yù)測靶點KEGG通路分析(圓圈的藍色越深，通路富集越顯著；圓圈越大，通路的基因數(shù)量越多)

圖4 Platelet activation信號通路(紅色標(biāo)記表示具有差異表達的基因)

3 討 論

由于circRNA的高度穩(wěn)定性，可以從體液中輕松獲得circRNA，circRNA可以用作臨床疾病診斷，治療效果和藥敏分析的生物標(biāo)志物[5]。近來研究表明：一些circRNA充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA并參與基因表達調(diào)控[9]。在該研究中，我們從差異表達的circRNA對應(yīng)基因包括SNORA31，SNORA51，SCARNA20，SNORA70，SNORD112和其他小核仁RNA(snoRNA)，主要為內(nèi)含子來源的circRNA。更多的研究表明，snoRNA可以進一步加工形成較短的RNA片段，而這些短片段snoRNA具有microRNA樣功能。這一發(fā)現(xiàn)表明snoRNA可以作為microRNA的前體[10]。一些研究[11-12]證明，不同基因來源的circRNA存在于細胞的不同部位，并表現(xiàn)出不同的功能。我們在本研究中獲得的circRNA相應(yīng)基因主要來自編碼snoRNA的內(nèi)含子。

研究表明[13]，核苷酸序列的snoRNA可以通過轉(zhuǎn)錄后水平的堿基互補配對與mRNA特定堿基序列配對，從而調(diào)節(jié)基因表達。這一發(fā)現(xiàn)與以下事實相吻合：內(nèi)含子衍生的circRNA在轉(zhuǎn)錄水平上增強基因表達并在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。 circRNA通過轉(zhuǎn)錄前后對mRNA的切割和修飾在mRNA水平上調(diào)節(jié)基因表達[12]。此外，僅在細胞應(yīng)激反應(yīng)的早期階段才能檢測到snoRNA的存在。不可否認，患者在SLE的發(fā)生和發(fā)展中會受到感染、創(chuàng)傷、缺氧和其他壓力。提示相應(yīng)的表達circRNA的特異性snoRNAs，如：snoU13、SNORA31 和 SCARNA20等可以作為SLE早期腎臟損傷的特異性標(biāo)志物。

Platelet activation信號通路在多種類型的哺乳動物細胞中具有重要的功能。我們的結(jié)果表明，Platelet activation信號通路在SLE患者的血清外泌體中異常激活，為研究SLE發(fā)病機理和探索新療法提供了實驗基礎(chǔ)。我們認為，參與調(diào)節(jié)該信號通路的干預(yù)措施可能是治療SLE和相關(guān)疾病的有效手段。

總之，我們揭示了SLE患者血清外泌體中存在circRNA的異常表達，這些異常表達的circRNA可能參與SLE發(fā)病，為SLE的診斷、治療和預(yù)后提供新的理論基礎(chǔ)。