張靖宜，董思進(jìn)，王夢(mèng)琦，楊高明，王 丹，華 麗，周燕紅

(湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部，湖北 咸寧 437100)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，由于不良環(huán)境和生活習(xí)慣等高危因素影響，其發(fā)病率和死亡率每年仍在快速上升[1]，給人民生命和健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。CRC起病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)癌癥患者確診時(shí)已屆中晚期，手術(shù)和藥物治療臨床療效欠佳[2]，且副作用也較大，因此，為提高結(jié)直腸癌晚期患者生活質(zhì)量，尋找療效好且副作用小的活性藥物分子或者有效部位刻不容緩。

紫花牡荊素(casticin)是從蔓荊子中分離出的一種有細(xì)胞毒性的黃酮類成分。目前研究表明，紫花牡荊素有抗炎[3]、抗氧化[4]和抗腫瘤作用[5]，還具有阻滯細(xì)胞周期G2/M及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用[6]。而紫花牡荊素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制也被研究[7]發(fā)現(xiàn)。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]揭示紫花牡荊素誘發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡作用與上調(diào)死亡受體-5(DR5)和表達(dá)抑制和因子kappaB(NF-κB)活性有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥研究相結(jié)合，科學(xué)地闡明“藥物-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系，有助于中藥的系統(tǒng)研發(fā)[9]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析紫花牡荊素治療結(jié)直腸癌的潛在分子機(jī)制，為紫花牡荊素在結(jié)直腸癌中的臨床應(yīng)用提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 紫花牡荊素相關(guān)作用靶點(diǎn)篩選

以“Casticin”為關(guān)鍵詞，通過(guò)篩選Pubchem數(shù)據(jù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nIh.gov/)得到紫花牡荊素的2D結(jié)構(gòu)，如圖1。將紫花牡荊素的2D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction．ch/)[10]獲取其相關(guān)潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 篩選結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)

以“colorectal cancer”為關(guān)鍵詞，在OMIM疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(http://omim.org/)中篩選與結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用結(jié)直腸癌靶點(diǎn)和紫花牡荊素預(yù)測(cè)靶點(diǎn)在Venny數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，得到紫花牡荊素在結(jié)直腸癌中的共同靶點(diǎn)。

1.3 藥物-作用靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)[11]構(gòu)建藥物-疾病共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，將紫花牡荊素治療結(jié)直腸癌靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homo sapiens(人類)”，最低相互作用閾值設(shè)置為“medium confidence(0.400)”，其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置值。靶點(diǎn)的度值(degree)表示相互作用靶點(diǎn)的個(gè)數(shù)[12]，以大于中位數(shù)的Degree值為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO富集與KEGG通路分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david．ncifcrf．gov/)[13]和KEGG網(wǎng)站(https://www.genome.jp/kegg)對(duì)藥物-疾病共同靶基因進(jìn)行GO富集與KEGG通路分析。設(shè)置閾值為P<0.05，按P-value升序進(jìn)行排序，篩選出紫花牡荊素-結(jié)直腸癌靶點(diǎn)主要的生物功能及藥理作用機(jī)制中可能性較大的通路，利用KEGG網(wǎng)站繪制相關(guān)通路圖。利用微生信在線網(wǎng)站(http://www．bioinformatics．com．cn/)繪制KEGG氣泡圖及GO富集分析條形圖。

1.5 紫花牡荊素-共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將KEGG篩選出的紫花牡荊素與結(jié)直腸癌共同作用靶點(diǎn)在結(jié)直腸癌相關(guān)的作用通路上標(biāo)注出來(lái)，再用cytoscape 軟件繪制主要的通路圖，驗(yàn)證其多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用于結(jié)直腸癌的分子機(jī)制。

1.6 紫花牡荊素與靶蛋白分子對(duì)接

從RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載蛋白結(jié)構(gòu)為“PDB”格式和紫花牡荊素2D結(jié)構(gòu)保存為“SDF”格式，然后使用openbabel軟件將紫花牡荊素“SDF”格式轉(zhuǎn)化為“PDB”格式，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock Vina軟件[14]進(jìn)行加氫、加電子、加ROOT等操作，最后用AutoDock vina1.1.2軟件Local Search Parameters算法進(jìn)行分子對(duì)接，選擇其中結(jié)合能最小的對(duì)接模型，最后使用Pymol軟件繪制靶點(diǎn)蛋白受體和紫花牡荊素之間的結(jié)合模式圖。

2 結(jié) 果

2.1 紫花牡荊素潛在作用靶點(diǎn)篩選

通過(guò)pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)得到紫花牡荊素2D結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)得到紫花牡荊素相關(guān)潛在作用靶點(diǎn)100個(gè)。

圖1 紫花牡荊素2D結(jié)構(gòu)

2.2 紫花牡荊素與結(jié)直腸癌疾病共同靶點(diǎn)篩選

通過(guò)OMIM疾病數(shù)據(jù)庫(kù)合并去重后得到200個(gè)結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)。將紫花牡荊素藥物靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌疾病靶點(diǎn)取交集，最終得到6個(gè)共同靶點(diǎn)分別為NQO2、EGFR、ALDH2、AKT1、MPO、SRC繪制韋恩圖，如圖2、3所示。

圖2 紫花牡荊素-結(jié)直腸癌共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建得到6個(gè)共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3。節(jié)點(diǎn)之間的連線表示兩個(gè)蛋白之間的相互作用，不同顏色對(duì)應(yīng)不同的相互作用類型，紅色代表基因融合，綠色代表基因鄰接，也就是說(shuō)這兩個(gè)基因靠得很近，可能具有蛋白相互作用的關(guān)系。圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白，由于真核生物的可變剪切和轉(zhuǎn)錄后修飾，一個(gè)蛋白編碼基因可能會(huì)產(chǎn)生多個(gè)蛋白，這將由同一個(gè)基因產(chǎn)生的不同isoform進(jìn)行合并，在節(jié)點(diǎn)上標(biāo)記的字母實(shí)際為對(duì)應(yīng)基因的gene symbol。圖中有些節(jié)點(diǎn)內(nèi)部有螺旋狀的結(jié)構(gòu)，這表示該蛋白的三維結(jié)構(gòu)已知，如果未知，節(jié)點(diǎn)內(nèi)部為空。通過(guò)Cytoscape 3.8.2插件(network analyze)計(jì)算該網(wǎng)絡(luò)各靶點(diǎn)連接度，得中位數(shù)為3，選取連接度≥3，得到兩個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別是絡(luò)氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase SRC,SRC)和絲氨酸蛋白激酶(serinelthreonine-protein kinase AKT，ATK1)。

圖3 紫花牡荊素-結(jié)直腸癌共同靶點(diǎn)PPI圖

2.4 GO富集與KEGG通路分析

6個(gè)共同靶點(diǎn)GO富集后得到35個(gè)生物過(guò)程(biology process，BP)、2個(gè)細(xì)胞組分(cellular component，CC)、8個(gè)分子功能(molecular function，MF)，其中將生物過(guò)程取前10個(gè)條目制圖，見(jiàn)圖4。GO富集結(jié)果顯示共同靶點(diǎn)主要與ERBB2信號(hào)通路(ERBB2 signaling pathway)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)等生物學(xué)過(guò)程(BP)，與一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等分子功能(MF)過(guò)程，以及細(xì)胞外泌體(extracellular exosome)、線粒體(mitochondrion)等細(xì)胞組成(CC)過(guò)程密切相關(guān)。KEGG 分析后發(fā)現(xiàn)6個(gè)共同靶點(diǎn)主要富集在 28個(gè)通路中， 取前20個(gè)通路繪制圖，如圖5。結(jié)果表明，這些共同靶點(diǎn)主要富集在ErbB signaling pathway、Estrogen signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Focal adhesion、Rap1 signaling pathway、Bladder cancer、Endometrial cancer、Non-small cell lung cancer、VEGF signaling pathway、Central carbon metabolism in cancer等通路中。其中ErbB通路程度最大，根據(jù)共同靶點(diǎn)在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)獲取ErbB信號(hào)通路圖，如圖6所示。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG氣泡圖

圖6 ERBB信號(hào)通路圖(紅色代表紫花牡荊素—結(jié)直腸癌共同靶點(diǎn))

2.5 構(gòu)建紫花牡荊素治療結(jié)直腸癌相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)圖

將紫花牡荊素與結(jié)直腸癌共同靶點(diǎn)和通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，如圖7。該網(wǎng)絡(luò)圖包含紫花牡荊素、6個(gè)共同靶點(diǎn)、前 20 個(gè) KEGG 信號(hào)通路。

圖7 紫花牡荊素—共同靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖(黃色：紫花牡荊素；紫色：共同靶點(diǎn)；紅色：相關(guān)KEGG通路)

2.6 紫花牡荊素與關(guān)鍵靶蛋白SRC與AKT1的分子對(duì)接

構(gòu)建紫花牡荊素與關(guān)鍵靶點(diǎn) SRC 分子和AKT1分子對(duì)接模型，計(jì)算對(duì)接后-CDOCKERENERGY 值。綠色的條帶是蛋白質(zhì)分子SRC，紫色的棍狀結(jié)構(gòu)是配體分子紫花牡荊素，黃色的虛線是它們之間連接的氫鍵，黑色標(biāo)簽是與配體分子對(duì)接的氨基酸殘基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫花牡荊素與 SRC 分子分子對(duì)接模型結(jié)合能為-5.64kj/mol(圖8)，與AKT1分子對(duì)接模型結(jié)合能為-8.21kj/mol(圖9),結(jié)合能均小于0，這表明配體分子(紫花牡荊素)能和受體蛋白(SRC和AKT1)自發(fā)地結(jié)合。通常與受體結(jié)合能越低結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定。結(jié)合能小于-4.25kcal/mol提示配體與受體有一定的結(jié)合活性,小于-5.0kcal/mol有較好的結(jié)合活性，小于-7.0kcal/mol有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[15]。結(jié)果提示紫花牡荊素與潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)SRC和AKT1具有較好的結(jié)合活性。

圖8 紫花牡荊素與關(guān)鍵靶點(diǎn)SRC分子對(duì)接構(gòu)象圖 圖9 紫花牡荊素與關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1分子對(duì)接構(gòu)象圖

3 討 論

現(xiàn)有研究表明紫花牡荊素抑制包括乳腺癌[16]、肺癌[17]、結(jié)腸癌[18]在內(nèi)的多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。紫花牡荊素具有抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，其誘發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡作用與上調(diào)死亡受體-5(DR5)表達(dá)和抑制核因子kappaB(NF-kB)活性有關(guān)[19]。由此可見(jiàn)，紫花牡荊素在治療結(jié)直腸癌中發(fā)揮著重要作用。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了6個(gè)紫花牡荊素治療結(jié)直腸癌潛在作用靶點(diǎn)，為紫花牡荊素的作用機(jī)制也提供了很大的可能性。

從共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖表明紫花牡荊素可能通過(guò)這些靶點(diǎn)多途徑的協(xié)調(diào)，對(duì)結(jié)直腸癌產(chǎn)生治療作用。在GO功能和通路富集分析中，我們發(fā)現(xiàn)紫花牡荊素主要與ERBB2信號(hào)通路、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞外泌體等密切相關(guān)；相關(guān)信號(hào)通路主要富集在ErbB signaling pathway、Estrogen signaling pathway、Proteoglycans in cancer上。本研究結(jié)果可以證實(shí)紫花牡荊素通過(guò)調(diào)控ErbB信號(hào)通路，調(diào)控SRC和AKT靶蛋白的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。通過(guò)關(guān)鍵靶蛋白SRC、AKT1進(jìn)行結(jié)合能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示紫花牡荊素能與SRC和AKT1自發(fā)結(jié)合，并形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果相吻合。有研究證實(shí)SRC可以通過(guò)抑制多種促細(xì)胞凋亡因子的活性表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[20]；也有研究表明通過(guò)抑制AKT1的表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲[21]。由此可得出結(jié)論，紫花牡荊素可靶向SRC和AKT1調(diào)控ErbB信號(hào)通路抑制結(jié)直腸細(xì)胞的增殖。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段揭示了紫花牡荊素作用于結(jié)直腸癌的潛在作用靶點(diǎn)，為中藥治療結(jié)直腸的機(jī)制提供了新思路。但本研究尚未考慮藥物劑量及有效成分提取方法對(duì)治療結(jié)直腸癌的影響，因此，本課題組將進(jìn)一步通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)為紫花牡荊素治療結(jié)直腸癌及后期藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。