周 穎，趙 恂，胡 楠，王保成，袁耀佐

（1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023；2江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019；3國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品雜質(zhì)譜研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210019；4安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102；5南京威爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，南京 210009）

聚山梨酯80（polysorbate 80，PS80），商品名為吐溫80，化學(xué)名為聚氧乙烯20山梨醇酐單油酸酯，結(jié)構(gòu)見圖1。該結(jié)構(gòu)以失水山梨醇為母核，在4 個(gè)羥基端聚合了一定數(shù)目的環(huán)氧乙烷單體，形成了4個(gè)聚氧乙烯（PEG）側(cè)鏈，其中1 個(gè)側(cè)鏈的羥基端連接了一分子油酸（含有1個(gè)不飽和雙鍵的十八碳脂肪酸）。結(jié)合油酸酯的聚氧乙烯側(cè)鏈為疏水基團(tuán)，未結(jié)合的側(cè)鏈為親水基團(tuán)，這性質(zhì)使其是一個(gè)兩親性的非離子表面活性劑［1-3］。因此在藥物制劑中，PS80常用來促進(jìn)難溶性藥物的溶解，提高乳劑的穩(wěn)定性，并在生物制劑中防止蛋白分子在液-瓶與液-氣界面聚集和變性［4-6］。

Figure 1 Structure of polysorbate 80

在工業(yè)上，合成PS80主要有兩種方法：一是先酯后醚，二是先醚后酯［7］。從這兩種方法的合成過程可知，由于山梨醇失水過程不可控，PS80母核中會(huì)存在山梨醇、一失水山梨醇、異山梨醇以及分子間失水物等失水山梨醇結(jié)構(gòu)；其次，環(huán)氧乙烷聚合后產(chǎn)物呈正態(tài)分布，在其母核中存在一系列不同聚合度n的聚醚結(jié)構(gòu)；此外，由于原料油酸純度不一，PS80 結(jié)構(gòu)上結(jié)合的脂肪酸酯也不單單是油酸酯，按照《中華人民共和國藥典》（2020 年版）四部規(guī)定［8］，PS80 的脂肪酸組成中含油酸應(yīng)不低于58.0%，含肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸與亞麻酸分別不得過5.0%、16.0%、8.0%、6.0%、18.0%與4.0%，所以PS80 是一種具有復(fù)雜組分的混合物。查閱現(xiàn)有的國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)［9-11］，理論上PS80 可能是由11 大類化合物組成，包括聚氧乙烯山梨醇酐（polyoxyethylene sorbitan，PS）、聚氧乙烯山梨醇酐一油酸酯（polyoxyethylene sorbi?tan monoleate，PSM）、聚氧乙烯山梨醇酐二油酸酯（polyoxyethylene sorbitan dioleate，PSD）、聚氧乙烯山梨醇酐三油酸酯（polyoxyethylene sorbitan triole?ate，PSTri）、聚氧乙烯山梨醇酐四油酸酯（polyoxy?ethylene sorbitan tetraoleate，PSTetra）、聚氧乙烯異山梨醇酐（polyoxyethylene isosorbitan，PI）、聚氧乙烯異山梨醇酐一油酸酯（polyoxyethylene isosorbi?tan monoleate，PIM）、聚氧乙烯異山梨醇酐二油酸酯（polyoxyethylene isosorbitan dioleate，PID）、聚氧乙烯（polyethylene glycol，PEG）、聚氧乙烯一油酸酯（polyoxyethylene monoleate，PM）和聚氧乙烯二油酸酯（polyoxyethylene dioleate，PD）。

但是有研究發(fā)現(xiàn)，PS80 中含有的PIM 組分具有強(qiáng)烈的致肥大細(xì)胞脫顆粒的作用［12］，并且以異山梨醇酐為母核的組分細(xì)胞溶血率很高［13-14］。由此可見，PS80 引起的不良反應(yīng)可能與其復(fù)雜的組分有關(guān)，因此，這就需要利用先進(jìn)技術(shù)對(duì)其組分進(jìn)行檢測(cè)分析，以此全面地了解PS80，以期為安全用藥提供參考。

現(xiàn)今，用于表征PS80組分的方法手段有很多，例如高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLCELSD）［11，15-18］、高效液相色譜結(jié)合電噴霧檢測(cè)器（HPLC-CAD）［19］、高分辨質(zhì)譜（HRMS）［20］、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）［9］、超臨界流體色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（SFCQTOF-MS）［21］、核磁共振波譜（NMR）［22］、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜-核磁共振波譜聯(lián)用（UHPLCHRMS-NMR）［10，23］等。其中UHPLC-HRMS 方法因方便快速，常被研究者采用，但是，對(duì)PS80 復(fù)雜組分的快速解析測(cè)定仍存在很大的困難，為此，有研究者開發(fā)了ExcipientProfiler 藥用輔料智能分析系統(tǒng)，專門用于解析聚山梨酯系列輔料的質(zhì)譜信息［10］，該軟件依據(jù)聚山梨酯系列化合物保留時(shí)間與結(jié)構(gòu)間關(guān)系的原理，為每個(gè)組分亞類建立了預(yù)測(cè)模型，隨后通過導(dǎo)入相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，即可自動(dòng)分析，方便快速地對(duì)每一組分中每一種聚合物單體進(jìn)行定性。故本研究將采用UHPLC-HRMS 對(duì)3 家企業(yè)共10 批PS80 進(jìn)行測(cè)定，然后利用Excipient?Profiler 軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，并采用與該軟件中PS80 庫相同原理構(gòu)建的擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫進(jìn)行補(bǔ)充，希望簡單快速了解PS80的組分，以此來對(duì)采用不同工藝生產(chǎn)的市售PS80 進(jìn)行區(qū)分，為其應(yīng)用提供更好的分析方法。

1 材 料

1.1 試 劑

聚山梨酯80（南京威爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，A1批號(hào)20210304-1、A2批號(hào)20190405、A3批 號(hào)20210401、A4 批 號(hào)20180606、A5 批 號(hào)20190527；上?？房蛋录夹g(shù)有限公司提供，B1批 號(hào)2020020001、B2 批 號(hào)2020040002、B3 批 號(hào)2020110003；賽諾菲制藥有限公司提供，C1 批號(hào)AA00144-55641、C2 批號(hào)CA01016-63296，除A1 和A2 為注射級(jí)，其余均為普通級(jí)。其中南京威爾藥業(yè)的樣品合成過程為先醚后酯［7］，其余未知。）

甲酸（FA，美國ACS 恩科化學(xué)）、乙腈（ACN，德國默克公司）均為質(zhì)譜級(jí)；無水乙酸鈉（色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏飲用水。

1.2 儀器、軟件及數(shù)據(jù)庫

超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1290 超 高 效液 相 色 譜、Agilent 6546 Q-TOF 質(zhì) 譜（美國安捷倫公司）；IKA MS 3 Digital 渦旋混勻器（德國艾卡公司）。ExcipientProfiler 藥用輔料智能分析系統(tǒng)（科邁恩（北京）科技有限公司，軟件PS80庫中結(jié)合脂肪酸的組分僅為聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯類）；Agilent MassHunter PCDL Manager PS80相關(guān)擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫（安捷倫公司提供，該擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫中結(jié)合脂肪酸的組分包含了聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯類、聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯類、聚氧乙烯山梨醇酐棕櫚酸酯類和聚氧乙烯山梨醇酐硬脂酸酯類組分）。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

參照文獻(xiàn)以及ExcipientProfiler 藥用輔料智能分析系統(tǒng)的SOP擬定了以下實(shí)驗(yàn)條件［10］。

2.1.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC Protein BEH C4柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水（含5 μmol 乙酸鈉）為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫：0 ~ 15 min，10% ~ 100% B；15 ~ 18 min，100% B；流速為0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 Dual AJS ESI 離子源，正離子檢測(cè)模式；干燥氣流速：8 L/min；干燥氣溫度：250 ℃；霧化氣壓力：35 psi（1 psi= 6.895 kPa）；鞘氣流速：11 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：500 V；掃描模式：Auto MS/MS；掃描范圍：m/z100 ~ 3 000；Fragmentor：160 V；CE電壓：80 eV（雙電荷）、120 eV（單電荷）；動(dòng)態(tài)排除，排除持續(xù)0.5 min。

2.2 樣品制備

精密吸取樣品10 μL，置于10 mL 玻璃離心管中，加入10%乙腈5 mL 溶解，渦旋1 min 混勻，用0.22 μm微孔過濾器過濾，取濾液進(jìn)行分析。

2.3 ExcipientProfiler軟件解析的結(jié)果

根據(jù)ExcipientProfiler 軟件中的SOP 設(shè)置參數(shù)：以［PSM（n= 20）+ Na］+理論m/z1 331.827 3為校準(zhǔn)參數(shù)，該成分保留時(shí)間允許的最小偏差≤1 min，最大偏差≤2 min；質(zhì)譜分析中單電荷m/z偏差±0.005%，雙電荷m/z偏差±0.005%。然后將適當(dāng)格式的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入，即可找到PS80 質(zhì)譜圖中加合Na+的不同組分峰及其相關(guān)信息：各組分的分布圖（圖2）、每一組分中含有不同聚合度化合物的數(shù)量（表1）和各組分的聚合度信息。

2.3.1 各組分的分布 以樣品A1、A3、B1、C2 為例，PS80 中PEG、PS、PI 這3 類組分的保留時(shí)間為2.50~4.50 min，PSM、PIM、PM 這3 類組分主要的保留時(shí)間為8.50~10.00 min，PSD、PID、PD這3類組分的保留時(shí)間則分布在11.75 ~ 13.50 min 內(nèi)，而PSTri 組分的保留時(shí)間為13.50 ~ 15.50 min，詳見圖2。比較發(fā)現(xiàn)PS80 中不同類組分保留時(shí)間的不同，與組分的親水性和油酸基團(tuán)數(shù)有關(guān)，這與文獻(xiàn)所述相符［10］。

2.3.2 各組分的數(shù)量 比較樣品中各個(gè)組分不同聚合度化合物的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，每批樣品中PSM、PIM、PM 這3 類組分的組分個(gè)數(shù)均為最多，且這3 類組分的組分?jǐn)?shù)在注射級(jí)樣品中占總個(gè)數(shù)約為70%，普通級(jí)樣品中占總個(gè)數(shù)55% ~ 60%，即結(jié)合了一油酸酯的組分的組分?jǐn)?shù)較多。從PS80的結(jié)構(gòu)來看，這是因?yàn)橐呀?jīng)結(jié)合了1分子油酸的聚氧乙烯側(cè)鏈具有一定的空間位阻；同時(shí)由于結(jié)合一油酸酯的組分表面活性較強(qiáng)，爭奪電荷的能力強(qiáng)，質(zhì)譜響應(yīng)高能被檢出，所以結(jié)合二油酸酯和三油酸酯的組分組分?jǐn)?shù)較低。但是注射級(jí)樣品（A1、A2）較普通級(jí)樣品組分總個(gè)數(shù)少，具體數(shù)據(jù)見表1，這可能與其生產(chǎn)工藝相關(guān)。

Figure 2 Total ion chromatogram of A1 (I-1), A3 (II-1), B1 (III-1) and C2 (IV-1); and component distribution map of A1 obtained by the Excipient?Profiler software(I-2),A3(II-2),B1(III-2)and C2(IV-2)

2.3.3 各組分的聚合度 通過ExcipientProfiler軟件對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的解析也能得到PS80樣品各組分側(cè)鏈中PEG 的聚合度n（n=x+y+z+w）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，10 批樣品中PEG 組分的聚合度n可能在13 ~34 間，PS 組分n= 9 ~ 39，PI 組分n= 19 ~ 41，PSM組分n= 1 ~ 60，PIM 組分n= 1 ~ 60，PM 組分n=1~60，PSD 組分n=4~25，PID 組分n=3~59，PD組分n=4~60，PSTri組分n=10~49。由此可見，PS80 的單一組分中有不同聚合度的化合物，且各組分間的聚合度也不相同，因此對(duì)10 批樣品中各組分的聚合度進(jìn)行整理歸納，聚合度以中位數(shù)表示，詳見表2。表中數(shù)據(jù)顯示，注射級(jí)PS80 的PSD組分聚合度較普通級(jí)PS80 小，猜測(cè)可能是在生產(chǎn)注射級(jí)時(shí)對(duì)其酯化過程進(jìn)行了控制，基于此能與普通級(jí)樣品進(jìn)行區(qū)分。

2.4 擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫解析的結(jié)果

本研究所用為安捷倫提供的PS80擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫（Agilent database），該擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建原理與ExcipientProfiler 軟件中PS80 庫相同，均是依據(jù)文獻(xiàn)中PS80各組分聚合度與保留時(shí)間之間存在的關(guān)系來建立數(shù)學(xué)模型［10］。在此基礎(chǔ)上，將質(zhì)譜得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中理論值進(jìn)行匹配，并根據(jù)匹配得到結(jié)果進(jìn)行篩選，以此來確定樣品中含有的組分。與ExcipientProfiler 軟件中PS80 庫不同的是，擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫中結(jié)合脂肪酸的組分不僅含有聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯類組分，還包括聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯類、聚氧乙烯山梨醇酐棕櫚酸酯類和聚氧乙烯山梨醇酐硬脂酸酯類組分，且數(shù)據(jù)庫能夠?qū)⒓雍狭薔a+或的組分峰識(shí)別到。

Table 1 Polysorbate 80 component count of different grades from different enterprises obtained by the ExcipientProfiler software*

Table 2 Information of degree of polymerization of polysorbate 80 component obtained by the ExcipientProfiler software*

因此利用數(shù)據(jù)庫對(duì)PS80 組分進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這10 批樣品中不單單含有聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯類組分，還含有聚氧乙烯山梨醇酐其他脂肪酸酯類組分。注射級(jí)樣品中含有結(jié)合了硬脂酸的PSM 組分（PSM-stearate）、結(jié)合了棕櫚酸的PIM和PM 組分（PIM-palmitate、PM-palmitate）以及結(jié)合了月桂酸的PSTri 組分（PSTri-laurate）。除了上述組分，普通級(jí)樣品中還包含了結(jié)合月桂酸和硬脂酸的PIM 組分（PIM-laurate、PIM-stearate）與PM 組分（PM-laurate、PM-stearate），結(jié)合月桂酸和棕櫚酸的PSD 組分（PSD-laurate、PSD-palmitate），以及結(jié)合棕櫚酸的PID組分（PID-palmitate）。說明油酸原料中不僅含有油酸，還有其他脂肪酸的存在，因此在PS80中具有一定量的其他脂肪酸酯類組分。此外，注射級(jí)樣品的其他脂肪酸酯類組分?jǐn)?shù)較普通級(jí)樣品少（見表3），這與注射級(jí)樣品所用的原料油酸純度較高這一事實(shí)相符，且能佐證ExcipientPro?filer軟件中組分?jǐn)?shù)比較結(jié)果。

3 討 論

3.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

ExcipientProfiler 軟件中SOP 的質(zhì)譜參數(shù)是依據(jù)Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 來設(shè)定的，而本研究采用的是Agilent 6546 Q-TOF，兩者儀器硬件具有差異，故需要優(yōu)化參數(shù)。通過改變干燥氣流速、干燥氣溫度、鞘氣流速、鞘氣溫度、霧化氣壓力以及碎裂電壓的參數(shù)，來提高其離子響應(yīng)。此外，由于本系統(tǒng)中［M+NH4］+響應(yīng)較高，故加入適量乙酸鈉增加了［M+Na］+的響應(yīng)，以此來使ExcipientProfiler軟件解析更加準(zhǔn)確。

Table 3 Component count of polysorbate 80 combined with other fatty acids obtained by the Agilent database

3.2 組分?jǐn)?shù)結(jié)果分析

采用SPSS 26.0 版軟件，對(duì)ExcipientProfiler 軟件解析的結(jié)果進(jìn)行聚類分析，以表1中各組分的組分?jǐn)?shù)為變量，采用組間聯(lián)接，以平方歐式距離作為樣品的測(cè)度，用系統(tǒng)聚類分析法對(duì)10 批樣品進(jìn)行分析，以此來對(duì)ExcipientProfiler 軟件分析結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用的10 批樣品可聚為2 類，其中樣品A1、A2 聚為一類，A3~A5、B1~B3、C1~C2 聚為一類，因此，從組分?jǐn)?shù)的角度來看，Excipi?entProfiler軟件可對(duì)注射級(jí)與普通級(jí)樣品進(jìn)行區(qū)分（如圖3-A所示）。

由于ExcipientProfiler 軟件的PS80 庫中僅包含聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯類組分，沒有收錄聚氧乙烯山梨醇酐其他脂肪酸酯類組分，此外，現(xiàn)行版ExcipientProfiler軟件僅能識(shí)別到加合了Na+的組分峰，有誤判漏判的風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)，基于此，又采用安捷倫公司的擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，并對(duì)分析結(jié)果聚類，結(jié)果見圖3-B。當(dāng)距離刻度為25時(shí)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫的聚類結(jié)果與ExcipientProfiler軟件的分析結(jié)果一致，均為兩類；但當(dāng)距離刻度為5時(shí)，擴(kuò)展數(shù)據(jù)結(jié)果可以聚為3類，其中，B1~B3聚為一類，A3、A4、C1、C2 聚為一類，A5 單獨(dú)為一類；當(dāng)距離刻度逐漸變小，A3、A4 和C1、C2 能夠被聚為兩類，可見，擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫的組分?jǐn)?shù)結(jié)果對(duì)不同廠家有更好的區(qū)分度。

Figure 3 Dendrogram of cluster analysis of results from different methods

3.3 聚氧乙烯山梨醇酐四油酸酯的確證

由于ExcipientProfiler 軟件和擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫中均未收錄PSTetra 組分的相關(guān)信息，故不能確定PS80中是否含有四酯結(jié)構(gòu)，因此，本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)一步分析，以A1 樣品為例，其PSTetra 組 分 在14.83 ~ 15.28 min 洗 脫 出 峰，其EIC圖見圖4。

將油酸相對(duì)分子質(zhì)量以282.255 6 計(jì)，PEG 單體相對(duì)分子質(zhì)量以44.026 2計(jì)，一失水山梨醇相對(duì)分子質(zhì)量以164.068 5 計(jì)，H2O 的相對(duì)分子質(zhì)量以18.010 6 計(jì)，的質(zhì)量數(shù)以18.034 4 計(jì)，可推斷出A1 樣品中含有結(jié)合了四分子油酸的聚合度為n= 16 ~ 32 的PSTetra 組分，詳見圖4-A，其中響應(yīng)最高的離子m/z2 208.662 2 是PSTetra-oleate（n=22）加合1個(gè)NH4+所形成的（理論m/z2 207.660 3）。圖4-B 顯示的是PSTetra-oleate 組分雙電荷離子的質(zhì)譜圖，以m/z1 157.374 4的離子為例，為PSTetraoleate（n=24）加合2 個(gè)NH4+所形成的（理論m/z1 156.873 3）。由于H 同位素的存在，單電荷離子理論值和實(shí)際值相差約1，雙電荷離子相差約0.5。

Figure 4 EIC mass spectrum of PSTetra component peak of A1 sample

4 結(jié) 論

本研究采用ExcipientProfiler 軟件及PS80相關(guān)擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫對(duì)收集到的10 批不同廠家PS80 進(jìn)行組分分析，并對(duì)組分?jǐn)?shù)結(jié)果采用系統(tǒng)聚類分析，證明ExcipientProfiler 軟件能夠快速便捷地分析PS80組分，具有能用來區(qū)分不同級(jí)別樣品的優(yōu)勢(shì)。

但后續(xù)通過擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫查找和質(zhì)譜解析發(fā)現(xiàn)，PS80 中還存在四酯組分和其他脂肪酸酯類組分，而ExcipientProfiler 軟件中缺少這些信息，故需要在擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫的輔助下對(duì)PS80組分來進(jìn)一步分析。因此，ExcipientProfiler 軟件后續(xù)需要經(jīng)過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來完善其包含的信息庫，以便能更準(zhǔn)確地應(yīng)用于PS80的組分分析。