韋祖猛 田 鑫 李 唐 王 興 廖金花 彭雙鳳 凌 利 李 林

慢性心力衰竭由多種病因導致的以心室充盈或射血能力受損為特點的一組臨床綜合征。主要臨床表現(xiàn)為心功能受損誘發(fā)的呼吸困難、乏力，以及肺循環(huán)、體循環(huán)淤血導致的組織水腫，其病情復雜，預后差，病死率高。在中醫(yī)歷代文獻中，此病常因其癥狀特點而被歸屬于“心悸、怔忡、胸痹、心水、喘咳、 水腫”等病證的范疇，屬本虛標實、虛實夾雜之證，其病位在心，五臟相關，以心之氣陽虧虛為本，痰濁、瘀血、水飲為標。江西中醫(yī)藥大學劉中勇教授具多年辨治心力衰竭經(jīng)驗，認為其病在除心之外的四臟中，尤以脾腎與之最為密切，故提出補腎啟樞治法，并在溫陽利水名方真武湯的基礎上自擬補腎啟樞強心顆粒以辨治此病，臨床療效確切[1]。該方藥物組成為炮附片、黨參、淫羊藿、菟絲子、茯苓、白術、陳皮、桂枝、澤瀉、豬苓、甘草，其中炮附片溫腎助陽強心，配淫羊藿、 菟絲子以加強補腎溫陽作用，黨參益氣健脾啟樞，合茯苓、白術、陳皮、甘草理氣健脾利水共助開啟中焦樞機，此8味藥物即為補腎啟樞治法的核心藥物組成。運用現(xiàn)代科學技術與方法揭示中醫(yī)理論的科學內(nèi)涵是當今中醫(yī)藥研究的重要內(nèi)容之一，而將理論梳理與方藥分析相結合的研究方式是豐富和發(fā)展中醫(yī)理論的有效途徑[2]。研究擬在闡釋補腎啟樞法中醫(yī)理論內(nèi)涵的基礎上，運用網(wǎng)絡藥理學的研究方法分析補腎啟樞強心顆粒治療慢性心力衰竭的分子作用機制，進而揭示補腎啟樞法的現(xiàn)代內(nèi)涵。

1 補腎啟樞法概述

1.1 心與脾腎的生理聯(lián)系心與脾、腎在生理上彼此之間聯(lián)系緊密。心居胸中，處上，屬陽，五行屬火，腎居腰府，處下，屬陰，五行屬水，二者為水火之臟。心與腎在生理上的聯(lián)系主要表現(xiàn)為心腎相交，即正常生理狀況下，心與腎在陰陽、氣血、精神方面全面交感，彼此協(xié)調(diào)，保持動態(tài)平衡，使機體處于陰平陽秘的狀態(tài)。首先，心腎上下交通協(xié)調(diào)，共同維持機體陰陽平衡的狀態(tài)。心屬火臟，為陽中之陽，腎水(陰)在腎陽鼓動下蒸騰于上，以使心火不亢；腎屬水臟，為陰中之陰，心火(陽)賴心陰之涼潤而下行助腎，以使腎水不寒。其次，心與腎為陰陽水火之臟，相互為用。心為陽臟，主陽氣，《血證論》言：“心為火臟，燭照萬物”，此言心之陽氣推動血液運行，溫煦人體，營養(yǎng)周身，而腎陽之溫煦蒸騰亦有賴于心陽的溫化作用；腎藏先天之精，而由其分化而來的腎陰腎陽為一身陰陽之根本，故生理上，心本乎腎，心氣心陽源于腎，有賴于腎氣腎陽之溫煦。最后，心與腎精神互用，心之藏神與腎之藏精生理上聯(lián)系緊密，蓋精能化氣生神，而神能控精馭氣，相互為用則神守志清。心屬火，脾屬土，為母子之臟，生理上，二者的聯(lián)系主要表現(xiàn)為：①心與脾在血液生成上相互為用。脾為后天之本，氣血生化之源，飲食水谷經(jīng)脾胃運化而產(chǎn)生的水谷之精是血液化生的物質基礎，水谷之精化生的營氣和津液需經(jīng)心火(心陽)作用方可轉化為血液，即《血證論·陰陽水火氣血論》所言：“食氣入胃，脾經(jīng)化汁，上奉心火，心火得之，變化而赤，是之謂血”。②心與脾功能上相互助益。心屬火，以陽氣為用，且和脾為母子之臟，心陽溫煦脾陽，可助脾胃腐熟運化水谷精微；脾胃居中焦，為氣機升降樞紐，而心與腎之間的上下交通協(xié)調(diào)亦需要氣機的調(diào)暢，正如《慎齋遺書》所言:“心腎相交,全憑升降”。③心與脾在血液運行上相互協(xié)調(diào)，心主行血為血液運行提供動力，脾主統(tǒng)血以使血行脈中不溢出，其共同維持血液的正常運行。

1.2 病在心 五臟相關 重在脾腎心衰屬本虛標實、虛實夾雜之證，“病位在心，五臟相關”是其重要病機特點，其中又以脾腎與之關系更為密切。心衰作為一種漸進性發(fā)展的慢性疾病，病程長，遷延不愈，日久必損傷正氣。且疾病過程中痰飲、水濕、瘀血，病理產(chǎn)物的蓄積又會進一步耗傷正氣，病愈久則正氣愈虛，故心衰之本在于正氣虧虛。而腎藏精，主生長發(fā)育，為先天之本；脾主運化，氣血生化之源，為后天之本，人體正氣虧虛與脾腎密切相關。心與脾為母子之臟，心衰疾病進展過程中?？梢姷侥覆〖白拥那闆r，即心之氣陽虧虛為甚，不能溫煦脾陽而致脾運化失權、濕濁內(nèi)蘊、營血化源不足。臨床中心衰患者常因心功能減退伴有胃腸道瘀血而出現(xiàn)消化道癥狀即是佐證。心病及脾，中焦脾胃運化失權，則氣血化生乏源，以致心血不足，脈道空虛，進而影響心臟的搏動和血液運行；同時脾胃居中焦，為氣機升降樞紐，在水液代謝中起樞轉作用，而脾胃運化失權則水液的上騰下達受阻，易釀濕成濁化痰，邪阻于內(nèi)，脈道不利，則進一步影響心主血脈功能。心與腎為陰陽水火之臟，兩者上下交通協(xié)調(diào)的失衡?？纱蚱迫梭w陰平陽秘的狀態(tài)。慢性心衰至后期，可見心陽虧虛累及腎陽而出現(xiàn)腎陽虧虛，而腎陽虛憊又導致心陽無以為根，終致心腎陽虛之證，陽虛感寒，水濕無以溫化，泛溢肌膚則見肢體浮腫，水飲上泛凌心可見喘促不能平臥。此外腎陽不足而蒸騰作用的減弱導致腎水不能上濟于心，進而出現(xiàn)心煩、心悸、不寐等心火虛亢的表現(xiàn)。

1.3 補腎啟樞治法內(nèi)涵補腎啟樞治法是江西中醫(yī)藥大學劉中勇教授在多年辨治慢性心力衰竭的基礎上，總結分析、提煉病機而提出。劉中勇教授認為，慢性心衰為本虛標實之證，病位在心，與其余四臟均有關聯(lián)，但心與脾腎在病理生理聯(lián)系緊密，故重在脾腎。因此慢性心衰的治療當重在補虛，勿忘瀉實，治當從脾腎始之，補腎溫陽以利水、運脾啟樞以安四臟[1]。具體而言，治從脾腎，一可調(diào)補心之氣血陰陽虧虛，扶人體正氣。心本乎腎，心氣心陽源于腎，賴腎氣腎陽以溫煦，故溫補腎氣腎陽，則心陽可通；脾為后天之本，氣血生化之源，脾旺則氣血調(diào)和，真氣充沛，以維持心血充盈；同時脾腎各為先后天之本，相互資生，溫腎陽可振奮脾陽，促進水谷運化，脾旺氣血充沛，可充養(yǎng)和培育腎精。另一方面，治從脾腎可促進機體水液代謝去標實。溫補腎陽可助下焦腎與膀胱氣化，利水消腫；脾處中焦，水液的上騰下達，有賴于脾氣的樞轉，啟樞即健脾，有醒脾、動脾之意，中焦得運則有助于水濕代謝，杜絕生痰之源，同時可向下助腎與膀胱氣化，使水濕下達而出。

2 補腎啟樞治法的分子作用機制探討

2.1 資料來源研究數(shù)據(jù)來源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，STRING 11.0平臺(https://string-db.org/cgi/input.pl)及Metascape 數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html)。

2.2 研究方法①首先在 TCMSP數(shù)據(jù)庫中以口服生物利用度大于30%及類藥性大于0.18為標準，篩選炮附片、淫羊藿、菟絲子、黨參、茯苓、白術、陳皮、甘草的活性成分，同時收集上述活性成分的對應靶點；②在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“ Chronic heart failure” 及“Congestive heart failure” 為關鍵詞檢索慢性心力衰竭的相關靶點；③在Excel 2019中，對藥物活性成分及疾病靶點取交集，獲得藥物與疾病的共同作用靶點；④將交集靶點導入STRING 11.0平臺構建PPI網(wǎng)絡篩選核心靶點；⑤在Metascape 數(shù)據(jù)庫中對交集靶點進行GO功能及KEGG 通路富集分析。

3 結果

3.1 藥物成分及靶點篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到炮附片、黨參、菟絲子等8味中藥潛在活性成分共137個，對應靶點去重后共220個。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中經(jīng)關鍵詞檢索共獲得10986個疾病靶點，保留Relevance score>5.21(中位數(shù))且GIFtS>42(中位數(shù))的疾病靶點，最后獲得2924個相關度較高的靶點。運用Excel 2019對藥物靶點及疾病靶點取交集，共獲得交集靶點220個。

3.2 交集靶點的PPI網(wǎng)絡將220個交集靶點導入String平臺進行PPI網(wǎng)絡分析，置信度設置為“High confidence”，獲得的PPI網(wǎng)絡包含212個節(jié)點，1815條邊。經(jīng)統(tǒng)計，靶點蛋白平均節(jié)點度值為 17.12，超過平均度值的靶點蛋白共有72個，度值排名前20靶點見表1。研究顯示白介素家族成員(如IL-1β、IL-6)及TNF-α在內(nèi)的炎性因子在心肌纖維化過程中起促進作用，可通過作用于纖維狀前膠原α、下游信號通路NF-κB、JAK-STAT、Ras/Raf等增加多種基質金屬蛋白酶(MMP)的蛋白水平[3]。p53蛋白是一種研究較為廣泛的腫瘤抑制因子，現(xiàn)有研究顯示其通過氧化應激、細胞自噬與凋亡、內(nèi)質網(wǎng)應激引發(fā)的線粒體損傷等參與心衰的病理過程。例如p53蛋白的活化可引起B(yǎng)ax基因的轉錄上調(diào)，抑制Bcl-2基因的表達，從而促進心肌細胞的凋亡[4]。此外有研究還表明p53有助于調(diào)節(jié)線粒體和內(nèi)質網(wǎng)相互作用，在缺血再灌注損傷誘導內(nèi)質網(wǎng)應激的小鼠中將其p53蛋白基因敲除，可觀測到線粒體的保護及心肌細胞損傷的減少[5]。CASP3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，為凋亡級聯(lián)反應下游最關鍵的凋亡蛋白酶[6]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)節(jié)不同組織中的多種細胞功能。研究表明[7]，在心臟中AKT1的短期激活可促進生理性肥大，而長期AKT1激活可引起病理性肥大，且AKT 的短期激活通過抑制細胞凋亡的發(fā)生以及抑制 FOXO3a 效應子BNIP3啟動線粒體自噬而產(chǎn)生有益作用。在心肌細胞中，STAT3可促進心肌分化、血管成分形成和細胞外基質穩(wěn)態(tài)，STAT3 的活化還可保護心肌免受缺血/再灌注損傷[8]。從文獻分析可以看出這些蛋白涉及炎癥反應、心肌纖維化、心肌凋亡、細胞自噬、氧化應激等方面。推測上述靶點蛋白可能是 PPI 網(wǎng)絡中的關鍵靶點，補腎啟樞強心顆粒的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)效應很可能是通過作用于這些靶點得以發(fā)揮。

表1 PPI網(wǎng)絡核心靶點蛋白信息

3.3 GO功能及KEGG 通路富集分析將上述得到的220個相關靶點導入Metascape平臺進行GO及KEGG功能富集分析。見圖1，表2。KEGG通路富集分析篩選獲得前10條相關通路，結合文獻查證分析后發(fā)現(xiàn)，這些通路涉及心肌纖維化、氧化應激、細胞凋亡、心肌能量代謝等病理生理機制。有研究顯示，Toll樣受體信號通路與心肌自噬水平相關，研究者在心梗小鼠實驗中將通路中關鍵靶點TLR3敲除，觀測到了心肌自噬水平的抑制以及心肌梗死面積減少[9]。AGEs(晚期糖基化終末產(chǎn)物)在體內(nèi)蓄積引發(fā)的氧化應激及系統(tǒng)微炎癥可誘導心肌纖維化的發(fā)生，是糖尿病心肌病患者心功能惡化的重要原因[10]。PI3K-Akt信號通路是參與細胞增殖調(diào)控的重要通路，與細胞凋亡的信號調(diào)節(jié)相關，AKT的活化可直接抑制BAD等促凋亡蛋白活性或FoxO等轉錄因子產(chǎn)生的促凋亡信號,從而起到抑制心肌凋亡的作用[11,12]。HIF-1 信號通路同樣與細胞凋亡相關，作為PI3K-AKT的下游信號通路，AKT1的活化可增加HIF-1α表達而對缺氧導致的心肌凋亡起到抑制作用[13]。環(huán)磷腺苷(cAMP)信號與心肌收縮力相關，β1-AR/β2-AR的激活可上調(diào)cAMP的表達，cAMP 激活PKA，進而磷酸化心肌細胞的相關調(diào)節(jié)蛋而增強心肌收縮力，起到正性肌力作用[14]。PPAR及AMPK信號通路與心肌細胞的能量代謝調(diào)節(jié)相關，研究顯示，PPAR-α及AMPK可在基因轉錄水平上對能量代謝的進行調(diào)節(jié)，上調(diào)PPAR-α/AMPK信號通路的表達， 可促進線粒體的生物發(fā)生，從而改善衰竭心臟的能量代謝,延緩心衰進展[15]。

表2 KEGG通路富集分析結果

圖1 GO 生物學過程分析(Biological process)、 GO 細胞組分分析(Cellular component)、GO 分子功能分析 (Molecular function)

GO功能注釋獲得相關條目28條。GO-BP(生物過程)涉及炎癥反應、活性氧代謝過程、凋亡信號通路的調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)反應的調(diào)控、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程等；GO-CC(細胞組分)涉及細胞質囊泡內(nèi)腔、內(nèi)質網(wǎng)腔、溶酶體、線粒體外膜、RNA聚合酶II轉錄調(diào)節(jié)復合物、Bcl-2家族蛋白復合物、蛋白激酶復合物等；GO-MF(分子功能)涉及氧化還原酶活性、蛋白質結構域特異性結合、血紅素結合、腎上腺素受體活性、兒茶酚胺結合。上述GO功能注釋條目提示處方的調(diào)控效應與循環(huán)過程中的心血管效應、細胞凋亡、能量代謝相關。

4 結語

補腎啟樞治法是江西中醫(yī)藥大學劉中勇教授在多年的慢性心衰辨治基礎上提出的，其立法選藥整體契合于慢性心衰本虛標實的病因病機。此研究對補腎啟樞治法的理論內(nèi)涵作初步分析，同時結合生物信息學的方法對補腎啟樞治法的現(xiàn)代科學內(nèi)涵作了初步探討。研究結果顯示補腎啟樞法治療慢性心力衰竭涉及的機制包括心肌纖維化、氧化應激、細胞的自噬與凋亡、心肌能量代謝等。心肌纖維化是心力衰竭進展的必然過程，延緩心肌纖維化的進展對維持心臟的收縮舒張功能極為關鍵。心肌細胞自噬與凋亡是心肌缺血、缺血再灌注、壓力超負荷誘導心肌肥厚和心力衰竭時所發(fā)生的病理、生理改變。正常范圍內(nèi)的自噬與凋亡可以維持人體細胞的正常生理機能，但自噬與凋亡的水平過高和過低則會引發(fā)疾病。在心衰疾病進展過程中，心肌細胞的能量代謝在底物利用方式及中間代謝過程發(fā)生紊亂，使心肌細胞產(chǎn)能受到限制，無法維持機體在日?；顒又行募∷璧哪芰抗┙o，從而影響了心臟的收縮、舒張功能。本研究結果表明補腎啟樞強心顆?？赡芡ㄟ^作用于TP53、IL-1β、IL-6、TNF-α、AKT1、STAT3等靶點，調(diào)控Toll樣受體、PI3K-Akt、HIF-1、cAMP、PPAR及AMPK等信號通路，從而起到抗心肌纖維化、調(diào)控心肌細胞自噬與凋亡、改善心肌能量代謝的作用。結果對明晰補腎啟樞治法的科學內(nèi)涵具有借鑒意義，但所得結論仍需進一步研究驗證。