吳 娜，覃雙林，任 平，吳 詩

(湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

異?；钴S的谷氨酰胺代謝重排(glutamine metabolic reprogramming)是正常細(xì)胞區(qū)別于腫瘤細(xì)胞的本質(zhì)特征之一[1-2]。丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(alanine-serine-cysteine transport 2，ASCT2)是Na+依賴性谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)system ASC家族成員之一[3]，眾多研究[4-6]顯示多種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和前列腺癌等，其ASCT2的表達(dá)明顯增加。反義RNA干擾ASCT2表達(dá)，明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長，提示ASCT2過量表達(dá)可促進(jìn)大量谷氨酰胺的吸收，為腫瘤細(xì)胞的生存提供有利條件。因而，以ASCT2為靶標(biāo)篩選所得的先導(dǎo)化合物，很有可能成為有前景的新型靶向治療藥物。

本課題前期建立了ASCT2靶向抑制劑的高通量篩選模型，從靶向代謝通路的小分子化合物庫中，已篩出ASCT2靶向抑制作用相對專一和有效的候選化合物?；诖耍菊n題采用分子對接技術(shù)，分析篩選出的候選化合物與ASCT2之間的相互作用，預(yù)測其結(jié)合的親和力，同時(shí)合成目標(biāo)化合物，研究其體外抗腫瘤活性，為研發(fā)新型ASCT2抑制劑提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

400M型核磁共振儀(德國布魯克)；LCMS8040型液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津)；酶標(biāo)儀(Biotek)，CCK-8試劑盒劑(碧云天試劑有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)化合物的合成

常溫下，將3.02g(0.04mol)氯乙腈、27g(0.262mol)二氯二硫和15mL二氯乙烷一次性加入反應(yīng)容器中攪拌反應(yīng)，45min后通入氯化氫氣體，反應(yīng)16h后得大量的固體。抽濾、濾餅用10mL二氯甲烷洗滌，干燥后得7.09g產(chǎn)品，產(chǎn)率85%。測得化合物熔點(diǎn)為171.8℃～172.5℃，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的172℃相符合，為目標(biāo)產(chǎn)物4,5-二氯-1,2,3-二噻唑氯化物。然后將5mmol化合物1、10mL二氯甲烷和5mmol的2-氰基-4溴苯胺先后加入反應(yīng)器中。在攪拌情況下將5mmol吡啶溶于20mL的二氯甲烷溶液并滴加到反應(yīng)液中，反應(yīng)8h后停止攪拌。再加入5mmol三乙胺攪拌得大量固體三乙胺鹽酸鹽，抽濾除去固體，濾液用水洗滌三次(20mL×3)后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，所得濾液除去溶劑后得黃色固體。固體通過硅膠柱色譜分離純化，產(chǎn)率90%。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ 7.22(d,1H),7.78(dd,1H),7.87(d,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ 108.2,115.0,118.8,119.2,136.5,137.6,148.2,152.1,162.0。HRMS(ESI)m/zCalculated for [C9H3BrClN3S2+H]+:330.86,Found:330.86。圖1為目標(biāo)化合物的路線合成圖。

圖1 目標(biāo)化合物的路線合成圖

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤kelly細(xì)胞、NLF細(xì)胞和胰腺癌BXPC3細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE-2C細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有細(xì)胞均置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中，以1∶3的比例傳代，每2d換液一次。待所有細(xì)胞生長至70%～80%消化處理，分別接種于96孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積約80%時(shí)，分別給予0、5、15、45、135，405μmol/L的目標(biāo)化合物處理48h。終止培養(yǎng)后，每孔加入10μL CCK-8，輕搖，37℃孵育1.5h，用酶標(biāo)儀(λ=450nm)記錄各孔的吸光度(OD)。取5孔OD值的平均數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=處理組OD/對照組OD×100%，重復(fù)3次。

1.2.3 分子對接研究

從PDB數(shù)據(jù)庫中提取ASCT2(PDB ID：6gct)蛋白文件。對接模擬前，用Pymol軟件刪去蛋白源文件中的配體化合物和水分子，得到一個干凈的分子。采用Autodock vina軟件將目標(biāo)化合物與處理過的ASCT2蛋白分子進(jìn)行對接，繪制結(jié)合模擬圖，并評價(jià)對接結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 目標(biāo)化合物的合成與鑒定

合成的化合物是一種具有1,2,3-二噻唑結(jié)構(gòu)的衍生物。合成反應(yīng)中，通過自制的4,5-二氯-1,2,3-二噻唑與2-氰基-4溴苯胺反應(yīng)制備，收率90%，此種方法步驟簡單，原料便宜易得，產(chǎn)率高。從化合物的核磁共振氫譜可以看出，在譜圖中除了目標(biāo)化合物的氫和溶劑氫以外，沒有其他氫，且譜圖的基線平，說明產(chǎn)品較純。

目前核磁共振技術(shù)(NMR)是用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定的重要方法之一[8]，提供了有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)信息，其譜圖與化合物分子的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，能反映出結(jié)構(gòu)的細(xì)微差別，所以NMR可對藥物進(jìn)行定性鑒別[9]。因此，合成的目標(biāo)化合物采用核磁共振波譜NMR表征。化合物的氫譜和碳譜分別見圖2和圖3。從氫譜圖可以看出化合物有3個與芳香碳相連的氫，說明原料2-氰基-4溴苯胺在產(chǎn)物中。碳譜圖在低場有9個碳，比原料2-氰基-4溴苯胺的碳原子數(shù)增加了2個，其來源于4,5-二氯-1,2,3-二噻唑的2個碳。再通過化合物譜氫圖峰的化學(xué)位移和裂分分析可知，合成的化合物為目標(biāo)化合物。目標(biāo)化合物還經(jīng)過了質(zhì)譜表征，測得分子量為330.86，與理論計(jì)算值符合。

圖2 目標(biāo)化合物的1H NMR

圖3 目標(biāo)化合物的13C NMR

2.2 計(jì)算機(jī)模擬目標(biāo)化合物與ASCT2的相互作用

生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)模擬分子模型被廣泛用于藥物研發(fā)中[10]。通過計(jì)算模擬藥物與蛋白靶點(diǎn)對接方法中最經(jīng)典軟件是AutoDock軟件，常被用于小分子藥物配體與大分子蛋白受體的對接和虛擬篩選[11]。多數(shù)情況下，小分子化合物與靶蛋白相互結(jié)合的主要部位是蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基，這些氨基酸殘基被認(rèn)為是活性殘基。氫鍵的形成有利于目標(biāo)化合物更好地占據(jù)靶蛋白分子的活性口袋，提高與靶蛋白結(jié)合的緊密性[12]。疏水作用力也是小分子與蛋白質(zhì)相互作用的一種重要方式[13]。我們的結(jié)果顯示目標(biāo)化合物與ASCT2蛋白的Ser354具有氫鍵作用，與Asn52、Ser352、Ala355、Ile431、Pro432具有疏水作用。見圖4、圖5。

圖4 目標(biāo)化合物與ASCT2活性位點(diǎn)的立體對接圖

2.3 目標(biāo)化合物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

采用CCK-8法評價(jià)目標(biāo)化合物的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示目標(biāo)化合物作用于MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤kelly細(xì)胞48h，IC50值為176.4μmol/L；作用于BE-2C細(xì)胞48h，IC50值為421.1μmol/L；作用于NLF細(xì)胞48h，IC50值為270.3μmol/L；作用于結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞48h的IC50值為78.2μmol/L；作用于胰腺癌BXPC3細(xì)胞48h，IC50值為60.33μmol/L，且隨著化合物濃度的增加，細(xì)胞的活力逐漸下降，這種抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系(P均<0.05)，見表1。結(jié)果表明目標(biāo)化合物對不同類型的腫瘤抑制作用差異較大，對結(jié)腸癌和胰腺癌較強(qiáng)。

表1 不同濃度目標(biāo)化合物作用腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞存活率比較

3 討 論

通過酮與伯胺結(jié)構(gòu)化學(xué)物反應(yīng)生成具有亞胺結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過核磁氫譜和碳譜表征確證。進(jìn)一步計(jì)算機(jī)模擬目標(biāo)化合物與ASCT2的相互作用，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物能夠深入到ASCT2蛋白的活性口袋中，并與活性口袋周圍的氨基酸殘基形成氫鍵，具有潛在ASCT2抑制活性；CCK-8結(jié)果顯示目標(biāo)化合物對腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用。綜上所述，目標(biāo)化合物可能通過與ASCT2結(jié)合，抑制其谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，發(fā)揮抗腫瘤作用，但是其抗腫瘤活性不高，可能與結(jié)合有關(guān)，因此，后續(xù)還需把合成的目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，繼續(xù)研究其靶向ASCT2的特異性和有效性。