劉大偉，陳柏寒

(華中科技大學(xué) 電氣與電子工程學(xué)院 強電磁工程與技術(shù)國家重點實驗室，湖北 武漢 430074)

等離子體是指氣體中放電的物理現(xiàn)象，由于等離子體作為一種基質(zhì)攜帶各種不同種類粒子，非常類似于血漿攜帶紅細胞、白細胞和細菌等物質(zhì)的情況，因此在一開始均勻放電被形象地稱為電漿，即等離子體.由于其不同于常見氣液固態(tài)物質(zhì)的特性，等離子體被認為是物質(zhì)的第4態(tài).地球上常見的等離子體包括閃電、極光和火焰.等離子體在低壓、大氣壓和高壓條件下均可以產(chǎn)生，產(chǎn)生方法為由電場、輻照或者熱激發(fā)產(chǎn)生的高能促使中性氣體轉(zhuǎn)換為等離子體態(tài)，由強電場加速的高能電子與氣體分子碰撞，產(chǎn)生強電離，與此同時，在等離子體中會生成包括帶電粒子、自由基、亞穩(wěn)態(tài)粒子和光子在內(nèi)的“混合物”.隨著電氣工程和材料科學(xué)的發(fā)展，大氣壓冷等離子體(cold atmospheric plasma，簡稱CAP)被開發(fā)出來，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，包括去污和滅菌、皮膚病治療和癌細胞治療等[1-7].

人體的皮膚是人體最大的器官，總面積可達1.5～2 m2，可以保護人體免受熱、光照和傷口感染的侵害，但作為人體最外層的屏障，這意味著皮膚也很容易受到病原體或傳染源的侵襲.近來，皮膚病愈發(fā)成為一類常見病，并且傳統(tǒng)治療手段的治療作用和經(jīng)濟效益都較為低下，急需研究新的治療方法.CAP正是其中之一，它的優(yōu)勢在于其不僅可以對常見細菌進行殺滅，而且不會損害皮膚樣本的正常細胞[8].CAP在皮膚治療中的作用方式包括殺死微生物、刺激組織、抗炎和止癢等[9].

等離子體源為CAP在皮膚治療中的應(yīng)用提供了物理基礎(chǔ)(圖1)，目前已被廣泛應(yīng)用的技術(shù)包括等離子體射流、電暈放電、介質(zhì)阻擋放電、微波等離子體、微等離子體陣列等.根據(jù)接地電極的不同，可以將這些等離子體源分為直接和間接等離子體源.這些等離子體源產(chǎn)生的等離子體體積通常為數(shù)mm3至數(shù)cm3，電功率為數(shù)W.

CAP是進行皮膚病學(xué)治療的核心(圖1).應(yīng)用于皮膚和傷口組織的CAP應(yīng)當具有3個特性：可在氣溫低于40 ℃的大氣壓下運行；產(chǎn)生的平均電子能量足夠用于電子撞擊激發(fā)、離解和電離；熱傳導(dǎo)過程不對皮膚產(chǎn)生熱傷害[10].CAP中起作用的物質(zhì)包括帶電粒子(電子和離子)活性氧/氮(reactive oxygen and nitrogen species，簡稱RONS)、紫外線(100～380 nm)以及電場.CAP主要是通過誘導(dǎo)凋亡(程序性細胞死亡)、刺激新陳代謝以及對哺乳動物細胞的特定作用等在細胞內(nèi)外誘導(dǎo)細胞效應(yīng)，如滅活/消殺具有抗生素抗性的微生物以及癌細胞等[11].CAP應(yīng)用于臨床有更嚴格的要求，比如盡量便攜的等離子體源、更大的有效作用區(qū)域，還有適當?shù)膯未沃委煹膹姸群蜁r間以及長期治療的持續(xù)時間和頻率等.

圖1 CAP的來源及其在皮膚病學(xué)中的應(yīng)用(資料來源：文獻[11])

1 大氣壓冷等離子體(CAP)的產(chǎn)生

1.1 CAP來源

在皮膚病學(xué)中，CAP的主要作用是殺菌，誘導(dǎo)細胞凋亡，促進生長因子和細胞遷移，調(diào)節(jié)微循環(huán)、血管生成和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等[9,12-13]，這些作用依賴于RONS、電場、帶電粒子和紫外線輻射(UVR)[11,14].CAP在大氣壓下可以根據(jù)所需效果靈活更改其組成和電特性.適用于皮膚治療的CAP源可分為2種主要類型：間接和直接等離子體源.

與直接等離子體源不同，間接等離子體源包含電源電極和接地電極.等離子體主要在兩個電極之間產(chǎn)生，部分等離子體可以通過電場遷移、對流和擴散到達目標表面[15].等離子體射流是最常見的間接等離子體源.圖2(a)是一個典型的介質(zhì)阻擋放電(dielectric barrier discharge，簡稱DBD)等離子體射流.功率電極是由電介質(zhì)管環(huán)繞的針電極，一端閉合，管的環(huán)形電極接地[15-16].當稀有氣體(如氦氣、氬氣等)通入電介質(zhì)管，放電后在周圍的空氣中產(chǎn)生等離子體射流，氣體溫度接近室溫.盡管氣體流速僅為20～50 m·s-1，但等離子體射流由速度大于10 km·s-1的等離子體子彈組成，而沿等離子體羽流的強電場進一步促進了更長的等離子體羽流的形成和更活躍的等離子物質(zhì)的產(chǎn)生[17].

其余等離子體源包括：直流電源用于帶有單個針狀電極[15]或空心針狀電極(注射器)[18]的直接等離子體源.施加的直流電壓通常為5～20 kV.當這種等離子體應(yīng)用于人體時，需要接地以避免帶電效應(yīng)[18].脈沖直流電源用于以稀有氣體為工作氣體驅(qū)動的所有DBD直接/間接等離子體源，這種等離子體射流具有更長的等離子體羽流，并且活性更高[19].還有另一種射頻等離子體，盡管其運行過程中的高溫氣體限制了其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，但是采用脈沖式射頻電源可以將等離子體的氣體溫度降低到室溫.這種等離子體具有長且穩(wěn)定的等離子體羽流，可快速響應(yīng)射頻場，且脈沖射頻等離子體更為活躍[20].

在直接等離子體源中，被處理的皮膚或傷口組織充當對電極，因此放電電流(位移或傳導(dǎo)電流)會流經(jīng)人體，常見例子是介質(zhì)阻擋放電(DBD).功率電極上覆蓋著一層厚度不超過1 mm的薄絕緣層，功率電極與被治療的皮膚或組織之間相距數(shù)mm.放電可以在均勻(擴散)模式下進行(圖2(c))，當工作氣體為空氣時，放電產(chǎn)生許多直徑不超過200 μm的絲狀放電，這些絲狀放電隨機分布在整個介質(zhì)阻擋面上，且會轉(zhuǎn)移電介質(zhì)表面累積的電荷，從而導(dǎo)致放電在10-8～10-7s內(nèi)快速自終止.圖2(b)所示功率電極采用針狀電極，其與皮膚間隙增加到數(shù)cm，當手指等靠近針電極即可產(chǎn)生脈沖放電，其中限流電阻可以限制放電電流以避免產(chǎn)生電弧過渡[21].直接等離子體源通常直接在空氣中放電，所以等離子體化學(xué)以氧和氮族物質(zhì)為基礎(chǔ).當直接等離子體源被用于治療受傷的組織時，帶電粒子和強電場可能會引起輕微的電擊，因此，直接等離子體源只適用于具有結(jié)構(gòu)完整性的皮膚疾病，例如濕疹、特應(yīng)性皮炎等.

(a)為間接等離子體源；(b)(c)為直接等離子體源.圖2 直接和間接等離子體源的產(chǎn)生機理

1.2 等離子體源與皮膚之間CAP射流的發(fā)展過程

生物體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)要求等離子體源具有較長的工作距離和更大的作用區(qū)域，這樣可以提高CAP的處理效率.等離子體源與皮膚之間CAP射流的發(fā)展過程如圖3所示.圖3(a)顯示了具有3個等離子體羽流的脈沖直流等離子體射流陣列.圖3(b)～(e)表明了等離子體子彈的存在，其最大速度為7.5×106cm·s-1[20].等離子體子彈的發(fā)展包括兩個階段：第一階段，介電管內(nèi)部的強電場觸發(fā)放電，電離波沿著內(nèi)壁移動.第二階段，等離子體子彈離開管子后沿著稀有氣體和環(huán)境空氣的混合層傳播，等離子體羽流整體方向沿管軸.等離子體子彈前面的初始電子是由強電場區(qū)域(等離子體子彈頭)發(fā)出的高能光子通過氣體的電離而產(chǎn)生的[21].返回子彈頭的電子在放電的等離子體通道前產(chǎn)生密集的正電荷和強電場的放電，這些放電有助于通道的延長.

(a) 脈沖直流等離子體射流陣列；(b)～(e) 等離子體子彈的發(fā)展；(f) 脈沖射頻等離子體射流陣列；(g)～(j) 射頻等離子體射流陣列的傳播過程；(k) 覆蓋有電介質(zhì)阻擋層的功率電極和細菌生物膜之間的單根空氣絲放電；(l)～(o) 空氣絲以等離子體子彈模式傳播；(p)～(r) 空氣絲放電到達生物膜表面及膜腔中.圖3 等離子體源與皮膚之間CAP的發(fā)展動態(tài)過程

圖3(f)表示脈沖射頻等離子體射流陣列，與等離子體子彈傳播機制不同，圖3(g)～(j)所示的射頻等離子體射流陣列的傳播過程顯示了射頻周期內(nèi)的等離子體通道發(fā)生擴展.大量的長壽命的離子和亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)積累在通道中，使整個等離子體羽流對所施加的射頻電壓做出快速響應(yīng).圖3(h)顯示，當施加的射頻電壓為正峰值時，等離子體羽流的結(jié)構(gòu)為負輝光、法拉第暗空間和從等離子體羽流尖端到管出口的正流注[20].圖3(j)顯示等離子體羽流的結(jié)構(gòu)包括陽極輝光、陽極暗空間以及在負射頻電壓峰值處從等離子體羽尖到管出口的正流注[20].整個等離子體通道擴展是射頻等離子體射流的主要傳播機制，因為等離子體羽在負電壓峰值處比在正電壓峰值處更長.

電子能量守恒方程(等式(1))可以用來分析脈沖射頻等離子體射流陣列的施加功率分布.

(1)

管內(nèi)的放電實際上是在負射頻峰值電壓下的空心陰極放電.電子匯聚到管軸并從管中沖出.等離子體通道的高電導(dǎo)率和強電場有利于通過等式(1)所示的焦耳加熱將施加的功率耦合到等離子體[22-24].放電產(chǎn)生了許多高能電子，這些高能電子流不僅增強了正極柱的電離和激發(fā)(等式(1)中的非彈性碰撞加熱)，而且還沿著等離子體通道進一步傳播.圖3(k)為覆蓋有電介質(zhì)阻擋層的功率電極和細菌生物膜之間的單根空氣絲放電及其峰值電子密度.圖3(l)～(o)顯示了空氣絲以等離子體子彈模式傳播，并在開始放電后的0.3 ns內(nèi)到達生物膜.圖3(m)所示為發(fā)生在生物膜的頂部的局部電離，其為等離子體子彈提供了預(yù)電離區(qū)域，這既加速了空氣等離子體子彈的傳播，又增加了耦合至生物膜的施加功率[10].圖3(p)中的放大圖片表明，當空氣絲放電到達表面時，生物膜上的電子密度為5.43×1013cm-3.空氣絲放電的德拜長度僅為5～10 μm，這遠小于生物膜腔的寬度和深度(約50 μm)，因此空氣絲放電會更加深入生物膜腔中，腔中的電子密度約為1.81×1014cm-3(圖3(q))[10-11].高電子密度會使生物膜表面產(chǎn)生強電場，生物膜上的電場(圖3(r))為83.2 kV· cm-1.這種強電場可能會導(dǎo)致電穿孔和隨后的細胞凋亡[10].

當?shù)入x子體到達皮膚/傷口表面時，其在徑向上產(chǎn)生擴散，這會擴大CAP的治療范圍.這種擴散通常發(fā)生在頂部電介質(zhì)上，在邊界層中產(chǎn)生近1016cm-3的電子密度[25].進一步地，其速度由下面的介電電容的充電速率決定.有效面積可以增加等離子體穿孔的總數(shù)，并改善皮膚組織對RONS和帶電粒子的吸收.

1.3 CAP的帶電種類和電場

帶電物質(zhì)是等離子體應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的重要因素.它們不僅可以直接作用于有機物，而且是一種天然的能量載體.諸如Langmuir探針、質(zhì)譜法等與帶電粒子有關(guān)的等離子體診斷方法主要用于低壓放電，其主要特征是較大的均勻等離子體體積和較低的碰撞頻率.然而，大氣壓等離子體的高碰撞猝滅限制了上述測量技術(shù)的應(yīng)用.

該節(jié)中討論的電荷和電場效應(yīng)對等離子體應(yīng)用于皮膚病學(xué)非常重要，一方面，包含電子和離子的高能帶電粒子可以改變細胞膜的表面形態(tài)、接觸角和電特性；另一方面，等離子體在很大程度上會增加細胞膜的滲透性，從而允許分子跨細胞膜轉(zhuǎn)移.在ns范圍內(nèi)較短的等離子體脈沖可能會產(chǎn)生小孔，這些小孔不允許大分子通過，但允許離子通過[30].因此，帶電物質(zhì)和電場會對細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重大影響，這為后面討論的等離子體產(chǎn)生活性物質(zhì)的透皮遞送提供了技術(shù)基礎(chǔ).

1.4 CAP的活性物質(zhì)

活性物質(zhì)是對促進傷口愈合和減輕銀屑病癥狀具有重要作用的活性成分之一.高能電子與CAP中氣體分子的碰撞會產(chǎn)生原始活性物質(zhì)，包括電子和振動激發(fā)的O2和N2分子，處于基態(tài)和激發(fā)態(tài)的N，O和H原子以及OH自由基[11,27,31].這些原始物質(zhì)之間的進一步反應(yīng)會產(chǎn)生RONS，例如OH，NO，NO2，HNO2，HNO3，H2O2等.對關(guān)鍵活性物質(zhì)如O，O2(1△g)，O3，OH和NO的實驗和數(shù)值診斷將有助于調(diào)整處理劑量，并有助于優(yōu)化等離子體工藝以用作特定用途.

等離子體產(chǎn)生大量的原子氧，它們可以通過強氧化作用改變細胞膜化學(xué)性質(zhì)和細胞的通透性.測量原子氧的絕對密度是一大難題，其中微波等離子體射流的原子氧(O)的絕對密度可以通過兩光子吸收激光誘導(dǎo)的熒光(TALIF)來測量[32].

臭氧(O3)是一種活性氧化劑，在皮膚病學(xué)中特別適用于治療慢性肢體缺血和多種皮膚感染[33].當向工作氣體中添加少量O2或環(huán)境氣體為周圍的空氣時，CAP源會生成O3，可以通過紫外吸收光譜法測量O3.對于采用稀有工作氣體的等離子體射流，O3聚集在稀有氣體與空氣之間的混合層中，其峰值O3濃度為16×1014cm-3.間接空氣CAP源的O3峰值濃度為78×1015cm-3，這遠高于前者[34]并且隨著噴嘴與CAP源距離的增加，峰值O3濃度會降低.顯然主導(dǎo)O3生成的反應(yīng)為：O+O2→O3.

CAP產(chǎn)生的一氧化氮(NO)可能導(dǎo)致細胞凋亡、壞死或反過來保持細胞活性，這和細胞類型，自由基濃度以及暴露的持續(xù)時間、特定區(qū)域密切相關(guān).NO可以通過促進血管和成纖維細胞的生長來促進傷口愈合，這種效應(yīng)對于皮膚病學(xué)非常重要.NO濃度決定了CAP治療時間和劑量，它可以通過質(zhì)譜法、光吸收光譜法、光發(fā)射光譜法和激光誘導(dǎo)熒光(LIF)來測量.空氣混合比對以稀有氣體為工作氣體的等離子體射流產(chǎn)生的NO濃度有顯著影響，NO濃度還受濕度影響.NO主要通過Zel’dovich反應(yīng)生成：N2+O→NO+N以及N+O2→NO+O，而與O3的反應(yīng)和反向Zel’dovich反應(yīng)NO+O→N + O2將NO轉(zhuǎn)化為NO2主導(dǎo)了NO的衰變[35-36].

傷口治療中的一個常見問題是生物膜阻礙傷口愈合，生物膜附近等離子體產(chǎn)生的高濃度RONS可以誘導(dǎo)電穿孔和膜表面改性[10].活性自由基(NO，OH和超氧化物)或強氧化劑(H2O2和O3)可以滲透到微生物中[12]，在細胞質(zhì)內(nèi)部發(fā)生進一步的化學(xué)反應(yīng).然后，所有成分都會氧化細胞蛋白或微生物DNA.另外，這些RONS還可以通過脂質(zhì)過氧化作用破壞微生物細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致膜損傷[6,37].因此，在強電場的幫助下，RONS可以殺死傷口生物膜中生長的耐藥細菌.

這些實驗和數(shù)值結(jié)果表明，直接和間接等離子體源都可以將具有高電荷密度和強電場的等離子體輸送到皮膚上.電極結(jié)構(gòu)、施加的電壓、間隙等會影響等離子體的強度.等離子體可能會擠進活組織表面生物膜內(nèi)部的狹窄空間(μm級)，CAP產(chǎn)生的帶電物質(zhì)、電場和活性物質(zhì)的共同作用有助于提高皮膚疾病的治療效率，這些效果對于具有耐藥菌感染和復(fù)雜結(jié)構(gòu)性病變的皮膚疾病也同樣非常有用.

2 活性粒子的運輸

非侵入式治療，即不破壞皮膚的醫(yī)療程序，被廣泛應(yīng)用于皮膚治療.近來，微針經(jīng)常用于通過破壞角質(zhì)層結(jié)構(gòu)來改善透皮藥物遞送.而等離子體是一種二合一的工具，可實現(xiàn)RONS的有效透皮遞送以及可恢復(fù)的角質(zhì)層破壞.截至目前，許多直接和間接等離子體源已被證明可安全用于傷口愈合和炎性疾病的治療[2,38].等離子體處理的協(xié)同作用使得使用等離子體治療皮膚疾病優(yōu)于采用脈沖電場治療或光療，這些作用包括滅菌、增加微循環(huán)和皮膚酸化等.進一步的研究集中于了解等離子體在單個分子水平或細胞水平上的作用，這種深入的了解可以促進等離子體在皮膚病學(xué)中的應(yīng)用.

2.1 透皮等離子體遞送(等離子體穿孔)

藥劑和藥膏在數(shù)百年來被廣泛用于治療皮膚疾病，但是皮膚屏障阻止了大多數(shù)活性物質(zhì)到達目標結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致傳統(tǒng)藥物藥效不盡人意.因此，需要進一步采用各種物理技術(shù)破壞皮膚屏障，如微針陣列、超聲波治療等增加局部應(yīng)用透化劑的滲透性，但是這些技術(shù)發(fā)展至今依然存在著各種各樣的問題.而最近發(fā)現(xiàn)等離子體在傷口愈合或炎癥治療中會結(jié)合活性物質(zhì)、電場、電流和光子等產(chǎn)生綜合效應(yīng)，具有很大的應(yīng)用前景，如何最大化或控制活性物質(zhì)的滲透從而改善治療效率是一個值得深入討論的問題.

皮膚分為3層(圖4(a))：即表皮、真皮和較深的皮下組織.表皮是皮膚的最外層，可提供防水屏障[11].表皮下方的真皮包含堅韌的結(jié)締組織、毛囊和汗腺.較深的皮下組織由脂肪和結(jié)締組織組成.角質(zhì)層(stratum corneum，簡稱SC)是表皮的最外層邊界，形成了對環(huán)境的主要保護屏障，在SC上成孔是等離子體透皮遞送的先決條件.

(a) 皮膚的三層結(jié)構(gòu)示意圖；(b) 皮膚上產(chǎn)生電場的場強為170 kV·cm-1，穿透皮膚組織深度為1 mm；(c) CAP處理后誘導(dǎo)皮膚表面角質(zhì)細胞的結(jié)構(gòu)變化圖像，由激光掃描顯微鏡拍攝；(d) CAP處理后的表皮圖像，由激光掃描顯微鏡拍攝；(e) 激光掃描顯微鏡下的CAP處理后乳頭狀真皮上的染色；(f)～(g) 表示等離子體處理后在角質(zhì)層形成的導(dǎo)電區(qū)域；(f)為等離子體處理后5 min的圖像；(g) 為處理24 h后的圖像；(h) 表明CAP處理促進紅色右旋糖酐的透皮遞送；(i) 表明CAP處理增強脂質(zhì)體的透皮遞送.圖4 等離子體透皮運輸

“等離子體穿孔”的關(guān)鍵因素包含電場、熱效應(yīng)和RONS.與電穿孔類似，等離子體的電場會在皮膚上產(chǎn)生電壓降，而大部分電壓降會施加在高電阻SC上，長期運行后，表面電勢達到與驅(qū)動電壓相同的值，此電壓分布導(dǎo)致SC電擊穿.直接施加在皮膚上的DBD空氣等離子體在皮膚表面和下層間產(chǎn)生約170 kV·cm-1的電場(圖4(b))[39]，并最終穿透皮膚形成孔洞.圖4(c)所示的圖像顯示了經(jīng)等離子體處理后SC的蜂窩結(jié)構(gòu)破壞.

角質(zhì)層的滲透性可以通過加熱皮膚來增加.通過升高溫度，SC脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而改善透皮遞送.皮膚表面上空氣流束的功率密度為6.4×1011W·m-3，人體的比熱容僅為3 470 J·(kg·℃)-1，所以等離子體處理可以改變由組織良好的角質(zhì)細胞形成的均勻蜂窩結(jié)構(gòu)，甚至可以使皮膚局部溫度升高至100 ℃以上.圖4(d)所示的激光掃描顯微鏡圖像表明脂質(zhì)層融化且角質(zhì)細胞受到熱損傷[40].表皮中的結(jié)構(gòu)損傷有利于等離子體透皮輸送至更深的皮層.圖4(e)顯示了等離子體處理后乳頭狀真皮上的熒光染色，低于75 ℃的轉(zhuǎn)變是可逆的[41].為了防止皮膚灼傷，需要控制CAP的治療時間，等離子體的快速但溫和的加熱過程可以增加皮膚的滲透性卻不破壞更深層的組織.更重要的是，等離子體穿孔對皮膚屏障性質(zhì)的影響在很大程度上是完全可逆的.圖4(f)和(g)表明，SC樣品經(jīng)過90 s CAP處理后在其上產(chǎn)生的孔在處理后的24 h內(nèi)減少了50%以上，這表明SC沒有受到持久的破壞.

等離子體中生成的RONS與脂肪酸可以通過一系列復(fù)雜的反應(yīng)來增加皮膚的滲透性，這對于透皮給藥尤其重要.圖4(h)表明3 kDa右旋糖酐分子在CAP處理后1 h內(nèi)到達表皮層，深度約為0.3 mm，而未經(jīng)過CAP處理的樣品中右旋糖酐分子仍保留在皮膚表面.進一步的實驗表明，暴露于CAP 1 min后，大分子葡聚糖的透皮遞送深度約為0.6 mm.圖4(i)表明，與電穿孔相比，CAP可以將更多的藥物遞送到更深的皮膚處.等離子體穿孔是等離子體治療皮膚病背后的基本機制.等離子體穿孔促進了皮膚表面上方生成的NO的轉(zhuǎn)運，最終導(dǎo)致血管擴張、血流量增加和組織氧合.等離子體穿孔還促進了對細菌的消殺，并有助于抑制銀屑病病變中的炎癥浸潤和血管生成[42].在第3部分將討論CAP治療機制的更多詳細信息.

2.2 向組織中輸送活性粒子

等離子體在傷口愈合和皮膚病治療中的應(yīng)用仍處于早期階段，并且處于進行臨床研究的活躍領(lǐng)域.至今為止，至少有4種等離子體設(shè)備已獲得醫(yī)療設(shè)備認證.例如，SteriPlas(日本AdTec有限公司)被證明可有效殺菌和促進傷口中的生長因子產(chǎn)生[43].PlasmaDerm(德國Cinogy GmbH)也已被臨床試驗證明其在治療慢性腿部潰瘍方面是安全有效的[2].

許多此類應(yīng)用涉及直接或間接等離子體源與覆蓋有液體的受損組織接觸.重要的是，大多數(shù)傷口在其早期發(fā)展階段都被水狀液體層覆蓋，該液體層通常為數(shù)百μm厚，為了提高修復(fù)和重建受損組織的效率，需要確定等離子體產(chǎn)生的活性物質(zhì)被遞送到皮下.

在等離子體產(chǎn)生的RONS滲入細胞之前，活性粒子必須克服3道屏障(見圖5(a)～(c)).而等離子體通過復(fù)雜的機制促進了這些滲透作用.等離子體與液體相互作用期間影響最大的是溶解的RONS、次級水反應(yīng)和等離子體引起的對流，該部分內(nèi)容將在下面討論.

(a) 等離子體-組織液屏障；(b) 組織液-組織屏障；(c) 組織-細胞屏障；(d) CAP誘導(dǎo)的液體流動剖面圖，由氣泡激光散射可視化；(e) CAP處理后液體上方的H2O2氣相圖和液體內(nèi)部的H2O2液相圖；(f) CAP垂直于明膠基質(zhì)表面處理300 s后的合成生物傳感器的共聚焦顯微鏡圖像；(g) 表明小電場增強了明膠凝膠中RONS的滲透性；(h) 具有H2O2熒光染料的瓊脂糖凝膠經(jīng)CAP處理后的圖像；(i) CAP在T形瓊脂糖管內(nèi)傳播；(j) CAP處理后細胞膜上產(chǎn)生納米孔；(k) CAP處理后細胞內(nèi)ROS分析，由流式細胞儀測得.圖5 RONS到達皮膚內(nèi)部之前必須穿透的3道屏障

CAP與被滲出液覆蓋的傷口接觸時會干擾液體.圖5(d)顯示了CAP產(chǎn)生的液體中的凹痕和流動模式.CAP的離子牽引力和氣體加熱有助于將動量傳遞到液體表面，產(chǎn)生這種效應(yīng)最可能的原因是CAP傳遞的凈電場和離子通量會使液體表面帶電[44].由該效應(yīng)產(chǎn)生的漣漪將液體推下并引起對流，一旦氣態(tài)等離子體活性物質(zhì)溶解到液體中，它們就通過對流被運輸.液體的流動模式在具有高亨利常數(shù)的溶解物質(zhì)的密度分布圖中清晰可見，如圖5(e)所示.遵循圖5(d)所示的液體流動模式，水溶性等離子體活性物質(zhì)最初保留在等離子體—液體界面處并累積在反向渦流中，它們也流回液體表面，然后返回到大塊液體中.具有較低亨利常數(shù)的氣態(tài)等離子體活性物質(zhì)在氣相中堆積在等離子體—液體界面的正上方，從而導(dǎo)致液相中的活性物質(zhì)濃度要低得多.

盡管氣態(tài)RONS壽命短，但其仍顯著促進了含水活性成分的產(chǎn)生，這與觀察到的液體對流模式是一致的.紫外可見光譜(UV-Vis)、電子自旋共振(ESR)和液體色譜質(zhì)譜法(LC-MS)通常用于測量液體中由等離子體產(chǎn)生的RONS.CAP產(chǎn)生的液體中的短壽命RONS包括超氧化物(O2)、氫過氧自由基(HOO)、OH和過氧亞硝酸(ONOOH)，實際上，這些壽命較短的RONS在產(chǎn)生后迅速轉(zhuǎn)變?yōu)閴勖L且更穩(wěn)定的次級RONS，例如H2O2、硝酸鹽(NO3)和亞硝酸鹽(NO2).這些長壽命的RONS可以與組織液及組織本身中的成分發(fā)生反應(yīng)，并最終促進RONS的細胞內(nèi)生成，這可能會增加等離子體向組織液中傳遞的原始RONS劑量[46-48].

當滲出液較少時，等離子體可以直接與皮膚組織相互作用.通常使用兩種組織模型來研究如何將RONS遞送到組織中.第一種模型是明膠，具有嵌入的磷脂囊泡.當CAP射流垂直于明膠表面時，CAP處理會在明膠基質(zhì)中形成從治療區(qū)域中心放射出的星形微通道圖案，并使明膠表面下方150 μm深度處的微通道內(nèi)的囊泡局部受損(圖5(f)).這些結(jié)果表明，電場促進了進入真實生物組織的RONS的運輸(圖5(g)).第二組織模型是瓊脂糖凝膠模型.紫外可見光譜用于鑒定CAP產(chǎn)生的RONS遍歷瓊脂糖凝膠模型.等離子體效應(yīng)(例如增加H2O2濃度和降低pH)被轉(zhuǎn)移到組織內(nèi)部約4 mm深處(圖5(h))，這種效應(yīng)與大鼠皮膚組織和雞胸組織中的等離子體效應(yīng)非常相似.圖5(i)顯示了沿T形管在瓊脂糖凝膠中傳播的等離子體射流.

磷脂膜是外源RONS的最后障礙.CAP產(chǎn)生的RONS與細胞膜之間相互作用的研究可以幫助理解CAP如何刺激細胞.使用原子力顯微鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，一定劑量的ROS在磷脂雙分子層中產(chǎn)生了直徑為10～50 nm的納米級孔，并最終破壞了雙層結(jié)構(gòu)(圖5(j))[49].脂質(zhì)雙分子層(phospholipid bilayer，簡稱PLB)中脂質(zhì)的氧化會增加其對ROS的滲透性，盡管滲透自由能壘仍保持在相對較高的水平.脂質(zhì)的氧化導(dǎo)致PLB中孔形成所需的電場閾值下降，膜上產(chǎn)生的孔促進了RONS深入細胞內(nèi)部.另一個重要因素是細胞膜上的納米孔，它們可能有助于促進RONS進入細胞.圖5(k)中顯示的綠色熒光更強，表明用CAP處理的HaCaT細胞內(nèi)ROS增加更多[50]，ROS的增加可以增強角質(zhì)形成細胞凋亡并隨后減少表皮增殖.這些觀察結(jié)果證明CAP在銀屑病治療中具有良好的潛力.

盡管這些初步研究為RONS與細胞膜中脂質(zhì)和膽固醇之間的相互作用提供了有價值的見解，但目前的研究仍存在局限性.例如，細胞膜等在真實條件下是動態(tài)的并且是可以自我修復(fù)的，細胞膜具有將分子移入和移出的通道，并且細胞膜中包含蛋白質(zhì)并由復(fù)合糖修飾，這些都未包含在研究所用的模型中[46].后續(xù)的數(shù)值研究將幫助人們更全面地了解等離子體如何刺激細胞，特別是在多層異質(zhì)皮膚層中.

3 皮膚病學(xué)中的應(yīng)用

最近，關(guān)于等離子體對活體和非生命體表面的滅菌作用，促進傷口愈合和治療各種皮膚疾病的一系列臨床試驗，都顯示出了等離子體在臨床上的巨大潛力.等離子體處理的優(yōu)點包括良好的耐受性、生物相容性和生物安全性.等離子體通過其活性成分(包括RONS、帶電粒子、電場和紫外線)影響生物的生化過程.目前對等離子體和生物組織的復(fù)雜成分之間相互作用的細節(jié)和作用機理的理解仍然有限.現(xiàn)分析在傷口和銀屑病上應(yīng)用CAP的治療過程、特定活性成分和初步治療機制(圖6)，并提出更標準化的治療方法.

圖6 CAP在皮膚疾病治療中的治療機制

3.1 CAP對傷口愈合的影響

皮膚傷口愈合是一個復(fù)雜的過程，涉及各種細胞和細胞因子.它通常分為3個階段：炎癥、增殖和重塑階段.由于其復(fù)雜性和多階段性，傷口愈合很容易受到皮膚內(nèi)部或外部干擾的影響，最終導(dǎo)致慢性傷口的產(chǎn)生[51].這些慢性傷口的治療不僅占用醫(yī)療資源，而且加重患者的經(jīng)濟負擔.例如，許多人的小腿患有慢性傷口(潰瘍)，除動脈疾病或糖尿病外，其主要病因是靜脈曲張病和其他靜脈疾病，尤其是老年人患有的靜脈潰瘍.因此，需要有低成本的替代性潰瘍治療方案.

CAP(圖6(a))具有很大的替代前景，不僅因為它的生產(chǎn)成本很低，而且其容易用于皮膚傷口處理.CAP在傷口愈合過程中的優(yōu)勢(圖6(b))包括：1)強大的抗菌作用加快傷口愈合；2)刺激內(nèi)皮細胞的增殖；3)CAP處理可以降低傷口內(nèi)組織液的pH.

大多數(shù)皮膚傷口會被細菌定殖，特別是在慢性傷口上經(jīng)常形成生物膜，這會損害傷口的愈合，其中最常見的細菌是葡萄球菌.壞死組織和滲出物會促進細菌的繁殖和傳播，因此治療的第一步是徹底清創(chuàng)，其次需要消除細菌[11].等離子體可以深入細菌生物膜內(nèi)部，并殺死它們(圖3(p)～(r))，CAP可以通過等離子體物理化學(xué)作用的結(jié)合，在數(shù)分鐘內(nèi)滅活廣譜感染性微生物而不引起皮膚過敏反應(yīng)，這會在很大程度上抑制因使用常規(guī)抗菌劑導(dǎo)致的耐多藥細菌的快速繁殖[12-13].

基于MicroPlaSter α和β設(shè)備(結(jié)構(gòu)與圖2(c)相似)的臨床試驗表明，對14例患者的慢性傷口進行70次等離子體治療可顯著降低細菌數(shù)量，并且治療過程沒有副作用且耐受性良好[43].等離子體使細菌失活的機制包括：細菌存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)(viablebutnon-culturablestate，簡稱VBNC)；脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的過氧化損傷；細菌程序性細胞死亡；CAP產(chǎn)生的RONS可以穿透mm范圍內(nèi)的傷口組織(圖5(h))[52].等離子體的高滅菌效率減少了細菌消耗的氧氣，同時增加了提供給細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，簡稱ECM)和不斷增長的血管的氧氣.然而，NO對傷口愈合的貢獻是有限的，因為等離子體提供的NO含量低于通過傷口液中擴散所需的NO[52-53].另一方面，巨噬細胞影響了損傷后肌成纖維細胞的數(shù)量和ECM的沉積[54]，因此需要進一步研究.

CAP與內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞和免疫細胞等細胞之間的相互作用是影響傷口愈合和組織再生的重要因素之一.用MicroPlaSter β處理的人成纖維細胞進行的體外細胞培養(yǎng)研究表明，CAP處理會誘導(dǎo)利于傷口愈合反應(yīng)的關(guān)鍵基因的表達，例如IL-6，IL-8，MCP-1，TGF-β1，TGF-β2，并促進I型膠原和α-SMA的產(chǎn)生[12].劃痕傷口愈合試驗顯示出細胞遷移得到改善.CAP也可以改善傷口部位的血管化，CAP增加了內(nèi)皮細胞數(shù)量、遷移距離和血管形成，這歸因于等離子體產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)的成纖維細胞生長因子2(FGF-2)釋放[55].CAP可顯著增加組織氧飽和度、毛細血管后靜脈充盈壓力和營養(yǎng)供應(yīng)，從而促進傷口愈合[56].

近期，在26例患者的3項觀察研究中測試了KINPen MED對慢性傷口治療的療效[57].Octenisept是慢性傷口處理中最具生物相容性和最有效的防腐劑之一，被用來與KINPen進行療效比較.在2周的治療期內(nèi)，每周有16例慢性腿潰瘍患者接受3次等離子體治療.等離子體處理使傷口表面減少了56%，而Octenisept組僅減少了19%，這表明等離子體在傷口愈合中具有促進作用.在另一項研究中，等離子體治療的療效仍優(yōu)于使用Octenisept或涉及兩種治療方案的聯(lián)合治療.另外，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察等離子體處理的傷口，觀察到傷口愈合初期的增生，這也表明炎癥期縮短[58].

3.2 CAP對銀屑病的影響

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的復(fù)發(fā)性疾病，主要影響皮膚和關(guān)節(jié).到目前為止，還沒有有效的治療方法可以治愈或完全控制該疾病.銀屑病皮損的主要病理特征是表皮角質(zhì)形成細胞的終末分化和過度增殖、明顯的炎癥浸潤和病理性血管生成.

CAP處理可改善咪喹莫特(IMQ)誘發(fā)的小鼠模型中的銀屑病樣皮炎和增生[50].與對照組相比，用IMQ處理的小鼠的背部皮膚在3 d后出現(xiàn)紅斑、結(jié)垢和增厚的跡象，并且這些病變可通過延長IMQ給藥逐漸加重[12,50].CAP治療組的小鼠每天接受CAP治療，治療方式為每2 min處理后停頓1 min，連續(xù)處理2次，這組小鼠沒有觀察到明顯的皮膚損傷.CAP顯著減少了IMQ + CAP組小鼠的整體皮膚病變，包括鱗片縮小、紅斑減少和增厚減少.對照組銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，簡稱PASI)得分無明顯變化，IMQ+CAP組小鼠的PASI得分低于IMQ組.蘇木精-伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining，簡稱HE染色法)進行組織病理學(xué)分析，結(jié)果表明通過CAP治療可以改善表皮增生、棘皮癥和IMQ引起的角化不全癥狀[50].

下面對銀屑病患者的CAP和常規(guī)治療進行進一步的比較.對6個銀屑病患者的3個斑塊進行3組治療(A組：CAP，鹽水浴(BB)+ 5%水楊酸軟膏(SAO)； B組：BB + SAO； C組：BB，UV輻照，SAO +蒽林(dithranol))[42].結(jié)果顯示A和C組的滲透和發(fā)紅減少，C組的鱗屑減少，說明CAP暫時減少了皮膚病灶上的細菌定殖.盡管在這種情況下用CAP治療銀屑病斑塊沒有顯示出比常規(guī)治療明顯的優(yōu)勢，但是通過增加放電功率或在工作氣體中添加O2/H2O來提高RONS的濃度可以改善CAP的治療效果[51].

CAP對銀屑病的作用主要集中在兩個方面(圖6(c))：首先，等離子體穿孔產(chǎn)生了穿過角質(zhì)層的轉(zhuǎn)運通道(圖4)，從而增強了RONS的透皮遞送.通過皮膚屏障后，這些RONS可以抑制過度增殖，誘導(dǎo)病變表皮細胞凋亡，從而清除斑塊.細胞培養(yǎng)實驗表明，長期的CAP處理可以誘導(dǎo)HaCaT角質(zhì)形成細胞的細胞周期停滯和凋亡[59].E-cadherin和表皮生長因子受體(EGFR)等表面分子的表達也被下調(diào)，從而減少了刺激性和增殖性[60].其次，CAP產(chǎn)生的RONS具有免疫調(diào)節(jié)特性.例如，ROS改善了小鼠模型中咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病并增強了調(diào)節(jié)性T細胞功能.此外，等離子體中高水平的外源NO具有抗增殖作用，并且在慢性炎癥過程的控制中起著重要作用[61].總體而言，這些初步研究顯示CAP在銀屑病治療中具有良好的潛力.

等離子體與其他治療方式相結(jié)合也為皮膚病治療提供了一條新路徑.尤其是利用等離子體處理皮膚產(chǎn)生大量的可恢復(fù)孔，然后馬上使用常規(guī)藥物處理，這樣就能有效提高藥物的透皮輸運，從而大幅增強治療效果.

4 結(jié) 論

CAP在皮膚病學(xué)中的應(yīng)用基于物理、化學(xué)、生物和工程科學(xué)的知識、方法和技術(shù)，是一個非常令人興奮的多學(xué)科研究領(lǐng)域.該綜述介紹了CAP的產(chǎn)生、運輸和治療效果.迄今為止取得的進展令人興奮，期望在不久的將來可以更好地了解等離子體對皮膚疾病治療的整個過程.由于電氣工程和材料科學(xué)的進步，CAP源的可靠性、經(jīng)濟性和安全性不斷提高.CAP和生物學(xué)對象之間相互作用的實驗和數(shù)值診斷方面的改進為等離子體醫(yī)學(xué)的進一步發(fā)展提供了重要的理論基礎(chǔ).CAP在皮膚病學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)已被公認為是等離子體醫(yī)學(xué)中最成熟的領(lǐng)域之一，目前許多結(jié)果已轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，例如慢性傷口和常見的皮膚病治療.

許多近期的工作表明，CAP和納米粒子技術(shù)等的綜合作用可能會產(chǎn)生全新的疾病治療方式，全球多個研究小組都取得了進展.因此，基于CAP的設(shè)備具有極好的前景，最終將成為在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛接受的普通工業(yè)和消費產(chǎn)品.接下來科研人員的共同努力有望進一步擴大等離子體應(yīng)用的范圍.