陳陽，江丹，廖子蔚，王玉，孫代華，陳志元*

1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435100；2.湖北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，湖北 黃石 435100

艾葉是菊科植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant的干燥葉，也被稱為“艾蒿”和“冰臺”，是一種藥食同源的植物資源，廣泛生長于中國華南和華北等地[1]。艾葉具有多重功效，在傳統(tǒng)功效上主要用于治療痢疾、炎癥、白血病等疾病。目前，對于艾葉的研究主要集中于黃酮類、多糖、生物堿等成分和乙醇提取物[2-3]。艾葉中存在大量的白堅(jiān)木皮醇，但純化方法研究較少，提純較為困難且沒有對艾葉中提取、純化出的白堅(jiān)木皮醇成分進(jìn)行鑒別[4]。

白堅(jiān)木皮醇（L-quebrachitol），又名2-O-甲基-L-(-)-肌醇（2-O-methyl-L-chiro-inositol）、白雀木醇，是一種天然存在、具有旋光活性的手性藥物中間體，最早從南美洲的白堅(jiān)木中發(fā)現(xiàn)。白堅(jiān)木皮醇常作為一種優(yōu)良的藥物原料用于合成具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的光學(xué)活性肌醇衍生物[5]。白堅(jiān)木皮醇藥用療效突出，現(xiàn)已被證明具有輔助治愈癌癥、促進(jìn)細(xì)胞增殖、輔助治療糖尿病、抗菌和減輕胃損傷的作用，引起了制藥領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注[6-8]。迄今為止，白堅(jiān)木皮醇的獲取主要來自于天然橡膠乳清、荔枝和沙棘，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～1.2%[9]。由于白堅(jiān)木皮醇在上述原料中含量較低、提取液中同分異構(gòu)體較多、生產(chǎn)過程需要使用大量有機(jī)溶劑等，導(dǎo)致高純度白堅(jiān)木皮醇無法工業(yè)化生產(chǎn)。筆者課題組利用結(jié)晶、重結(jié)晶的方法從艾葉藥材中制備出高純度白堅(jiān)木皮醇，通過核磁共振（NMR）和高分辨-電噴霧離子源-質(zhì)譜（HR-ESI-MS）數(shù)據(jù)確定結(jié)論的可靠性，并對白堅(jiān)木皮醇的提取、純化工藝進(jìn)行了詳細(xì)的描述，最后使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法（HPLC-ELSD）對多地區(qū)產(chǎn)艾葉進(jìn)行白堅(jiān)木皮醇含量分析，旨在為高純度白堅(jiān)木皮醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供新方法，促進(jìn)中藥資源的高效利用。

1 材料

1.1 試藥

艾葉藥材田間直采于湖北、河南等地，經(jīng)湖北師范大學(xué)張新潮副教授鑒定為菊科植物艾Artemisia.argyiLevl.et Vant.的干燥葉；95%乙醇（批號：A202010-1A）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純，批號：T202008-1G）購于賽默飛世爾科技有限公司；白堅(jiān)木皮醇對照品（批號：G3002-130UN，純度＞99.54%）購于Sigma 公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與耗材

1200 型高效液相色譜儀（安捷倫有限公司）；AB135-S 型分析天平（梅特勒-托利多公司）；Inertsil ODS-SP C18柱（島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司）；AllChrom ELSD6000 型蒸發(fā)光散射器（賽默飛世爾科技有限公司）；DSC-60PLUS 型差示掃描量熱儀（日本島津公司）；WZZ-2S 型自動(dòng)旋光儀（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；DPX-500型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）；SYNAPT G2-S 型質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；0.22 μm 微孔濾膜（批號：G122011-2T）購于天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 高純度白堅(jiān)木皮醇的制備

稱取干燥的艾葉藥材20 kg，加入15 倍質(zhì)量的80%乙醇在常溫下攪拌提取3 次，每次提取3 h，合并得到的提取液，然后70 ℃真空減壓濃縮5 h 得到艾葉提取物浸膏800 g（樣品A），在樣品A 中加入2.5倍質(zhì)量的純凈水并攪拌溶解，濾過得到濾液2.6 kg（樣品B）和不溶性浸膏150 g（樣品C），將樣品B在65 ℃條件下真空減壓濃縮3 h 得到艾葉水洗液浸膏320 g（樣品D），加入5倍質(zhì)量的90%乙醇溶解結(jié)晶得到褐色晶體74 g（樣品E），將晶體分離后加入3倍質(zhì)量的75%乙醇重結(jié)晶得到灰色晶體52 g（樣品F），最后將晶體分離再加入3 倍質(zhì)量的70%乙醇重結(jié)晶得到白色晶體36 g（樣品G）。

2.2 溶液配制

2.2.1白堅(jiān)木皮醇對照品溶液配制 精密稱定白堅(jiān)木皮醇對照品40 mg 于50 mL 的量瓶中，加純水約40 mL，超聲（250 W，53 kHz）溶解10 min 后放置至室溫，用純水溶解定容至刻度，搖勻。再精密吸取該溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，分別過0.22 μm微孔濾膜，即得系列質(zhì)量濃度的白堅(jiān)木皮醇對照品溶液。

2.2.2供試品溶液配制 精密稱定樣品A、C、F、G 各約1.0 g 分別置于150 mL 錐形瓶中，加入30%乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，53 kHz）75 min 后，放置至室溫，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 高純度白堅(jiān)木皮醇鑒定

2.3.1示差掃描量熱法（DSC）測定熔點(diǎn) 分別精確稱取樣品G 和白堅(jiān)木皮醇對照品1.0 mg，純水溶解至終質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1，在氮?dú)猸h(huán)境下注入到示差掃描量熱儀中。

樣品G 和白堅(jiān)木皮醇對照品的DSC 曲線見圖1。樣品G 和白堅(jiān)木皮醇對照品相對應(yīng)的熔融峰溫度分別為189.97 ℃和191.77 ℃。樣品G 的熔點(diǎn)非常接近白堅(jiān)木皮醇對照品，并且2 條曲線均具有非常尖銳的吸收峰且曲線重合度相似。說明樣品G 純度較高，極有可能是高純度白堅(jiān)木皮醇。

圖1 樣品G和白堅(jiān)木皮醇對照品的DSC曲線

2.3.2比旋光度測定 分別精確稱取樣品G 和白堅(jiān)木皮醇對照品1.0 mg，純水溶解至終質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1，在20 ℃條件下注入到20 cm 的旋光管中測定旋光度。為了確保測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次，并通過公式（1）計(jì)算出比旋光度值。

式中α為旋光度值；［α］為比旋光度值；L為樣品管的長度（dm）；C為樣品溶液的質(zhì)量濃度（g·mL-1）。

結(jié)果顯示，樣品G 3 次旋光度平均值是0.147±0.002，白堅(jiān)木皮醇對照品3 次旋光度平均值是0.148±0.001，經(jīng)過計(jì)算分別得出樣品白堅(jiān)木皮醇對照品樣品G和白堅(jiān)木皮醇對照品的［α］基本一致，且這2種物質(zhì)均為左旋。

2.3.3高分辨質(zhì)譜條件 將樣品G 溶解在甲醇中，終質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1，然后取樣品1.5 μL 注入進(jìn)樣口。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI）：正負(fù)離子模式；源噴霧電壓為3.5 kV（正離子模式），3.0 kV（負(fù)離子模式）；鞘氣流量為15 L·min-1；輔助氣流量為5 L·min-1；加熱毛細(xì)管溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為35 V。

高分辨質(zhì)譜圖見圖2，由HR-ESI-MS 數(shù)據(jù)可以推斷出m/z217.070 0［M+Na］+為準(zhǔn)分子離子峰，m/z411.148 6［2M+Na］+為二聚體分子離子峰，樣品G相對分子質(zhì)量為194.079 0。

圖2 樣品G高分辨質(zhì)譜圖

2.3.4NMR 分析 樣品G 的NMR 數(shù)據(jù)見圖3。1HNMR(D2O,500 MHz)δ:3.34(1H,dd,J=3.0,9.6 Hz,H-2),3.39 (3H,s,H-OMe),3.55 (2H,m,H-3,4),3.68 (1H,dd,J=9.7,3.2 Hz,H-5),4.00 (1H,t,J=3.7 Hz,H-6),4.21 (1H,t,J=3.7 Hz,H-1)；13C-NMR(D2O,125 MHz)δ:57.4 (Me),67.7 (C-1),80.7 (C-2),73.4(C-3),72.5(C-4),70.9(C-5),71.9(C-6)。

圖3 樣品G的NMR譜圖及分子結(jié)構(gòu)式

根據(jù)圖3A 并結(jié)合NMR 數(shù)據(jù)可知，δH3.3～4.3存在6 個(gè)氫信號。氫信號之一分配給δH3.39 處的3個(gè)甲氧基氫，次甲基氫存在2 個(gè)未解析的信號，產(chǎn)生多重峰（δH3.55），而4 個(gè)氫信號歸因于次甲基氫（δH3.34，3.68，4.00，4.21）。圖3B 顯示樣品G的13C-NMR 譜圖中掃描到7 個(gè)化學(xué)位移峰，包括δC67.7(C-1)，80.7(C-2)，73.4(C-3)，72.5(C-4)，70.9(C-5)，71.9(C-6)，57.4(Me)。將譜圖中的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)所報(bào)道的白堅(jiān)木皮醇信息進(jìn)行比較，結(jié)果表明樣品G 的譜學(xué)數(shù)據(jù)與天然白堅(jiān)木皮醇譜學(xué)數(shù)據(jù)相同[10]。綜合分析以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)NMR 數(shù)據(jù)并結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推斷樣品G 的分子結(jié)構(gòu)式見圖3C，分子式為C7H14O6，樣品G即為白堅(jiān)木皮醇。

2.4 白堅(jiān)木皮醇含量的測定

參照董鐵山等[11]的方法，具體色譜條件如下：Inertsil ODS-SPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；ELSD 漂移管溫度為100 ℃；氮?dú)饬魉贋? L·min-1；流動(dòng)相為乙腈-水（9∶1）；流速為0.2 mL·min-1；進(jìn)樣體積為1 μL；柱溫為35 ℃。采用HPLC-ELSD 分別對2.1項(xiàng)下樣品A、C、F和G進(jìn)行白堅(jiān)木皮醇含量測定。

4 個(gè)樣品的HPLC-ELSD 圖見圖4，圖4B 中有較多的雜峰，表明樣品A含有較多的雜質(zhì)，而圖4C中沒有出現(xiàn)代表白堅(jiān)木皮醇的峰，表明白堅(jiān)木皮醇轉(zhuǎn)移到了樣品B中，不溶性物質(zhì)樣品C基本不含有白堅(jiān)木皮醇。圖4D中出現(xiàn)的雜峰極少，表明樣品E經(jīng)過1次重結(jié)晶得到的樣品F中白堅(jiān)木皮醇的雜質(zhì)減少，而在圖4E中基本沒有雜峰出現(xiàn)，表明樣品E經(jīng)過2次重結(jié)晶后純度接近對照品。通過面積歸一化法分別計(jì)算樣品A、C、F 和G 中白堅(jiān)木皮醇的含量分別為29.53%、0.20%、83.24%、99.18%，上述數(shù)據(jù)充分證明了本研究中制備高純度白堅(jiān)木皮醇的工藝是合理的。

圖4 4個(gè)樣品的HPLC-ELSD圖

2.5 不同產(chǎn)地艾葉中白堅(jiān)木皮醇含量的測定

艾葉原料前處理方式與2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液配制方式相同。按照2.4 項(xiàng)下HPLC-ELSD 分別測定了來自河南和湖北9 個(gè)產(chǎn)地艾葉中白堅(jiān)木皮醇的含量。測定結(jié)果見表1。

表1展示了9個(gè)不同產(chǎn)地艾葉中白堅(jiān)木皮醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。從表1 中可以看出所有的艾葉樣品中都含有白堅(jiān)木皮醇，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.7～34.9 mg·g-1。2020年6月8日從湖北省麻城市采收的艾葉中白堅(jiān)木皮醇的含量最高，而不同月份在麻城市采收的艾葉中白堅(jiān)木皮醇的含量有一定波動(dòng)性，這說明艾葉的產(chǎn)地及采收時(shí)間可能對艾葉中白堅(jiān)木皮醇的含量有影響，這個(gè)研究結(jié)果與Yang 等[12]的研究結(jié)果相似。因此，筆者課題組將在下一步工作中研究艾葉采收地區(qū)和采收時(shí)間對白堅(jiān)木皮醇含量的影響，以期找到艾葉的最佳產(chǎn)地和采收時(shí)間。

表1 不同產(chǎn)地艾葉中白堅(jiān)木皮醇含量檢測結(jié)果（,n=3）

表1 不同產(chǎn)地艾葉中白堅(jiān)木皮醇含量檢測結(jié)果（,n=3）

2.6 數(shù)據(jù)處理

DSC 測定、比旋光度測定及不同產(chǎn)地艾葉中白堅(jiān)木皮醇含量的測定均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，并采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以（）表示。

3 討論與結(jié)論

白堅(jiān)木皮醇先后在白堅(jiān)木、巴西橡膠、荔枝、龍眼及沙棘果中被發(fā)現(xiàn)，因其可以作為無毒、無害原料，合成用于抗癌、輔助治療阿爾茨海默病、治療糖尿病的手性藥物而受廣大醫(yī)者的青睞。董鐵山等[13]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）證明了天然橡膠乳清中存在白堅(jiān)木皮醇，并利用乙酸和氫氧化鈣脫除天然乳清中的雜蛋白，最后使用大孔樹脂得到粗白堅(jiān)木皮醇晶體，工藝過程操作復(fù)雜、產(chǎn)率低且需使用較多的有機(jī)溶劑。綜合文獻(xiàn)還未發(fā)現(xiàn)一種簡單、高效、無毒的制備高純度白堅(jiān)木皮醇的方法，本研究將為制備高純度白堅(jiān)木皮醇提供一個(gè)新思路，從而提高艾葉藥材資源的附加值。

本研究利用醇提、水洗、析晶和重結(jié)晶的方法制備了高純度白堅(jiān)木皮醇，采用DSC、比旋光度法、NMR 和HR-ESI-MS 鑒定艾葉中分離、純化出的白色晶體為高純度白堅(jiān)木皮醇，并在此基礎(chǔ)上對樣品G 和來自不同地區(qū)的艾葉藥材進(jìn)行白堅(jiān)木皮醇含量測定。結(jié)果顯示，樣品G 與白堅(jiān)木皮醇對照品的熔點(diǎn)和比旋光度相似，NMR 和HR-ESI-MS 數(shù)據(jù)與已報(bào)道的白堅(jiān)木皮醇相同，從而鑒定得到的白色晶體樣品G 為高純度白堅(jiān)木皮醇。HPLC-ELSD 法測定出樣品G 的純度高達(dá)99.18%，且艾葉藥材中白堅(jiān)木皮醇的含量與產(chǎn)地、采收時(shí)間有關(guān)。下一步，筆者課題組將就艾葉采收地區(qū)和采收時(shí)間對白堅(jiān)木皮醇含量的影響進(jìn)行深入的研究，對白堅(jiān)木皮醇的藥理作用進(jìn)行發(fā)掘，從而擴(kuò)寬白堅(jiān)木皮醇的應(yīng)用范圍。