謝皓辰，陳金素，許蕊蕊，王秀麗*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021

“藥輔合一”理論是中藥制劑中的重要原則，通常指藥物中某些藥效成分兼任輔料的角色，以減少輔料的使用。輔料在中藥制劑中，除了作為承載藥效成分的基質(zhì)外，還可以充當(dāng)藥效成分，一同幫助中藥制劑發(fā)揮臨床藥效。由于中藥成分的復(fù)雜性和治療目的的多樣性，在中藥制劑的制備中，“藥”與“輔”之間并沒有明顯的界限。利用藥效成分的特殊物理化學(xué)性質(zhì)，將其作為輔料，可以減少中藥制劑中輔料的量，提升中藥制劑的安全性和經(jīng)濟(jì)性。

丁香為桃金娘科植物丁香Eugenia caryophyllataThunb.的干燥花蕾，丁香酚是丁香揮發(fā)油中的主要藥效成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌和止癢的作用[1]。有研究表明，由于丁香酚結(jié)構(gòu)中的苯酚類結(jié)構(gòu)，使其即使稀釋2000 倍，仍具有明顯的抑菌效果[2]。因丁香酚確切的抗炎、抑菌效果與良好的促透作用，其常被制備成微乳劑、凝膠劑等外用制劑。但微乳劑制備相對困難、黏度低、對皮膚刺激性較大、不易在皮膚表面附著，且丁香酚水溶性差，不考慮制成水凝膠。脂凝膠雖有藥物貯庫效應(yīng)，但丁香酚穩(wěn)定性較差，不宜過多添加，因此也不宜制成凝膠劑[3]。相較于微乳劑與凝膠劑，乳膏劑制備工藝簡單，可以均勻溶解藥物有效成分，涂抹于皮膚可以使有效成分均勻釋放，既起到隔離作用，可避免外來刺激和感染，又可消炎、止痛，改善局部血液循環(huán)，同時(shí)有利于創(chuàng)面組織的修復(fù)和再生。

本研究基于“藥輔合一”這一中藥復(fù)方制劑中的重要指導(dǎo)原則，以丁香酚為油相制備乳膏，既可以發(fā)揮丁香酚抗炎、止癢、抑菌的藥理作用，又可以利用丁香酚良好的脂溶性和促透性[4]發(fā)揮其作為乳膏油相基質(zhì)和促透劑的作用。

1 材料

1.1 儀器

CP225D 型電子分析天平（Sartorius 公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BDS260 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)儀器分析制造廠）；3-18N 型臺式高速離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）；SDPTOP SZN型解剖顯微鏡（尼康株式會社）。

1.2 試藥

無水乙醇（分析純，北京化工廠）；去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）；硬脂酸、丁香酚（批號分別為CG10070052、C11384667，上海麥克林生化科技有限公司，純度≥99%）；單硬脂酸甘油酯（批號分別為CG10070082、C10286479，北京華威銳科化工有限公司）；甘油（批號：000619，北京化學(xué)試劑公司）；十二烷基硫酸鈉（批號：1202021，廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心）；尼泊金乙酯、羧甲基纖維素鈉（批號分別為20190907、20151107，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山何濟(jì)公制藥廠）；二甲苯（批號：20091020，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌（批號分別為19089037、17121207，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級昆明種小鼠100 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0002，購于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（BUCM-4-2019091004-3105），飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。

2 方法

2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面法篩選丁香酚乳膏基質(zhì)處方

2.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硬脂酸、單硬脂酸甘油酯和丁香酚的用量是影響丁香酚乳膏質(zhì)量的主要因素。因此，探究不同水平下丁香酚用量（A）、硬脂酸用量（B）和單硬脂酸甘油酯用量（C）對綜合評分（Y）的影響，見表1。本實(shí)驗(yàn)將以Y為評價(jià)指標(biāo)，每個(gè)因素設(shè)置低、中、高3 個(gè)水平，通過Box-Behnken 響應(yīng)面法來探究丁香酚乳膏的最優(yōu)配方。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化丁香酚乳膏基質(zhì)處方試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.2評價(jià)指標(biāo)和方法 本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)，將從均勻性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性和耐熱穩(wěn)定性方面評價(jià)丁香酚乳膏質(zhì)量并評分[5-6]，用最終綜合評分來篩選出最優(yōu)配方。丁香酚乳膏基質(zhì)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。按公式（1）計(jì)算綜合評分。

表2 丁香酚乳膏基質(zhì)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

各項(xiàng)指標(biāo)評價(jià)方法：1）均勻性。取樣品適量，觀察丁香酚乳膏顏色、光澤是否均一，質(zhì)地是否光滑，靜置1 h是否自然分層；2）涂布延展性。取樣品適量，在載玻片上涂布，涂布過程中觀察有無結(jié)塊，是否產(chǎn)生顆粒；3）離心穩(wěn)定性。分別取出等量乳膏于2個(gè)2 mL的離心管中，4000 r·min-1離心15 min（離心半徑為5 cm），注意有無氣泡產(chǎn)生，有無分層、變色等油水分離的現(xiàn)象；4）耐寒穩(wěn)定性。分別取等量乳膏于3 個(gè)2 mL 的離心管中，密封，置-20 ℃保存24 h，取出放至室溫，觀察有無氣泡產(chǎn)生，是否發(fā)生分層、變色等油水分離的現(xiàn)象；5）耐熱穩(wěn)定性。分別取等量乳膏于3 個(gè)2 mL 的離心管中，密封，置50 ℃恒溫箱中，恒溫保持6 h，觀察有無氣泡產(chǎn)生，是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象。

2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

取昆明種小鼠50只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄參半，隨機(jī)分成低、中、高劑量組、陽性對照組及空白乳膏組，共5組，每組10只。在空白乳膏組小鼠右耳耳廓內(nèi)外均勻涂抹空白乳膏0.1 g·kg-1；低、中、高劑量丁香酚乳膏組，分別在小鼠右耳耳廓內(nèi)外均勻涂抹丁香酚乳膏0.1 g·kg-1；陽性對照組，在小鼠右耳耳廓內(nèi)外均勻涂抹復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 g·kg-1。各項(xiàng)處理均為2次/d，共處理7 d。每次給藥前，先用0.9%氯化鈉溶液清洗小鼠耳廓，待皮膚干燥后給藥。另外，各組均同時(shí)給左耳涂抹與右耳等質(zhì)量的0.9%氯化鈉溶液。第7天涂藥20 min后，對各組小鼠左右耳涂抹0.05%二甲苯溶液致炎，每只0.05 mL，40 min后，脫頸椎處死小鼠，剪下雙耳，在雙耳相同部位打下8 mm圓耳片，稱質(zhì)量，以左耳作對照，左右耳片質(zhì)量差為腫脹程度，依據(jù)公式（2）求出腫脹抑制率[7]。

2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

從-80 ℃冰箱取凍存的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌種，室溫解凍，在超凈臺中分別接種于肉湯培養(yǎng)基中。在37 ℃的環(huán)境下，培養(yǎng)24 h。選用標(biāo)準(zhǔn)菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，調(diào)整菌液吸光度為0.1后備用。

取無菌液體培養(yǎng)基20 mL 于直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，室溫冷凝固化。取備用菌液50 μL，均勻涂布于培養(yǎng)基表面，用直徑為6 mm 的打孔器在中央位置打孔，并用所制高、中、低劑量的丁香酚乳膏填滿缺孔，密封后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出測量抑菌環(huán)直徑。每個(gè)劑量均設(shè)3 個(gè)平行組。

2.4 磷酸組胺致小鼠瘙癢實(shí)驗(yàn)

取昆明種小鼠50 只，體質(zhì)量為（20±2）g，雌雄各25 只。實(shí)驗(yàn)前1 d 用脫毛膏脫去頸部毛發(fā)，脫毛局部均未出現(xiàn)明顯的損傷。將小鼠隨機(jī)分成5 組，分別為低、中、高劑量丁香酚乳膏組、陽性對照組及空白乳膏組，每組10 只。每只小鼠在脫毛處涂抹0.05%磷酸組胺溶液20 μL，30 min內(nèi)小鼠如不呈現(xiàn)抓撓動(dòng)作（即后爪連續(xù)搔抓磷酸組胺涂抹部位），需再次涂抹磷酸組胺，直至出現(xiàn)瘙癢反應(yīng)為止，記錄磷酸組胺的累計(jì)用量。低、中、高劑量藥物組分別在小鼠頸部脫毛處均勻涂抹丁香酚乳膏0.1 g·kg-1，陽性對照組在小鼠頸部脫毛處均勻涂抹復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 g·kg-1，空白乳膏組在小鼠頸部脫毛處均勻涂抹空白乳膏0.1 g·kg-1，每天3次，連續(xù)3 d，每次給藥前，用0.9%氯化鈉溶液清洗小鼠頸部脫毛處，待0.9%氯化鈉溶液干燥后給藥，連續(xù)處理6 d。第7天給藥后，在創(chuàng)面處涂抹0.05%磷酸組胺20 μL，于無干擾環(huán)境下觀察小鼠30 min 內(nèi)搔抓總次數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 處方優(yōu)化結(jié)果

3.1.1Box-Behnken 響應(yīng)面法篩選處方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果 Box-Behnken 響應(yīng)面法篩選處方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 丁香酚乳膏處方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及評分結(jié)果

3.1.2模型擬合 運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1 軟件，以Y對自變量進(jìn)行模型擬合，使用相關(guān)系數(shù)（r）評價(jià)擬合模型，通過比較擬合度，得到回歸方程Y=96.00+3.25A+3.25B+0.94C-3.75AB-2.81AC-3.44BC-11.63A2-9.12B2-15.82C2，方差分析見表4。由此可知，r=0.995 5，P＜0.000 1，F(xiàn)值為173.86，表明模型具有極顯著差異性；失擬項(xiàng)P=0.106 9＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型精確度和精密度均較好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對丁香酚乳膏處方進(jìn)行分析和預(yù)測。

表4 丁香酚乳膏多元回歸模型方差分析結(jié)果

3.1.3響應(yīng)面優(yōu)化分析 運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1 軟件，繪制不同影響因素對綜合評分的等高線圖和響應(yīng)面圖，以獲知各影響因素的交互作用對綜合評分的影響。

由圖1～3 可知，丁香酚、單硬脂酸甘油酯和硬脂酸的用量對綜合評分均成拋物線形，即隨著因素的增大，綜合評分呈先增大后降低的趨勢，因此，在提取工藝中適當(dāng)提高三者比例可以提高綜合評分。通過軟件分析以上各項(xiàng)數(shù)據(jù)，并結(jié)合實(shí)際可操作性，確定最佳處方為丁香酚的用量為1.0 g、硬脂酸的用量為1.65 g、單硬脂酸甘油酯的用量為0.75 g，該處方實(shí)際操作性好，可以作為丁香酚乳膏的最優(yōu)基本基質(zhì)處方。

圖1 丁香酚用量和硬脂酸用量對綜合評分的影響

圖2 丁香酚用量和單硬脂酸甘油酯用量對綜合評分的影響

圖3 硬脂酸用量與單硬脂酸甘油酯用量對綜合評分的影響

3.2 乳膏的制備方法

將硬脂酸1.65 g、單硬脂酸甘油酯0.75 g、丁香酚1.00 g放置于坩堝內(nèi)，水浴加熱至液態(tài)，繼續(xù)加熱至75～80 ℃，將所得液體作為油相；另取處方量的十二烷基硫酸鈉、甘油和蒸餾水置于坩堝內(nèi)，水浴加熱至溶化，繼續(xù)加熱至75～80 ℃，將所得的液體作為水相。將油相緩緩倒入水相中，邊加邊攪拌，待乳化完全后，從水浴鍋上取下，密封于陰涼處放置即得。將無藥效作用的中鏈甘油三酸酯代替處方中的丁香酚，按同樣方法即可制得空白乳膏。將處方中丁香酚用量替換為0.75、0.50 g，則分別得中劑量乳膏和低劑量乳膏。

3.3 丁香酚乳膏對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白乳膏組相比，高、中、低劑量丁香酚乳膏組和陽性對照組均能有效降低小鼠兩耳片質(zhì)量的差值，減輕小鼠耳腫脹情況，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），且高劑量組的腫脹抑制率為72.60%，高于陽性對照組，表明丁香酚乳膏可以抑制二甲苯引起的炎癥，具有明顯的抗炎效果，具體結(jié)果見表5。

表5 丁香酚乳膏對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的抑制作用（,n=10）

表5 丁香酚乳膏對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的抑制作用（,n=10）

注：乳膏用量均為0.10 g·kg-1；與空白乳膏組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；表7同。

3.4 丁香酚乳膏體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抑菌圈的檢測是為了對比丁香酚乳膏不同劑量組的抑菌活性大小，抑菌圈越大，說明抑菌活性越好。抑菌圈直徑為6 mm即為與打孔器直徑相同，無抑菌作用。對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈檢測結(jié)果表明，丁香酚乳膏對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且相同的給藥劑量下丁香酚乳膏對金黃色葡萄球菌的抑制作用更強(qiáng)，具體結(jié)果見表6。

表6 丁香酚乳膏體外抑菌作用（,n=3）

表6 丁香酚乳膏體外抑菌作用（,n=3）

3.5 丁香酚乳膏對磷酸組胺致小鼠瘙癢反應(yīng)的影響

與空白乳膏組相比，中、高劑量丁香酚乳膏組可以減少磷酸組胺所致的小鼠搔抓次數(shù)（P＜0.05），且隨給藥劑量的增大，抗瘙癢效果更趨明顯，陽性對照組可以顯著減少搔抓次數(shù)（P＜0.01），表明丁香酚乳膏可以抑制磷酸組胺引起的瘙癢反應(yīng)，提示丁香酚乳膏具有止癢效果，具體結(jié)果見表7。

表7 丁香酚乳膏對磷酸組胺致小鼠瘙癢的抑制作用（,n=10）

表7 丁香酚乳膏對磷酸組胺致小鼠瘙癢的抑制作用（,n=10）

4 討論

通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)以丁香酚為主要藥用物質(zhì)的制劑主要有丁香酚微乳劑、丁香酚微乳凝膠、丁香酚凝膠與丁香酚納米乳等，常用于殺螨、抗炎、鎮(zhèn)痛[8-12]。由此可見，在利用丁香酚的油性物質(zhì)性質(zhì)將其制成乳膏，用于抗炎、止癢的研究領(lǐng)域存在一定的空白，且乳膏劑相較于微乳劑與納米乳劑，制備工藝簡單、穩(wěn)定性強(qiáng)，可以均勻溶解藥物有效成分，更好地發(fā)揮藥效。但曾有研究報(bào)道，7月齡嬰兒誤食丁香酚出現(xiàn)蛋白尿病變及凝血?。粍?dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，丁香酚會引起胃腸炎和厭食癥[2]。因此，在使用丁香酚乳膏的過程中，應(yīng)注意不要入口，不建議給嬰幼兒使用。

“藥輔合一”理論是傳統(tǒng)中藥制劑理論與實(shí)踐成果中的思想精華，蘊(yùn)含著實(shí)踐的智慧。本研究中丁香酚具有良好的脂溶性且熱穩(wěn)定性良好，因此，可以作為油相中的良好基質(zhì)，參與構(gòu)成穩(wěn)定的乳膏結(jié)構(gòu)。另外，丁香酚具有較強(qiáng)的促透性，其促皮吸收機(jī)制與薄荷醇相似，既能直接毀壞角質(zhì)層細(xì)胞的脂質(zhì)屏障，又能改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，影響細(xì)胞膜膜電位，破壞角質(zhì)層的屏障功能[13]，發(fā)揮促滲透效果。丁香酚不僅可以作為丁香酚乳膏的主要成型輔料，自身也具有較強(qiáng)的藥效作用，體現(xiàn)了“藥輔合一”制劑理念中“藥之為輔”與“輔之為藥”的設(shè)計(jì)應(yīng)用規(guī)律。這一制劑理念不僅可以用于指導(dǎo)中藥制劑方法的創(chuàng)新，還能啟示輔料對于制劑的巨大價(jià)值，對于開發(fā)新型輔料等具有重大意義。同時(shí)，也需要跟進(jìn)新型藥用輔料的不良反應(yīng)、使用條件和與之配套的質(zhì)量檢測方法研究，以期對“藥輔合一”理念有更加科學(xué)、標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用。

5 結(jié)論

綜上所述，本研究制得的丁香酚乳膏具有優(yōu)良的抗炎、止癢效果和一定的抑菌作用。該乳膏的研制為丁香酚新用途的探索和丁香臨床應(yīng)用的拓展提供了參考。