許蕊蕊,陳金素,李越,王秀麗*
1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 102488;2.云南省中醫(yī)醫(yī)院,云南 昆明 650021
艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLevl.Et Vant.的干燥葉,入藥始載于《名醫(yī)別錄》,其提取物艾葉油具有抗炎、止癢、抑菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[1]。通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),以艾葉油為主要藥用物質(zhì)的制劑主要有艾葉油乳-水凝膠貼膏劑、艾葉油微乳劑、艾葉油微膠囊和艾葉油驅(qū)蚊乳液等,其常用于抑菌織物制造和驅(qū)蚊[2-5]。由此可見,在艾葉油乳膏的處方優(yōu)化及藥效評(píng)價(jià)研究領(lǐng)域存在一定的空白。
鑒于揮發(fā)油的促透特性及艾葉油的抑菌作用,本研究在“藥輔合一”理論指導(dǎo)下,嘗試制備艾葉油乳膏。艾葉油在乳膏中既發(fā)揮了抗炎、止癢的藥效作用,也充當(dāng)了油相、抑菌劑、促透劑等輔料角色,替代或減少了化學(xué)輔料的應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)了加工與應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性與安全性,實(shí)現(xiàn)了艾葉油“藥之為輔,輔之為藥”的藥輔價(jià)值,拓展了艾葉油的應(yīng)用范圍,也為臨床新型制劑的開發(fā)提供了參考。
FA1204B 型分析天平(上海精密儀器儀表有限公司);3-18N 型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司);BDS260 型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);BCD-182KZ50 型電冰箱(TCL 家用電器有限公司);Captair Bio 321 Smart 型超凈臺(tái)(法國(guó)Erlab公司);HDM-型電子調(diào)溫電熱套(常州榮華儀器制造有限公司);101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)儀器分析制造廠);揮發(fā)油提取器(河南九和共創(chuàng)儀器有限公司);打孔器(上海遠(yuǎn)卓文教用品有限公司);SP60 型X-rite 色差儀(愛色麗色彩儀器商貿(mào)有限公司)。
艾葉飲片購(gòu)于安國(guó)中藥材市場(chǎng),經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)廖艷副教授鑒定為正品,符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版相關(guān)項(xiàng)下的要求。
硬脂酸(上海麥克林生化科技有限公司,批號(hào):CG10070082);單硬脂酸甘油酯(北京華威銳科化工有限公司,批號(hào):C10286479);甘油(北京化學(xué)試劑公司,批號(hào):000619);十二烷基硫酸鈉(廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心,批號(hào):1202021);二甲苯(重慶川東化工集團(tuán)有限公司,批號(hào):20091020);中鏈甘油三酸酯、月桂氮?酮、右旋糖酐(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào)分別為Y19J12C137892、Z13J10Y93008、S14098);復(fù)方醋酸地塞米松乳膏、糠酸莫米松乳膏(廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山何濟(jì)公制藥廠);冰片(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司,批號(hào):76747220);金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,批號(hào)分別為17121207、19089037);肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào):20190612);無水乙醇(分析純);去離子水實(shí)驗(yàn)室自制。
SPF 級(jí)昆明種小鼠100 只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0002,購(gòu)于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(BUCM-4-2019091004-3105),飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。
2.1.1艾葉油的提取 采用水蒸氣蒸餾法提取艾葉油[6]:取干艾葉一定量,置于硬質(zhì)圓底燒瓶中,加蒸餾水10倍量,用玻璃棒將其混合均勻,浸泡2 h。安裝揮發(fā)油提取器和冷凝管,回流提取6 h,收集艾葉油。
2.1.2Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選艾葉油乳膏基質(zhì)處方
2.1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]和預(yù)試驗(yàn)確定用量范圍,利用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)[8],選擇艾葉油用量(A)、單硬脂酸用量(B)、十二烷基硫酸鈉用量(C)為考察因素,每個(gè)因素選取高、中、低3個(gè)水平,設(shè)計(jì)因素水平見表1。
表1 艾葉油乳膏基質(zhì)處方篩選星點(diǎn)試驗(yàn)因素水平
2.1.2.2 考察指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法 根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]和預(yù)試驗(yàn)情況反饋,確定評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn):1)光澤度。取樣品適量,目檢外觀顏色是否一致、是否有光澤。2)均勻度。取樣品適量,目檢外觀是否有明顯顆粒,膏體是否均勻細(xì)膩。3)涂布延展性。取樣品適量,在濾紙上小心涂布,觀察其均勻涂布過程中是否產(chǎn)生顆粒,記錄結(jié)果并評(píng)分。4)離心穩(wěn)定性。取艾葉油乳膏適量,于2 mL的離心管中,4000 r·min-1離心15 min(離心半徑為5 cm),觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象,記錄結(jié)果并評(píng)分。5)耐寒性。取艾葉油乳膏適量于2 mL的離心管中于-20 ℃放置24 h,取出放至室溫,觀察實(shí)驗(yàn)樣品是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象,記錄結(jié)果并評(píng)分。6)耐熱性。取艾葉油乳膏適量于2 mL的離心管中,密封,于50 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中,恒溫保持6 h,觀察上述實(shí)驗(yàn)樣品是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象,記錄結(jié)果并評(píng)分。
評(píng)分處理[10]:光澤度、均勻度、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性各占16.67%,共100分,具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2~3。
表2 艾葉油乳膏基質(zhì)表觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
表3 艾葉油乳膏基質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
2.1.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最佳處方平行制備3 份樣品,得到基質(zhì)為黃色、表面光澤、均勻、細(xì)膩的半固體。采用X-rite 色差儀測(cè)量3批艾葉油乳膏的視感明度(L*)、色相(a*)、彩度(b*)值,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。L*值為0~100,L*值大者接近白色,小者接近黑色。
2.2.1二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 取小鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)分為低、中、高劑量藥物組,陽性對(duì)照組及空白乳膏組5組,每組10只。低、中、高劑量藥物組分別在小鼠右耳耳廓均勻涂抹艾葉油乳膏0.5、1.0、2.0 g·kg-1,陽性對(duì)照組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹復(fù)方醋酸地塞米松乳膏1.0 g·kg-1,空白乳膏組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹空白乳膏(將無藥效作用的中鏈甘油三酸酯代替處方中的艾葉油,按同樣方法即可制得空白乳膏)1.0 g·kg-1,每天3次,連續(xù)3 d,每次給藥前,先用0.9%氯化鈉溶液清洗給藥處,待皮膚干燥后給藥。第4 天涂藥1 h 后,對(duì)各組小鼠右耳給予二甲苯0.05 mL 致炎,1 h 后將小鼠頸椎脫臼處死,剪下雙耳,用直徑為8 mm打孔器將雙耳相同部位打下圓耳片,稱質(zhì)量,以左耳為對(duì)照,左右耳片質(zhì)量差為腫脹度,計(jì)算各組腫脹度,按公式(1)計(jì)算腫脹抑制率。
2.2.2右旋糖酐致小鼠瘙癢實(shí)驗(yàn) 取小鼠50 只,雌雄各半,隨機(jī)分為低、中、高劑量藥物組,陽性對(duì)照組及空白乳膏組5 組,每組10 只。低、中、高劑量藥物組分別在小鼠左后足均勻涂抹艾葉油乳膏0.50、0.75、1.00 g·cm-2,保持30 min;陽性對(duì)照組在小鼠左后足均勻涂抹糠酸莫米松乳膏0.50 g·cm-2;空白乳膏組在小鼠左后足均勻涂抹空白乳膏0.50 g·cm-2。30 min 后用0.9%氯化鈉溶液將藥物洗凈,在小鼠左后足腳墊內(nèi)注射右旋糖酐0.2 mL,自小鼠開始舔后足作為瘙癢指征,觀察并記錄10、15 min 內(nèi)小鼠舔后足次數(shù)[11-12]。
采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以()表示,采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1.1Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選處方試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選處方試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表4。
表4 艾葉油乳膏基質(zhì)處方星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與評(píng)分結(jié)果
3.1.2模型擬合 采用Design-Expert V8.0.6.1 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以綜合評(píng)分對(duì)各因素進(jìn)行模型擬合,并通過相關(guān)系數(shù)(r)等對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià),得到二次多項(xiàng)式回歸方程Y=97.60-1.12A-2.87B-0.50C+5.25AB-1.50AC-16.68A2-18.18B2-21.92C2,方差分析見表5。由此可知,r=0.996 4,P<0.01,F(xiàn)值為19.90,表明模型具有極顯著差異性;失擬項(xiàng)P=0.007 0<0.001,失擬項(xiàng)極顯著,說明該模型擬合度和可信度均有效,實(shí)驗(yàn)誤差小,可以用此模型對(duì)該處方進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。
表5 艾葉油乳膏多元回歸模型方差分析
3.1.3響應(yīng)面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程,通過Design-Expert V8.0.6.1 軟件繪制評(píng)價(jià)指標(biāo)隨因素變化的等高線圖和響應(yīng)面圖(圖1~3)。
由圖1~3可以看出,艾葉油、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉的用量對(duì)綜合評(píng)分均成拋物線形,即隨著因素的增大,綜合評(píng)分呈先增大后降低的趨勢(shì),因此,在提取工藝中適當(dāng)提高三者比例可以提高綜合評(píng)分。根據(jù)回歸模型分析且考慮實(shí)際操作的可行性,艾葉油乳膏最優(yōu)處方為艾葉油2.00 g,單硬脂酸甘油酯0.75 g,十二烷基硫酸鈉0.30 g。
圖1 艾葉油用量和單硬脂酸甘油酯用量對(duì)綜合評(píng)分的影響
將硬脂酸1.65 g、單硬脂酸甘油酯0.75 g、艾葉油2.00 g、月桂氮?酮0.13 g和適量冰片放置于容器內(nèi),水浴加熱至熔化,繼續(xù)加熱至70~80 ℃;另取處方量十二烷基硫酸鈉、甘油和適量蒸餾水(加至乳膏總量10 g),加熱至70~80 ℃,緩緩倒入硬脂酸等油相中,邊加邊攪拌,至乳化完全,放冷即得。
制得的3批艾葉油乳膏色差儀檢測(cè)結(jié)果見表6。由表6可知,利用色差儀測(cè)得的3批艾葉油乳膏的L*、a*、b*值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明3批艾葉油乳膏色澤均勻。
表6 3批艾葉油乳膏的色差儀檢測(cè)結(jié)果
圖2 艾葉油用量和十二烷基硫酸鈉用量對(duì)綜合評(píng)分的影響
圖3 單硬脂酸甘油酯用量和十二烷基硫酸鈉用量對(duì)綜合評(píng)分的影響
結(jié)果表明,空白乳膏組小鼠耳廓腫脹度為11.62 mg,低、中、高劑量藥物組小鼠耳廓腫脹度分別為9.35、7.79、6.80 mg,與空白乳膏組比較,低、中、高劑量藥物組及陽性對(duì)照組小鼠耳廓腫脹度均明顯減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),且艾葉油乳膏高劑量抗小鼠耳廓腫脹的效果優(yōu)于陽性對(duì)照組,各給藥組抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹的能力為高劑量組>陽性對(duì)照組>中劑量組>低劑量組,表明艾葉油乳膏能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎癥,提示艾葉油乳膏具有抗炎的作用,結(jié)果見表7。
表7 艾葉油乳膏對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(,n=10)
表7 艾葉油乳膏對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(,n=10)
注:與空白乳膏組比較,*P<0.05,**P<0.01;表8同。
由表8 可知,右旋糖酐致小鼠瘙癢后,空白乳膏組小鼠10、15 min 時(shí)瘙癢次數(shù)分別可達(dá)12、14次,而各給藥組小鼠的瘙癢次數(shù)明顯減少,與空白乳膏組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。說明艾葉油乳膏可顯著改善右旋糖酐導(dǎo)致的小鼠瘙癢,且隨給藥劑量的增大,抗瘙癢效果更趨明顯,提示艾葉油乳膏具有止癢的作用,具體結(jié)果見表8。
表8 艾葉油乳膏對(duì)右旋糖酐所致小鼠瘙癢次數(shù)的影響(,n=10)
表8 艾葉油乳膏對(duì)右旋糖酐所致小鼠瘙癢次數(shù)的影響(,n=10)
現(xiàn)有研究表明,艾葉油可以有效降低白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)炎癥因子的表達(dá)和分泌[13]。因此,艾葉油可以作為治療炎癥疾病的有效藥物。本研究選取了二甲苯致炎作為急性炎癥模型,其容易復(fù)制、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便,是一種常見的科學(xué)可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白乳膏組相比,艾葉油乳膏低、中、高劑量,對(duì)二甲苯所致耳腫脹急性炎癥模型小鼠的耳腫脹均有顯著的抑制作用(P<0.05,P<0.01)。相較于李波[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)中高劑量艾葉油乳膏組的抗炎作用強(qiáng)于其艾葉油稀釋液高劑量組。相較于熊瑩[2]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)中高劑量艾葉油乳膏組的抗炎作用略弱于其艾葉油高劑量組,可能是由于乳膏基質(zhì)阻擋了艾葉油與小鼠皮膚的接觸。
瘙癢是一種僅有皮膚瘙癢而無原發(fā)性皮膚損害的皮膚病癥狀。目前,瘙癢模型的制備方法主要有直接使用特定種系動(dòng)物法、炎癥介質(zhì)刺激法、化學(xué)物質(zhì)刺激法等,其中較為常用的主要是炎癥介質(zhì)刺激法和化學(xué)物質(zhì)刺激法[15]。本研究選取的是右旋糖酐致小鼠瘙癢模型,該模型重現(xiàn)方法簡(jiǎn)便易行,不會(huì)引起其他繼發(fā)反應(yīng),且癥狀與臨床接近。瘙癢次數(shù)可直觀反映瘙癢情況,也可直接證明艾葉油乳膏的藥效作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,艾葉油乳膏低、中、高劑量均可顯著減少右旋糖酐致小鼠的瘙癢次數(shù)(P<0.05,P<0.01),且高劑量組與陽性對(duì)照組差別不大,說明艾葉油乳膏外用治療瘙癢有較明顯的作用。
本研究每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置了空白乳膏組,通過觀察含/不含艾葉油的乳膏對(duì)小鼠的消炎止癢作用,從而初步判斷該乳膏中艾葉油除輔助制劑成型外,是否具有一定的藥效作用。結(jié)果表明,和空白乳膏組相比,各給藥組均能顯著發(fā)揮抗炎、止癢的藥效作用,表明艾葉油不僅可以作為艾葉油乳膏的主要成型輔料,自身也具有較強(qiáng)的藥效作用。除此之外,外用制劑的透皮作用也是制備乳膏時(shí)的難點(diǎn)、要點(diǎn),大多數(shù)外用乳膏制備時(shí)會(huì)加入一定量的化學(xué)促透劑來提高其促透性能,其實(shí)中藥中的揮發(fā)油或芳香類成分就可以促進(jìn)藥物的吸收與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),兼有促進(jìn)滲透與治療疾病的雙重特點(diǎn)[16]。已有研究表明,一些萜烯類的中藥揮發(fā)油可以直接破壞角質(zhì)層細(xì)胞脂質(zhì)屏障,影響細(xì)胞膜流動(dòng)性及膜電位,通過增加皮膚活性表皮流動(dòng)性來降低皮膚角質(zhì)層的屏障作用,發(fā)揮促滲透效果[17]。而艾葉油的主要化學(xué)成分為單萜、倍半萜、烯類和黃酮類等,因此推測(cè)其促透作用機(jī)制同上[18]。不僅如此,活血化瘀和芳香開竅類的中藥也能提高皮膚細(xì)胞的通透性、刺激皮膚腺體開口增大、改善微循環(huán)及機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)[19],而艾葉作為此類中藥的代表藥,理論上也可通過該途徑促進(jìn)藥物滲透吸收。
綜上所述,艾葉油乳膏的成型工藝及藥效評(píng)價(jià)證實(shí)了本課題組所構(gòu)思的輔料不僅起成型促透作用,同時(shí)也起到一定藥效作用,證明了“藥輔合一”思路的可行性及開發(fā)新型輔料的重要性。