付楊，席俊，陳慧彬，陳陽

(河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州，450001)

大豆起源于亞洲，是一種被大面積種植的油料作物，蛋白質含量約占大豆總質量的40%[1]。大豆富含異黃酮和葉酸，能對人體健康產(chǎn)生有益的影響[2]，而被加工成各類食品，在全球范圍內被廣泛食用。但大豆也是最容易導致人體過敏的八大食品之一[3]，過敏患者會出現(xiàn)蕁麻疹、哮喘、腸道綜合征等反應，嚴重時還會造成休克威脅生命[4]。HELM等[5]發(fā)現(xiàn)大豆中獨特的蛋白質可能是大豆過敏反應的原因，尤其是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。大豆球蛋白致敏性主要取決于其單體組成亞基的過敏性，大豆球蛋白亞基在還原條件下可以解離為一條酸性多肽鏈A(30～45 kDa)和一條堿性多肽鏈B(18～20 kDa)[6]，大豆球蛋白A1a(Glycinin A1a)是大豆球蛋白G1亞基中的酸性多肽，DJURTOFT等[7]也證明免疫球蛋白E可以和所有的酸性亞基結合，現(xiàn)有報道表明大豆蛋白的致敏性源自于其酸性亞基，但Glycinin A1a亞基的具體線性B細胞表位未見報道。本實驗是對Glycinin A1a亞基上最有可能的B細胞表位進行預測。

過敏反應的產(chǎn)生要依靠免疫細胞對抗原分子的特定部位即抗原決定簇完成識別[8]，作為抗原中的線性片段或構象結構，B細胞表位能被抗體特異性識別，因此成為表位預測的重要部分。對于抗原表位的鑒定、預測，李俊慧等[9]總結了一些現(xiàn)有常用生物信息學方法和軟件。利用生物信息學軟件對蛋白組學和基因組學的原件進行模型建立，同時以數(shù)據(jù)庫中已收錄的各種抗原信息為依據(jù)，對待研究的過敏原線性表位進行篩選和預測。最后使用生物學知識和免疫學實驗來確定預測的表位是否具有功能性，這種多學科交叉的方法，不僅節(jié)約大量的人力物力，加快實驗進程，而且拓展了表位預測的技術平臺，為預測更多未知的抗原表位提供了可能。劉陽星月等[10]通過蛋白質數(shù)據(jù)庫(protein data bank，PDB)和系列生物預測軟件、在線網(wǎng)站成功預測出大豆過敏原11S球蛋白G2中A2鏈的結合表位。閆慧麗等[8]利用SWISS-MODEL和Deep View 4.1完成了大豆主要過敏原Gly m Bd 28K的同源建模和評估，預測出6個構象表位相關區(qū)段。皮江一等[11]也憑借該方法預測出了大豆主要過敏原β-伴大豆球蛋白β亞基的抗原表位，并以此為基礎對預測表位區(qū)域進行了分段克隆，抗原表位的預測成為后續(xù)抗原位置鑒定的重要前提。本研究以美國國家生物信息技術中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中得到的Glycinin A1a亞基氨基酸序列為原材料，以Glycinin A1a的高同源性蛋白質結構為模板，生成Glycinin A1a三維模型。用軟件DNAStar、SOPMA、ABCpred和BepiPred 1.0 server、DiscoTope 2.0 server分別進行線性表位和構象表位的預測。為后期大豆球蛋白免疫檢測提供理論參考；準確定位大豆球蛋白亞基的過敏位點，就可以有針對性的對過敏位點進行加工處理，為開發(fā)降低、消除大豆過敏性的食品加工技術提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

使用NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫查找出Glycinin A1a亞基所對應的氨基酸序列。該序列共有287個氨基酸排列如下：

FSSREQPQQNECQIQKLNALKPDNRIESEGGLIE-TWNPNNKPFQCAGVALSRCTLNRNALRRPSYTNGPQIYIQQGKGIFGMIYPGCPSTFEEPQQPQQRGQSS-RPQDRHQKIYNFREGDLIAVPTGVAWWMYNNEDT PVVAVSIIDTNSLENQLDQMPRRFYLAGNQEQE-FLKYQQEQGGHQSQKGKHQQEEENEGGSILSGFTL-EFLEHAFSVDKQIAKNLQGENEGEDKGAIVTVKGGL-SVIKPPTDEQQQRPQEEEEEEEDEKPQCKGKDKHCQ-RPRGSQSK

查找同源蛋白的PDB在線網(wǎng)站；用于三級結構模型建立和模型穩(wěn)定性分析的軟件SWISS-MODEL和Deep View 4.1；DNAStar軟件包中的子程序Protean；其他預測軟件：SOPMA、ABCpred、BePiPred 1.0 server和DiscoTope 2.0 server。

1.2 實驗方法

1.2.1 Glycinin A1a亞基線性表位預測

DNAStar中的Protean程序可以對氨基酸序列進行分析，包括疏水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面可及性[12]。因為所測指標與抗原表位密切相關，準確性也更強，具有較高的參考價值。

SOPMA是在線網(wǎng)站預測工具，打開網(wǎng)站頁面直接將Glycinin A1a亞基氨基酸序列以FASTA格式粘貼在序列框內，選用默認的預測參數(shù)，提交序列可得到結果。

BepiPred 1.0預測服務器基于隱馬爾可夫模型的組合和傾向量表方法對B細胞表位預測[13]。操作方法與SOPMA相類似。

ABCpred所預測的表位氨基酸數(shù)量是相等的，排列的順序是根據(jù)表位的可能性大小，預測準確性相對其他軟件較低，作為參考。使用參數(shù)參照劉陽星月等[10]的方法。

1.2.2 Glycinin A1a亞基同源建模及三維模型穩(wěn)定性評估

根據(jù)Glycinin A1a亞基的氨基酸序列在PDB網(wǎng)站上查找出相應的同源蛋白，以同源性最高的蛋白作為模板[14]，將兩者的氨基酸序列都輸入SWISS-MODEL的序列框中，采用Target-Template Alignment模式建立模型，建立的三維模型保存為PDB文件。打開Deep View4.1軟件，在“File”選項下打開模型PDB文件；在工具欄“wind”選項中點擊“Ramachandran Plot”即可得到建立模型的拉氏圖。

1.2.3 GlycininA1a亞基構象表位預測

使用DiscoTope 2.0 Server在線軟件，選擇導入的文件為同源建模保存的模型PDB文件，參數(shù)使用默認值-3.7，提交文件即可預測。

2 結果與分析

2.1 Glycinin A1a亞基的線性表位預測結果

2.1.1 DNAStar

使用DNAStar中的子程序Protean預測Glycinin A1a亞基的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)、表面可及性如圖1所示。由于抗原位點是那些被抗體識別的位點，這些位點很可能是容易接觸或在蛋白質表面的，這些區(qū)域要比內部區(qū)域更具流動性，由此推測它們是親水的，親水性越強，越容易和抗原表位結合。蛋白氨基酸殘基多數(shù)處于親水區(qū)，且分布均勻。柔韌性體現(xiàn)在圖1中藍色矩形覆蓋區(qū)，柔韌性和表面可及性較強時易于折疊、彎曲，能夠促進二級結構的形成可作為預測的重點區(qū)段[15]。抗原指數(shù)是直接就其抗原可能性預測，選擇抗原指數(shù)>0的區(qū)域作為預測的表位。預測時將這4種指標中可能性較高區(qū)段進行綜合比對，同時符合4種指標要求的序列，更有機會被視為表位。以上預測結果如表1所示。

圖1 DNAStar分析結果Fig.1 DNAStar analysis results

2.1.2 SOPMA

SOPMA可以計算出蛋白質二級結構中的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲所占的百分比，如圖2所示。Glycinin A1a亞基中無規(guī)則卷曲氨基酸殘基含量最高占50.52%，α-螺旋是由24.74%氨基酸殘基構成，β-轉角和β-折疊所含的氨基酸殘基分別占16.72%和8.01%。在蛋白質的二級結構中α螺旋和β折疊一般不作為抗原表位[16-19]，因為氫鍵的存在結構穩(wěn)定不易變形，而且α螺旋和β折疊通常位于蛋白內部，不易與受體接觸。而β-轉角和無規(guī)則卷曲一般位于蛋白質表面，為了滿足蛋白質的功能需要，表面結構必須進行適當?shù)母淖円哺菀妆蛔R別與抗原表位結合，是致敏表位的幾率更大。由此結果預測的表位如表2所示。

表1 DNAStar 預測的抗原表位Table 1 Predicted antigen epitope by DNAStar

圖2 SOPMA分析的大豆球蛋白A1a二級結構結果Fig.2 Secondary structure of the Glycinin A1a analyzed by SOPMA

2.1.3 BepiPred

BepiPred 1.0在線網(wǎng)站預測表位得到的結果如表3所示。序列段長度差別較大，但得到的表位分布較為均勻，而且序列段與DNAStar和SOPMA預測的表位位置區(qū)域高度重合，表明預測結果具有較高可信度。

表2 SOPMA 預測的Glycinin A1a抗原表位Table 2 Predicted antigen epitope by SOPMA

表3 BepriPred預測的Glycinin A1a抗原表位Table 3 Predicted antigen epitope by BepriPred

2.1.4 ABC pripred

ABC pripred對Glycinin A1a亞基預測了18個線性表位，按照可能性大小如表4排列，最有可能的線性表位處于氨基酸序列的24～33位，在綜合評價時更側重于排名前4的預測表位。通過分析發(fā)現(xiàn)排名靠前的表位大部分靠近蛋白的N端。

表4 ABC pripred預測的Glycinin A1a抗原表位Table 4 Predicted antigen epitope by ABC pripred

線性構象表位預測結果，按照劉陽星月等[10]提出的方法對4種軟件預測結果進行整合，結果如圖3所示，預測出10個可能的Glycinin A1a抗原線性表位EQPQQN、KPDNRI、NPNNK、RRPSYTNG、PQQPQQRGQS、QEQGGHQSQKGKHQQEEENE、NEGED、PPTDEQQQRP、DEKPQCKGK、RPRGS。

2.2 Glycinin A1a亞基模型的建立和穩(wěn)定性評估

同源建模是按未知結構蛋白氨基酸序列在蛋白質結構數(shù)據(jù)庫中查找出已有的相似的蛋白質的結構，然后將此蛋白結構進行優(yōu)化，進而建立出未知結構蛋白的模型[14]。SWISS-Model對大豆球蛋白A1a亞基建立模型找出大豆球蛋白A1a亞基的同源蛋白，結果顯示1FXZ(大豆球蛋白A1aB1b同源三聚體)與Glycinin A1a亞基同源性高達71%。以1FXZ為模板對大豆球蛋白A1a亞基完成同源建模，模型顯示如圖4所示。此模型符合大豆蛋白六聚體復合物結構。利用Deep view 4.1對建立出來的Glycinin A1a亞基模型進行穩(wěn)定性分析，得到的拉氏圖如圖5所示。

圖4 Glycinin A1a亞基預測模型Fig.4 Prediction model of the Glycinin A1a subunits

圖5 Glycinin A1a亞基Ramachandran plotFig.5 Ramachandran plot of the Glycinin A1a subunits

以Φ和Ψ為坐標軸所組成的二維圖，來表示α碳原子和肽平面間單鍵的旋轉形成的兩面角[20]，并不是所有Φ和Ψ形成的角都適合多肽骨架，不同的氨基酸殘基能夠穩(wěn)定存在時對Φ和Ψ值是有范圍的，根據(jù)這個范圍可將二維圖分為允許區(qū)(黃色線內區(qū)域)、最大允許區(qū)(藍色色線內區(qū)域)和不允許區(qū)[21]。由圖5計算得到Glycinin A1a亞基的氨基酸殘基超過90%落在允許區(qū)內，即建立的A1a亞基模型是可以穩(wěn)定存在的。

2.3 Glycinin A1a亞基構象表位分布

使用PyMOL軟件將DiscoTope 2.0 Server預測的Glycinin A1a亞基構象表位在模型中表示出來如圖6所示。發(fā)現(xiàn)預測的構象表位均處于模型的表面，而且較多表位處在無規(guī)則卷曲處，符合李雪嬌等[15]的實驗結果，也正是無規(guī)則卷曲部位的獨特結構使得預測的線性表位和構象表位有部分重合。經(jīng)過對線性表位和構象表位的對比發(fā)現(xiàn)：兩者雖然不是完全相同的，但是在線性表位當中包含了部分構象表位。表明預測結果符合已有研究：線性表位和構象表位之間是密切相關的[22]。

a-正面；b-反面圖6 Glycinin A1a亞基構象表位Fig.6 Glycinin A1a sub-base conformation epitope 注：紅色部分表示氨基酸數(shù)量>5個的表位，黃色部分表示 氨基酸數(shù)量≤5個的表位

3 結論

抗原表位的預測方法多種多樣，但都是基于蛋白質的結構組成和物理化學性質，在本研究中DNAStar分析了Glycinin A1a亞基的親水性、柔韌性、表面可及性、抗原指數(shù)，因為這些性質的不同是抗原表位區(qū)別于普通位點的關鍵。由于α螺旋和β折疊結構不易改變且大多位于蛋白內部難以與抗體接觸結合，不作為表位處理，相反，β轉角和無規(guī)則卷曲憑借良好的柔韌性、處于表面的優(yōu)勢可以較好的被識別，也成為表位預測的重要指標。最終得到了10個可能性較高的線性表位：24EQPQQN29、40KPDNRI45、56NPNNK60、80RRPSYTNG87、114PQQPQQRGQS123、197QEQGGHQSQKGKHQQEEENE216、247NEGED251、267PPTDEQQQRP276、285DEKPQCKGK293、299RPRGS303。本研究還對Glycinin A1a進行了構象表位的預測。預測結果與SAEED等[23]的實驗結果相符合，即抗原構象表位位于3D模型的表面。符合一般表位預測原則，處于表面的位點可以更好的與抗體嵌合。

此實驗為接下來的Glycinin A1a過敏性表位的篩選和鑒定提供了數(shù)據(jù)支持，能更有針對性的去驗證各個表位的免疫原性。也為改善加工條件，降低大豆致敏性提供理論支持。此研究借助機器預測抗原表位，避免了大量時間，人力和濕實驗的耗費[24]。更重要的是并在沒有人為干預的情況下對未知數(shù)據(jù)進行預測。大大降低了實驗的誤差。