楊靜慧，邱雪，張海紅*，郝慧慧

1(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川，750021)2(廣州基迪奧生物科技有限公司，寧夏 銀川，750021)

靈武長(zhǎng)棗(Lingwu long jujube)又名牙馬棗，因其具有個(gè)大色艷、酥脆爽口、酸甜適中、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)而榮獲了寧夏“地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”殊榮。硬度等質(zhì)地指標(biāo)是衡量鮮食靈武長(zhǎng)棗品質(zhì)的重要指標(biāo)。然而，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮食長(zhǎng)棗硬度下降、質(zhì)地劣變、水分流失，逐漸喪失了其商業(yè)價(jià)值[1]。果品質(zhì)地軟化、硬度下降與其內(nèi)部水分遷移、細(xì)胞壁降解及細(xì)胞壁降解酶的協(xié)同作用息息相關(guān)。陳國(guó)梁等[2]對(duì)木棗的研究發(fā)現(xiàn)，果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、纖維素酶(cellulase，CE)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)、多聚半乳糖酸酸酶(polygalacturonase，PG)等對(duì)果實(shí)的成熟軟化均起到一定作用。劉鑫[3]對(duì)棗皮細(xì)胞壁的變化研究表明，果實(shí)在貯藏過程中，水分處于充足而穩(wěn)定的狀態(tài)，可以抑制果皮細(xì)胞代謝酶的活性，延緩果皮物質(zhì)的分解代謝，從而減少棗果實(shí)軟化的發(fā)生。REN等[4]對(duì)番荔枝的研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)軟化伴隨著果皮硬度和水分的急劇下降，細(xì)胞壁多糖尤其是果膠多糖的降解破壞了細(xì)胞壁的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，引起了水分自高自由度向低自由度遷移，導(dǎo)致采后番荔枝果實(shí)軟化。LIU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，杏果在采后貯藏期間硬度下降，果膠多糖逐漸降解， 水溶性果膠(water solute pectin，WSP)、螯合性果膠(chelate solute pectin，CSP)和半纖維素(hemicellulose，HC)的鏈長(zhǎng)和鏈寬值均逐漸減小。WANG等[6]利用原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)，從微觀角度對(duì)黃花和沾花2個(gè)棗樹品種在生熟期和成熟期2個(gè)時(shí)期進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度的增加，其CSP鏈中的長(zhǎng)鏈寬鏈都有所減少。

本文擬以靈武長(zhǎng)棗為研究對(duì)象，研究長(zhǎng)棗果實(shí)在貯藏期間細(xì)胞壁多糖納米結(jié)構(gòu)的降解規(guī)律，探究硬度變化與細(xì)胞壁多糖及其降解酶活性、水分的內(nèi)在聯(lián)系，解析長(zhǎng)棗貯藏過程中細(xì)胞壁多糖納米結(jié)構(gòu)降解對(duì)其硬度變化的響應(yīng)機(jī)理，為其采后貯藏保鮮技術(shù)的開發(fā)、品質(zhì)調(diào)控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈武長(zhǎng)棗采自寧夏靈武市大泉林場(chǎng)棗園。選取同株體上大小相似，外形完好，且無病蟲害，無機(jī)械損傷，八成熟、帶柄的靈武長(zhǎng)棗。長(zhǎng)棗被采摘后，以聚苯乙烯泡沫箱緩沖包裝后，在0～4 ℃環(huán)境下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并在4 ℃冰箱中貯藏備用。

無水乙醇、咔唑，天津市瑞金特化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜、1,2-環(huán)己二胺四乙酸，天津市津科精細(xì)化工研究所；氯仿，中國(guó)宿州化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硼氫化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；溴百里酚藍(lán)，上海麥克林生化科技有限公司；聚半乳糖醛酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TAXT PLUS/50 物性測(cè)定儀，英國(guó)Stable Micro system Ltd 公司；NMI20-040V-I低場(chǎng)核磁共振儀，上海紐邁電子科技有限公司；GL-20C高速冷凍離心機(jī)，北京哈納科儀科技有限公司；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

依據(jù)長(zhǎng)棗保鮮期，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)周期為16 d。從第0天開始，每4 d從預(yù)處理樣品中隨機(jī)抽取1組，進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.1 硬度測(cè)試

選用P/2n針狀探頭(直徑2 mm)，設(shè)定測(cè)前速度5 mm/s，貫入速度1 mm/s, 測(cè)后速度5 mm/s，最小感知力5 g，穿刺深度5 mm，在整棗赤道部位均勻取3點(diǎn)，用TAXT PLUS/50物性測(cè)定儀對(duì)整果進(jìn)行硬度測(cè)試[7]。

1.3.2 水分遷移測(cè)試

用取樣器取出被測(cè)長(zhǎng)棗后，去皮，切取約10 mm×10 mm×20 mm大小的組織塊放入核磁檢測(cè)管(70 mm)，置于低場(chǎng)核磁共振儀(low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR)的永久磁場(chǎng)中心位置的射頻線圈的中心，利用多脈沖回波序列(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)測(cè)量樣品的橫向弛豫時(shí)間T2[8]。參數(shù)設(shè)置：90 ℃ 脈沖時(shí)間為16 μs，180 ℃脈沖時(shí)間為34 μs，測(cè)定溫度為32 ℃，質(zhì)子共振頻率為24 MHz，采樣間隔為3 000 ms，回波時(shí)間為1 ms，累加次數(shù)為4次，回波個(gè)數(shù)為1 000。每個(gè)樣品重復(fù)3次，將T2進(jìn)行反演，得到反演圖。

1.3.3 細(xì)胞壁多糖的制備和提取

參照BRAHEM等[9]，曹建康等[10]的提取方法，并略加修改。果膠含量用咔唑法測(cè)定，纖維素、半纖維素含量用蒽酮法測(cè)定[10-11]。

1.3.4 CSP納米結(jié)構(gòu)測(cè)量

分別將0、16 d的CSP提取液，稀釋到合適的濃度，取15 μL提取液至潔凈云母片上，室溫下干燥待用。利用AFM(Nano ScopeⅢa型)以非接觸模式進(jìn)行測(cè)試，用Nanoscope軟件分析果膠分子的聚集體、分支結(jié)構(gòu)、鏈寬等屬性。以界面分析法分析果膠分子聚集體和單個(gè)分子的鏈寬W和鏈高V，其中圖像亮和暗的部分分別表示果膠鏈中高和低的部分。單個(gè)分子的寬度可用軟件中的半峰寬測(cè)定，鏈寬值出現(xiàn)的次數(shù)記為頻率(Fq)。每組利用多個(gè)平行樣品得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果[12]。

1.3.5 細(xì)胞壁相關(guān)酶活性的測(cè)定

長(zhǎng)棗切丁后，立即將果肉冷凍在液氮中，并貯存在-80 ℃下，用于細(xì)胞壁及降解酶活力的測(cè)定。取3.0 g長(zhǎng)棗果實(shí)進(jìn)行粗酶液提取。PG、PME、CE、β-Gal的提取均參照曹建康等[10]的方法。

1.3.5.1 PG活力測(cè)定

參照徐曉波[13]的測(cè)定方法，并略加修改。

1.3.5.2 PME活力測(cè)定

參照ZHANG等[14]的方法，并略加修改。

1.3.5.3 CE活力測(cè)定

參照曹建康等[10]的測(cè)定方法，并略加修改。

1.3.5.4 β-Gal活力測(cè)定

參照GWANPUA等[15]的測(cè)定方法，并略加修改。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用軟件DPS 9.50[16]在參數(shù)之間進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析以及鄧肯式多重差異分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用Origin 2019繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間長(zhǎng)棗硬度變化規(guī)律

硬度是衡量鮮食靈武長(zhǎng)棗質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的重要指標(biāo)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)棗果實(shí)硬度顯著降低，且前8 d為快速軟化期。如圖1所示，貯藏期間靈武長(zhǎng)棗硬度介于63.07～70.69 N，0 d時(shí)的硬度為70.69 N，分別是4、8、12、16 d的1.03、1.09、1.10、1.12倍。

圖1 靈武長(zhǎng)棗貯藏期間硬度的變化Fig.1 Changes in hardness during storage of Lingwu long jujube 注：同一指標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 貯藏期間棗果水分遷移規(guī)律

貯藏過程中，伴隨著長(zhǎng)棗果實(shí)硬度的降低，長(zhǎng)棗細(xì)胞內(nèi)水分發(fā)生了遷移。圖2為靈武長(zhǎng)棗序列反演獲得的T2水分典型峰型圖，T2譜中有3個(gè)波峰，T2值越小，越靠近圖的左側(cè)分布，棗果的水分活度越低。由于液泡膜和原生質(zhì)膜阻礙了水分的遷移，因而水分的弛豫時(shí)間有明顯的間隔。根據(jù)T2弛豫時(shí)間的差異，可將長(zhǎng)棗中的水分劃分為3種狀態(tài)，分別標(biāo)記為T21(0.01～3.51 ms)、T22(3.51～37.64 ms)、T23(37.64～932.60 ms)[17]，即細(xì)胞壁水、細(xì)胞質(zhì)水和液泡水，其對(duì)應(yīng)的峰面積分別為A21、A22、A23。

圖2 靈武長(zhǎng)棗T2水分峰型圖Fig.2 Water peak pattern of T2 of Lingwu long jujube

T2弛豫的相對(duì)峰面積可以表征不同結(jié)合狀態(tài)的水分含量。峰面積的變化可以反映出水分之間的相互轉(zhuǎn)化及其遷移[18]。圖3為靈武長(zhǎng)棗在貯藏過程中A21、A22、A23的變化趨勢(shì)圖。前4 d，細(xì)胞壁水水分含量基本不變，第4天開始顯著下降(P<0.05)。細(xì)胞質(zhì)水水分含量在4 d前緩慢上升，4～8 d內(nèi)快速升高，第8天達(dá)到峰值，存在顯著差異(P<0.05)。液泡水水分含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，整體呈下降趨勢(shì)，差異顯著(P<0.05)。這可能是因?yàn)榈?天時(shí)大分子物質(zhì)降解，細(xì)胞壁水轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)水，第8天時(shí)細(xì)胞質(zhì)水轉(zhuǎn)變?yōu)橐号菟?/p>

2.3 貯藏期間長(zhǎng)棗果實(shí)細(xì)胞壁多糖組成的變化規(guī)律

果膠、半纖維素和纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分，在果實(shí)貯藏期間，WSP、CSP、堿溶性果膠(sodium carbonate-soluble pectin，SSP)表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。如表1所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，WSP含量逐漸升高，差異顯著(P< 0.05)。CSP含量先增加后降低。SSP、HC、CE含量變化趨勢(shì)相近，均在第4天時(shí)達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢(shì)，在第8～12天貯藏期內(nèi)急劇下降，表明細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受損，果實(shí)軟化[19]。

a-A21、A22變化曲線；b-A23變化曲線圖3 A21、A22、A23隨貯藏時(shí)間變化曲線Fig.3 A21、A22、A23 changes of storage time

表1 靈武長(zhǎng)棗貯藏期間細(xì)胞壁物質(zhì)降解規(guī)律單位：mg/100g FW

2.4 貯藏期間長(zhǎng)棗果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活性

棗果采摘后，仍保持著一定的生理活性。PG主要通過水解細(xì)胞壁內(nèi)存在的多聚半乳糖醛酸中的α-1,4-半乳糖苷鍵，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，使果實(shí)軟化。如圖4-a所示， 隨著貯藏期的延長(zhǎng)，伴隨著棗果硬度的降低，PG含量整體呈上升趨勢(shì)，第12天到達(dá)果實(shí)含量最高點(diǎn)后略有下降，差異顯著(P<0.05)。β-Gal活力整體呈“升-降-升”的趨勢(shì)，并存在顯著性差異(P<0.05)，貯藏末期β-Gal含量是貯藏初期的1.81倍。

a-PG、β-Gal活性變化；b-PME、CE活性變化圖4 靈武長(zhǎng)棗貯藏期間酶活性的變化Fig.4 Changes of enzyme activity during storage of Lingwu long jujube

PME能夠催化果實(shí)內(nèi)聚半乳糖醛酸甲酯的酯鍵水解，形成果膠酸。如圖4-b所示，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，PME活力呈上升趨勢(shì)，差異顯著(P<0.05)。CE主要功能是分解含1,4-β-葡萄糖基鏈的半纖維素基質(zhì)多糖[20]，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，長(zhǎng)棗的CE含量由13.35 U/g逐漸上升至40.12 U/g，差異顯著(P<0.05)。棗貯藏過程中，細(xì)胞壁降解酶的變化及其協(xié)同作用，是造成棗果宏觀硬度降低、質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣變的主要因素。

2.5 棗果硬度、細(xì)胞壁組分及其降解酶活力之間的相關(guān)分析

水分含量、細(xì)胞壁組分及其降解酶與果實(shí)硬度的相關(guān)性研究如表2所示。果實(shí)硬度與細(xì)胞壁水水分含量、液泡水水分含量及HC含量呈極顯著正相關(guān)，與WSP、CSP、PG、PME、β-Gal、CE含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。各相關(guān)指標(biāo)與硬度的相關(guān)程度依次為：WSP(-0.97)=CSP(-0.97)=β-Gal (-0.97)>A23(0.96)、PG(-0.96)=CE (-0.96)>A21(0.94)>PME(-0.93)>HC(0.87) >CE (0.770 0) >SSP(0.460 0)>A22(-0.180 0)。

表2 不同貯藏期紅棗果實(shí)硬度與各指標(biāo)的相關(guān)性Table 2 Correlation between fruit hardness and index of jujube in different storage period

2.6 棗果硬度、細(xì)胞壁組分及其降解酶活力之間的通徑分析

為進(jìn)一步分析各指標(biāo)對(duì)長(zhǎng)棗硬度所起的真正作用，對(duì)其進(jìn)行通徑分析。結(jié)果如表3所示，各因素對(duì)棗果硬度的直接通徑系數(shù)大小依次為CSP (-0.492 8)>β-Gal(-0.281 3)>A23(0.262 4)。對(duì)棗果硬度的貢獻(xiàn)率大小依次為CSP (0.478 0)>β-Gal (0.272 9)>A23(0.251 9)，與直接通徑系數(shù)相一致。其中CSP和β-Gal活性對(duì)棗果硬度下降起促進(jìn)作用，而A23起正向作用，有利于減緩紅棗果實(shí)硬度的下降，上述因素決定了長(zhǎng)棗硬度變異的99.979%，同時(shí)有0.014%的變異是由其他因素和試驗(yàn)誤差引起的。

表3 不同貯藏期紅棗果實(shí)硬度與各指標(biāo)的通徑分析Table 3 Hardness of jujube fruit in different storage periods and its path analysis

2.7 細(xì)胞壁多糖的納米結(jié)構(gòu)變化

為了進(jìn)一步從微觀角度解析長(zhǎng)棗貯藏過程中硬度變化的機(jī)理，以AFM進(jìn)行CSP降解的形態(tài)學(xué)研究。如圖5所示，棗果貯藏初期CSP分子以聚集體結(jié)構(gòu)(圖5-A中“P”)，豐富的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)及復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)(圖5-A中的“Lc”“Br”)形式存在。貯藏末期的聚集體結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)較初期的明顯減少，大多以短鏈結(jié)構(gòu)存在。表4給出了CSP分子的鏈寬及鏈高分布，貯藏初期的鏈寬值大多集中在35.156～58.594 nm，最高達(dá)到78.125 nm，對(duì)應(yīng)的鏈高值大多在2 nm左右。而在貯藏末期，隨著聚集體與長(zhǎng)鏈的減少、支鏈的增加，短鏈(15.625、19.531、23.438、31.252 nm)，出現(xiàn)的次數(shù)及頻率均有所增加，與初期存在較大的差異，表明CSP在貯藏過程中降解顯著。

表4 貯藏期間靈武長(zhǎng)棗CSP鏈寬度的頻率和高度Table 4 Frequency and height of CSP chain width

3 結(jié)論與討論

果實(shí)軟化是果實(shí)衰老的重要特征之一，棗果軟化是由多種細(xì)胞壁降解酶協(xié)同作用下促使細(xì)胞壁多糖降解而引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所導(dǎo)致，最后降低了硬度，水分遷移發(fā)生變化。本研究結(jié)果表明，在靈武長(zhǎng)棗貯藏過程中，伴隨著棗果硬度的降低，細(xì)胞壁降解酶活性增加，從而引起細(xì)胞壁多糖降解，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，水分遷移。CSP、β-Gal和液泡水水分含量對(duì)棗果軟化衰老起著重要作用。CSP與β-Gal對(duì)棗果硬度下降起促進(jìn)作用，彭勇等[21]在桃的研究中發(fā)現(xiàn)，桃在貯藏期間，隨著桃硬度的下降、細(xì)胞壁發(fā)生降解，與本文研究結(jié)果一致；液泡水水分含量的降低使果實(shí)硬度下降，這與王娟等[22]研究結(jié)果一致。PG、PME、CE和β-Gal等細(xì)胞壁修飾酶均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升狀態(tài)，且對(duì)棗果硬度有一定的影響。有研究表明[23]，β-Gal可以降解果膠多聚醛酸側(cè)鏈的半乳糖殘基，改變分子鏈的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞壁膨脹，結(jié)合水減少，自由水增多。本實(shí)驗(yàn)中，棗果的β-Gal活性在貯藏前期出現(xiàn)了高峰，可以推測(cè)該酶可能在棗果軟化前期起重要作用。

以AFM對(duì)CSP降解的形態(tài)學(xué)研究表明，貯藏初期與末期，棗果的CSP存在較大差異。貯藏初期棗果的CSP分子以聚集體、長(zhǎng)鏈及支鏈結(jié)構(gòu)形式存在，其鏈寬值大多集中在35.156～58.594 nm，最高達(dá)到78.125 nm，對(duì)應(yīng)的鏈高值大多都在2 nm左右。伴隨著棗果硬度的下降，貯藏末期的聚集體結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)較初期的明顯減少，短鏈(15.625、19.531、23.438、31.252 nm)出現(xiàn)的次數(shù)及頻率均有所增加，與初期存在較大的差異，表明CSP在貯藏過程中降解顯著。CSP結(jié)構(gòu)變化是引起長(zhǎng)棗硬度降低的主要因素。綜上所述，靈武長(zhǎng)棗在采后貯藏過程中，伴隨細(xì)胞壁降解酶活性的增加，引起細(xì)胞壁多糖的降解，破壞了細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，水分與硬度也同步發(fā)生變化。相關(guān)分析結(jié)果表明，CSP、β-Gal和液泡水水分含量是影響棗果硬度的主要因素，為靈武長(zhǎng)棗貯藏保鮮技術(shù)的開發(fā)提供了理論支持。