蔡其霖，黎文星，嚴(yán) 真，尹莉芳，*

（1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，南京 210009；2江蘇省緩釋智能制劑及關(guān)鍵功能性輔料開發(fā)與評價工程研究中心，南京 210009）

利福平（rifampicin）作為一種抑制RNA 聚合酶的大環(huán)類抗生素，不僅是世界衛(wèi)生組織推薦的抗結(jié)核病一線藥物，也是治療藥物敏感性結(jié)核病最有效的藥物［1］。利福平的用量占抗結(jié)核藥物總量的四分之一，且被陸續(xù)開發(fā)出新的臨床應(yīng)用，如治療阿爾茨海默病等［2］。目前已上市的利福平劑型有片劑、注射劑、膠囊劑、滴眼劑、乳膏劑、口服混懸液等。藥物因分子的排列方式不同而表現(xiàn)出不同晶型的情況被稱作藥物多晶型，利福平結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，存在多種晶型，目前已發(fā)現(xiàn)7 種［3］。藥物的晶型不同可能會導(dǎo)致其理化性質(zhì)不同，也可能影響體內(nèi)的溶解和吸收情況，從而影響生物利用度。由于忽視藥物多晶型導(dǎo)致藥物在生產(chǎn)、儲存甚至上市后出現(xiàn)生物利用度顯著變化的案例并不罕見。例如，氯霉素棕櫚酸酯3種不同晶型的生物利用度差異非常顯著，就曾發(fā)生由于忽視對多晶型的研究導(dǎo)致上市制劑生物利用度顯著降低的事故［4］。有文獻(xiàn)表明，利福平Ⅰ型與Ⅱ型均屬于有效晶型，其中Ⅰ晶型為穩(wěn)定晶型，Ⅱ晶型為亞穩(wěn)定晶型［5］。利福平這兩種晶型都被開發(fā)成上市制劑，本文將研究利福平晶型的差異對生物利用度的影響。

基于生理學(xué)的藥動學(xué)（PBPK）模型是一種建立在藥物基本理化性質(zhì)、制劑的生物藥劑學(xué)屬性、實(shí)驗(yàn)個體的生理生化特征等基礎(chǔ)上模擬藥物在實(shí)驗(yàn)個體體內(nèi)藥物動力學(xué)過程的模型［6］。PBPK模型的核心就是根據(jù)實(shí)驗(yàn)個體的生理學(xué)特征將其簡化為多個參數(shù)化的生理房室［7］，預(yù)測藥物在生物體內(nèi)藥動學(xué)行為，從而模擬出藥物在血漿和組織中的濃度變化情況［8］。建立PBPK 模型的策略在全球眾多頂尖制藥公司中都得到了應(yīng)用，F(xiàn)DA 也在藥物相互作用指導(dǎo)原則中推薦采用PBPK 建模的方法來預(yù)測可能存在的藥物相互作用［9］。

GastroPlusTM是美國Simulations Plus 公司研發(fā)的一款基于生理學(xué)的藥動學(xué)/藥效動力學(xué)（PBPK/PD）模擬軟件，具有模擬并預(yù)測不同制劑在胃腸道各個區(qū)域的吸收情況、體內(nèi)溶出情況和血藥濃度-時間曲線［10］等多種功能。本研究運(yùn)用GastroPlusTM軟件，通過建立利福平口服給藥的PBPK模型，模擬出給藥后的血藥濃度-時間曲線，預(yù)測藥物的吸收情況，分析健康人體口服不同晶型的利福平后的體內(nèi)藥動學(xué)行為，通過區(qū)別不同晶型的利福平在人體中藥動學(xué)行為的差異，指導(dǎo)利福平產(chǎn)品的臨床應(yīng)用與制劑開發(fā)。

1 材 料

1.1 原料藥及試劑

利福平［晶型Ⅰ批號：1812218（M），晶型Ⅱ批號：1811178（M）］；布洛芬（山東新華制藥股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉［亞什蘭（中國）投資有限公司］；二甲基亞砜（上海泰坦科技股份有限公司）；肝素鈉［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；甲醇、乙腈（美國天地有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為市售分析純。

1.2 動 物

Wistar 大鼠，體重250 g，雄性，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0006。

1.3 儀 器

GastroPlusTM軟 件（Version 9.8，美 國Simula?tion-Plus 公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀［沃特世（科技）上海有限公司］；D8 ADVANCE 型X 射線衍射儀（德國布魯克公司）；RC806D 溶出試驗(yàn)儀（天大天發(fā)科技有限公司）；UV1800 紫外分光光度計(jì)［島津企業(yè)管理（中國）有限公司）］。

2 方 法

2.1 X射線粉末衍射

使用X 射線衍射儀通過銅靶采集數(shù)據(jù)，采集條件為40 kV 和40 mA。掃描范圍為3~40°（2θ），步長為0.02°（2θ），每步停留時間為1 s。分別對兩種晶型的利福平進(jìn)行掃描，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

根據(jù)掃描結(jié)果可知，兩種晶型的利福平具有明顯不同的特征峰，晶型Ⅰ的特征峰為13.70°和14.40°，晶型Ⅱ的特征峰為9.92°和11.12°，與dePinho Pessoa Nogueira 等［11］研究的圖譜特征峰基本一致。兩種晶型的利福平均呈現(xiàn)尖銳的衍射峰，表明兩者的結(jié)晶性均較好。

Figure 1 PXRD patterns of rifampicin form I and II（The position of the arrow indicates the characteristic peak）

2.2 平衡溶解度

利福平在BCS 分類上屬于Ⅱ類，具有低溶解度，高滲透性的特點(diǎn)。為了比較晶型Ⅰ和晶型Ⅱ利福平在溶解度性質(zhì)的差異，選擇了不同pH 梯度的介質(zhì)進(jìn)行考察。平衡溶解度測定結(jié)果如圖2所示。

Figure 2 Equilibrium solubility of two crystal forms of rifampicin

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，晶型Ⅰ（穩(wěn)定晶型）與晶型Ⅱ（亞穩(wěn)定晶型）在溶解度方面特征相似，都表現(xiàn)出明顯的pH 依賴性，呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。在pH 1.0 介質(zhì)中溶解度最大，而后溶解度急劇減小，當(dāng)介質(zhì)pH 大于4.0時溶解度又逐漸增大。從整體來看，利福平穩(wěn)定晶型和亞穩(wěn)定晶型的溶解度無顯著差異。

2.3 體外溶出試驗(yàn)

固體制劑在口服后，藥物的吸收取決于藥物從制劑中溶出或釋放的情況、藥物在生理?xiàng)l件下的溶解情況及在胃腸道的滲透情況。對于BCS Ⅱ類藥物而言，溶出是限制藥物吸收的關(guān)鍵步驟。考慮到消化道的生理環(huán)境復(fù)雜，各部位之間的pH跨度較大，因此選擇pH 覆蓋范圍較廣的多種溶出介質(zhì)測定溶出曲線，能盡可能較全面地反映藥物在不同pH 環(huán)境下的溶出情況，建立更全面的體內(nèi)外相關(guān)性。

為模擬利福平在體內(nèi)釋放情況，參照“日本藥品體外溶出試驗(yàn)信息庫”，分別選取pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽緩沖溶液、pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液和水作為溶出介質(zhì)，進(jìn)行晶型Ⅰ與晶型Ⅱ利福平體外溶出試驗(yàn)。稱取原料藥150 mg，將藥物粒徑控制在75~150 μm，選擇槳法，轉(zhuǎn)速50 r/min，介質(zhì)溫度（37 ± 0.5）℃，介質(zhì)體積900 mL 的條件進(jìn)行溶出。兩種晶型利福平在4 種介質(zhì)中的溶出結(jié)果見圖3。

根據(jù)體外溶出結(jié)果可知，在pH 1.0 鹽酸溶液中，1 min 時累積溶出度達(dá)到90%，5 min 時基本溶解完全，兩種晶型的原料藥在該介質(zhì)中的溶出速率無明顯差異，說明兩種晶型的利福平都能在酸性的胃部里迅速溶出完全，結(jié)合溶解度數(shù)據(jù)，預(yù)測利福平在經(jīng)過胃部后會以溶液的形式進(jìn)入腸道。而在其他3種介質(zhì)中，晶型Ⅱ利福平的溶出速率均快于晶型Ⅰ利福平。這是由于在這3種介質(zhì)中，利福平的平衡溶解度均較小，兩種晶型原料藥之間的溶出速率差異得以體現(xiàn)，而這種溶出速率的差異可能是由于不同晶型的極性表面和非極性表面的不同，使得不同晶型利福平被水性介質(zhì)潤濕的難易程度不同，但由于利福平在到達(dá)腸道時基本是溶液狀態(tài)，且大部分利福平口服速釋制劑的用法是空腹服用，這3種介質(zhì)中的溶出速率不再是限制藥物吸收的關(guān)鍵步驟。

3 體內(nèi)研究

3.1 建立大鼠靜脈給藥PBPK模型

3.1.1 基本信息及靜脈給藥藥動學(xué)研究 建立PBPK 模型所用的利福平理化性質(zhì)參數(shù)見表1。利福平理化性質(zhì)參數(shù)主要來源于Drugbank 數(shù)據(jù)庫、發(fā)表文獻(xiàn)、軟件計(jì)算值及軟件默認(rèn)值。

Figure 3 Dissolution curves of two crystal forms of rifampicin powder in different medium

Table 1 Parameters required for PBPK model establishment

選取健康的體重約為250 g 雄性Wistar 大鼠6 只，實(shí)驗(yàn)期間正常飲食，自由飲水，飼養(yǎng)溫度控制在（20 ± 5）℃、飼養(yǎng)濕度控制在30% ~ 70%。配制4 mg/mL 的10%DMSO-生理鹽水利福平溶液，按照20 mg/kg的給藥劑量對大鼠進(jìn)行尾靜脈注射。

分別于大鼠尾靜脈給藥后0.16，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h用毛細(xì)玻璃管從眼眶靜脈叢取血，血漿樣品處理后用高效液相色譜法進(jìn)行血藥濃度測定。

血漿樣品處理方法：取血漿樣品100 μL，置于離心管中，加入2 mg/mL 布洛芬內(nèi)標(biāo)液20 μL 及乙腈250 μL，渦旋混勻，15 000 r/min 條件下離心，取上清液作為供試品溶液，用于高效液相色譜分析。

色譜柱選擇C18柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）-乙腈-甲醇（30∶20∶50），柱溫為40 ℃，檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

最終測定的靜脈給藥后血藥濃度-時間曲線見圖4。

3.1.2 建立大鼠靜脈給藥PBPK 模型 首先在GastroPlusTM軟件中輸入利福平相應(yīng)的理化參數(shù)及生物藥劑學(xué)參數(shù)，血漿占全血百分比取平均值55%，血漿蛋白結(jié)合率參考DrugBank 數(shù)據(jù)庫取89%。選擇生理學(xué)模型為大鼠，再向PKPlus 模塊中導(dǎo)入大鼠靜脈注射利福平后的血藥濃度數(shù)據(jù)，采用房室模型法和非房室模型法計(jì)算各房室的藥動學(xué)參數(shù)，通過比較1/Yhat^2權(quán)重的大小來確定最佳的模型，以此建立大鼠靜脈給藥的PBPK模型。

Figure 4 Profile of rifampicin in rat plasma concentration after iv ad?ministration(± s,n = 6)

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，一房室模型的R2為0.909 2，在所有擬合模型中最高，表明一房室模型為最優(yōu)模型。最優(yōu)模型擬合結(jié)果見圖5。

Figure 5 Atrioventricular model fitted by GastroPlusTM

雖然房室模型能夠更好地體現(xiàn)出藥物的藥動學(xué)特征，但選擇不同的房室模型會得到不同的藥動學(xué)參數(shù)，進(jìn)而對藥物制劑等效性的判斷產(chǎn)生影響，而非房室模型采用統(tǒng)計(jì)矩的方法，不依賴于藥動學(xué)特征，更適合用于評價生物等效性。因此本研究選擇非房室模型表征藥物的藥動學(xué)行為，計(jì)算得藥動學(xué)參數(shù)：AUC0-t為169.6 μg·h/mL、MRT 為6.326 h、CL為0.029 L/h、Vss為0.186 h、t1/2為1.691 h。

3.2 建立并優(yōu)化大鼠口服給藥PBPK模型

3.2.1 口服給藥藥動學(xué)研究 選取健康的體重約為250 g雄性Wistar大鼠12只。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)溫度控制在（20 ± 5）℃、飼養(yǎng)濕度控制在30% ~ 70%。大鼠給藥前禁食24 h，自由飲水。晶型Ⅰ與晶型Ⅱ利福平分別用1%CMC-Na 溶液配成2 mg/mL 的混懸液。將大鼠隨機(jī)分為兩組，按20 mg/kg 的給藥劑量進(jìn)行灌胃。

分別于大鼠給藥后的0.16，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h 用毛細(xì)玻璃管從眼眶靜脈叢取血，同“3.1”項(xiàng)用高效液相色譜法進(jìn)行血藥濃度測定。最終測定的兩種晶型利福平口服給藥后血藥濃度-時間曲線見圖6，相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)見表2。

Figure 6 Profiles of rifampicin in rat plasma concentration after oral administration(± s,n = 6)

Table 2 Pharmacokinetic parameters of oral administration in rats(± s,n = 6)

Table 2 Pharmacokinetic parameters of oral administration in rats(± s,n = 6)

Parameter cmax/(μg/mL)tmax/h AUC0-t/(μg·h/mL)Form I 11.19±1.81 2.00±0.66 149.36±20.52 Form II 13.70±2.78 2.00±0.60 155.11±40.81

口服給藥的利福平在被吸收后，主要通過肝臟經(jīng)去乙?；M(jìn)行代謝。原型利福平與去乙?；Ｆ綍ㄟ^膽汁排泄進(jìn)入腸道，在腸道再次被吸收入血，形成肝腸循環(huán)［13］。由于存在這種多次吸收入血的機(jī)制，會使血藥濃度出現(xiàn)先下降然后再次上升的情況，表現(xiàn)在血藥濃度-時間曲線上就是出現(xiàn)雙峰甚至多峰。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Ⅰ晶型血藥濃度-時間曲線中該現(xiàn)象較為明顯。

通過計(jì)算大鼠口服兩種晶型的利福平后的藥動學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩種晶型的用于評價生物利用的關(guān)鍵藥動學(xué)參數(shù)cmax，tmax與AUC0-t并無顯著差異。

結(jié)合靜脈給藥的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)絕對生物利用度公式：

式（1）中，AUC 為血藥濃度-時間曲線下面積（μg·h/mL），下標(biāo)po和iv 分別代表口服和靜脈給藥，D代表給藥劑量（mg/kg）。計(jì)算得晶型I利福平的絕對生物利用度為88.82%，晶型Ⅱ利福平的絕對生物利用度為89.35%。由計(jì)算結(jié)果可知，雖然利福平是BCS Ⅱ類藥物，但它的絕對生物利用度很高，兩種晶型均可達(dá)到約90%。

3.2.2 建立并優(yōu)化大鼠口服給藥的PBPK 模型在大鼠靜脈給藥PBPK 模型的基礎(chǔ)上，利用大鼠口服給藥后的實(shí)測藥動學(xué)數(shù)據(jù)來建立和優(yōu)化大鼠口服PBPK模型。

根據(jù)靜脈給藥所得的藥動學(xué)參數(shù)擬合口服數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)擬合的cmax比實(shí)測數(shù)據(jù)高，這是因?yàn)槔Ｆ骄哂懈闻K首過效應(yīng)，需要進(jìn)行考慮。將肝臟首過效應(yīng)設(shè)置為15%后，擬合結(jié)果良好。晶型Ⅰ與晶型Ⅱ口服給藥的預(yù)測結(jié)果見圖7。

Figure 7 Stimulated and observed plasma concentration for two crystal forms of rifampicin in rat(po)

根據(jù)優(yōu)化后的PBPK 模型，計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，觀測值與預(yù)測值對比結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的大鼠口服PBPK 模型的觀測值與預(yù)測值非常接近，說明該模型構(gòu)建合理。

Table 3 Comparison of pharmacokinetic parameters of oral adminis?tration in rats

利用該P(yáng)BPK 模型預(yù)測兩種晶型的利福平在大鼠體內(nèi)不同部位的吸收情況，兩種晶型之間的對比見表4。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，利福平口服給藥后在腸道吸收完全，且兩種晶型吸收情況非常相似，都表現(xiàn)為在胃部不吸收，在十二指腸、空腸和盲腸分別吸收約18%、65%和15%，在回腸幾乎不吸收。

3.3 大鼠口服給藥PBPK模型種屬外推

3.3.1 種屬外推至健康人體 不同種屬之間的清除率（CL）推算，主要采用異速增長公式，如式（2），通常情況下異速增長指數(shù)（b）的經(jīng)驗(yàn)值為0.78［13］。

可利用式（2），通過已得的利福平在大鼠體內(nèi)的血漿清除率，進(jìn)而推算人體的血漿清除率。但是由于不同藥物在不同物種內(nèi)的處置過程差異很大，所以這種推算的方法通用但不準(zhǔn)確，更推薦采用人體實(shí)測數(shù)據(jù)來得到清除率與分布容積。本研究選擇利用在FDA 查詢到的RIFADIN?IV（rifampin for injection USP）的審評文件［14］中報道的靜脈滴注血藥濃度數(shù)據(jù)（具體血藥濃度數(shù)據(jù)見表5）來獲取人體的清除率和分布容積，再通過GastroPlusTM軟件，利用優(yōu)化好的大鼠口服PBPK 模型來種屬外推至健康人體，得到健康人體的口服PBPK模型。

Table 4 Amount predicted of drug absorption in various intestinal segments after oral administration in rat

Table 5 Plasma concentrations of healthy people by intravenous infu?sion of 600 mg(infusion time 30 min,± s)

Table 5 Plasma concentrations of healthy people by intravenous infu?sion of 600 mg(infusion time 30 min,± s)

t/h 0.5 1 2 4 8 12 c(Plasma)/（mg/mL）17.4±5.1 11.7±2.8 9.4±2.3 6.4±1.7 3.5±1.4 1.2±0.6

根據(jù)FDA 審評文件提供的數(shù)據(jù)，計(jì)算得藥動學(xué)參數(shù)：AUC0-t為67.18 μg·h/mL、MRT 為4.348 h、CL為0.14 L·kg/h、Vss為0.607 L/kg、t1/2為2.590 h。

3.4 基于健康人體口服給藥PBPK模型的預(yù)測

3.4.1 構(gòu)建生理模型及設(shè)計(jì)給藥方案 選擇體重為70 kg 的健康男性，利福平給藥劑型選擇目前較為常見的膠囊，給藥劑量定為600 mg，假設(shè)給藥時需服用水200 mL。血漿蛋白結(jié)合率定為80%［15］，血漿占全血百分比取平均值55%。

3.4.2 預(yù)測結(jié)果 利用種屬外推得到的人體口服PBPK 模型，預(yù)測健康人體口服不同晶型的利福平膠囊后的血藥濃度-時間曲線、藥動學(xué)參數(shù)及吸收情況。

口服不同晶型的利福平膠囊600 mg 的模型預(yù)測結(jié)果：藥動學(xué)參數(shù)見表6，血藥濃度-時間曲線見圖8，吸收情況見表7。

Table 6 Comparison of pharmacokinetic parameters of oral adminis?tration in healthy people

Figure 8 Stimulated plasma concentration for two crystal forms of rifampicin in healthy people (po)

根據(jù)本研究建立的PBPK 模型對兩種晶型的利福平吸收部位的預(yù)測，兩種晶型的利福平在各個腸段的吸收情況并無顯著差異。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，晶型Ⅰ與晶型Ⅱ兩種利福平在人體的血藥濃度-時間曲線、藥動學(xué)參數(shù)和吸收情況非常相似，推斷兩種晶型的利福平具有生物等效性。

4 討 論

本研究先對兩種晶型的利福平進(jìn)行了體外研究，結(jié)果表明晶型Ⅰ與晶型Ⅱ利福平雖然溶解特征相似，都表現(xiàn)出明顯的pH 依賴性，但兩者除了在溶解度較高的pH 1.0介質(zhì)中的溶出行為不存在差異外，在其他3 種介質(zhì)中，晶型Ⅰ的溶出速度都顯著慢于晶型Ⅱ。由于兩種晶型的利福平的溶出曲線并不相似，所以不能通過體外溶出實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行生物利用度豁免，在制劑評價時需要進(jìn)行生物等效性實(shí)驗(yàn)。

在此體外研究的基礎(chǔ)上，本研究采用了搭建PBPK 模型的方法來進(jìn)行體內(nèi)預(yù)測。根據(jù)PBPK 模型對兩種晶型利福平的吸收部位及吸收量進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)無論是大鼠還是健康人體，兩種晶型的利福平在酸性環(huán)境的胃部都沒有吸收，但在腸道能夠被完全吸收。利福平作為一種BCS Ⅱ類藥物，根據(jù)其低溶解性和高滲透性的特點(diǎn)判斷出影響其生物利用度的關(guān)鍵步驟是制劑的溶出，但由于利福平表現(xiàn)出的溶解特點(diǎn)與吸收特點(diǎn)，無論何種晶型的利福平在強(qiáng)酸性的胃部環(huán)境中都能快速溶解完全，然后由于其高滲透性在腸道被迅速吸收。正是胃內(nèi)溶解完全和腸道吸收迅速的兩個特點(diǎn)，使得兩種晶型的利福平在pH 4.0、pH 6.8 和水這3 種介質(zhì)中的溶出行為不一致的情況下，也會由于其在pH 1.0 介質(zhì)中迅速地溶出，而表現(xiàn)出體內(nèi)藥動學(xué)行為的相似和生物利用度的等效。

Table 7 Amount predicted of drug absorption in various intestinal segments after oral administration in human

在仿制藥研發(fā)過程中，生物等效性實(shí)驗(yàn)作為最終準(zhǔn)則，存在周期長、費(fèi)用高、風(fēng)險大等問題，因此，如何在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前規(guī)避風(fēng)險就變得至關(guān)重要。本研究提供了一種新思路：在進(jìn)行體外溶出評價的基礎(chǔ)上，建立PBPK 模型進(jìn)行體內(nèi)預(yù)測，僅進(jìn)行少量動物試驗(yàn)就能夠達(dá)到預(yù)測人體生物等效性的目的，有效降低生物等效性實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險。模型預(yù)測的方法并不能完全代替人體實(shí)驗(yàn)，模型模擬的準(zhǔn)確度需要用準(zhǔn)確可靠數(shù)據(jù)加以支持，但隨著對PBPK 模型的深入研究，這一降低生物等效性實(shí)驗(yàn)風(fēng)險的建模策略將會得到更廣泛的應(yīng)用。