許 袁 ,馬 潔，彭勝杰，曹 威，陳國棟，韓 偉*

(1.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院 健康與醫(yī)學技術(shù)研究所，安徽 合肥 230031；2.中國科學技術(shù)大學 研究生院 科學島分院，安徽 合肥 230026；3.皖南醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院，安徽 蕪湖 241002；4.中國科學院合肥腫瘤醫(yī)院 放療中心，安徽 合肥 230031)

惡性黑色素瘤是由體表或黏膜黑色素細胞發(fā)生惡變、無限制增殖導致的腫瘤.其惡性程度高、易轉(zhuǎn)移，早期無不適感，不易發(fā)覺，且晚期預后極差，5年生存率不足10%[1].近年來黑色素瘤在我國發(fā)病率迅速增長，年新增病例近2萬，日益成為人民群眾生命健康的重要威脅[2].目前臨床上對于早期黑色素瘤可采用手術(shù)治療，但是由于發(fā)病位置、惡變面積不同等，手術(shù)治療可能會產(chǎn)生患者難以接受的痛苦.尋找更多安全穩(wěn)定、可直接接觸皮膚、二次傷害程度輕的治療方式，對于黑色素瘤治療是十分有價值的.

等離子體是由電子、帶正電荷的離子、中性粒子組成，宏觀上呈電中性的離子化氣體狀物質(zhì).根據(jù)溫度的不同，可以把等離子體分成高溫等離子體以及低溫等離子體,低溫等離子體又分為熱等離子體和非熱等離子體(non-thermal plasma, 簡稱NTP).NTP因具有溫度接近室溫，可與人體友好接觸，安全性高等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領域取得一系列應用成果[3].近年來，NTP陸續(xù)被證明在多種癌細胞中均具有抑癌作用[4],2007年美國科學家Fridman等[5]發(fā)現(xiàn)NTP能有效殺死皮膚癌細胞，且對周圍正常皮膚組織沒有顯著損傷.2016年，NTP首個臨床醫(yī)療研究發(fā)布，證實其有效減緩了頭頸癌病人的疾病進程，并提高了患者生活質(zhì)量，可能是一種新型的腫瘤治療方法[6].多年研究發(fā)現(xiàn)，NTP處理會顯著提高細胞內(nèi)活性自由基ROS/RNS(reactive oxygen species/reactive nitrogen species)水平，進而引發(fā)DNA損傷、周期阻滯、線粒體損傷、能量代謝抑制等，同時也會削弱內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的功能，最終激活細胞死亡信號通路，誘導腫瘤細胞死亡.NTP處理可以誘導多種細胞死亡方式，例如凋亡、焦亡、壞死和自噬等.一些藥物如阿霉素、替莫唑胺等，可顯著增強腫瘤細胞的NTP敏感性[7].

小分子藥物草氨酸鈉系乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase-A，簡稱LDH-A)的特異性抑制劑，而LDH-A在腫瘤的生長、侵襲、免疫逃逸、血管生成等方面具有重要的調(diào)控作用，抑制LDH-A可有效限制腫瘤細胞的能量供給，促使腫瘤細胞死亡[8].近年來草氨酸鈉被證明在抑制腫瘤細胞生長、遷移和殺傷癌細胞方面有良好效果，如草氨酸鈉可抑制鼻咽癌、非小細胞肺癌、膽管癌等腫瘤細胞生長、遷移，促進細胞凋亡、自噬，增強腫瘤細胞放射敏感性[9].

該研究將探究草氨酸鈉與NTP聯(lián)合使用能否對黑色素瘤細胞有更強的殺傷效果以及可能的機制.

1 材料和方法

1.1 細胞株與培養(yǎng)

人黑色素瘤細胞株A375、A875分別購自中科院上海細胞研究所和武漢普諾賽生命科技有限公司，MEL-RM黑色素瘤細胞由中國科學技術(shù)大學梅一德教授贈予.所有細胞均使用含10%胎牛血清和1‰抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).

1.2 主要儀器與試劑

實驗儀器：恒溫CO2培養(yǎng)箱(FORMA 3111)、酶標儀(ThermoVarioskan Flash)購自美國Thermo公司；雙色紅外激光成像分析儀(Odyssey CLx)購自美國LICOR公司；生物能量測定儀(XFe24)購自美國Seahorse公司；流式細胞儀(Accuri C6)購自美國BD公司；蛋白印跡電泳儀(EPS300)購自中國上海天能儀器；倒置熒光顯微鏡(DMI4000B)購自德國Leica公司.

實驗試劑：草氨酸鈉購自美國APExBIO公司；DMEM培養(yǎng)基購自武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ROS清除劑N-Acetyl-L-cysteine(NAC)均購自碧云天生物科技公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；β-actin抗體購自華安生物技術(shù)有限公司；Caspase-3抗體、PARP抗體、AMPK抗體、p-AMPK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；IRDye? 800CW Goat anti-Rabbit熒光二抗、IRDye? 680 RD Goat anti-Mouse熒光二抗購自美國LI-COR公司；Dihydroethidium(DHE)熒光探針購自美國Thermo Fisher Scientific公司.

1.3 NTP處理

該研究采用DBD作為等離子體發(fā)生裝置，由中國科學院等離子體物理研究所研制.如圖1所示，裝置主要由高頻高壓電源、氣體源以及等離子體發(fā)生室3個部分組成.等離子體發(fā)生室由中空有機玻璃作為反應室腔，上方和側(cè)面分別有進氣孔和出氣孔，內(nèi)含4個反應器.每個反應器含直徑32 mm的銅柱作為高壓電極，表面覆蓋1 mm厚的石英玻璃作為絕緣介質(zhì)屏障，石英玻璃底部與樣品表面的放電間隙為5 mm，接地電極為直徑37 mm的銅柱.高頻高壓電源工作頻率在10～42 kHz之間，輸出電壓在0～50 kV之間可變.設定電源工作電壓為12 kV，頻率為28 kHz.工作氣體為氦氣(純度99.99%，氣體流量計控制流速至120 L·h-1)，氦氣經(jīng)高壓氣瓶和塑膠軟管由發(fā)生室上蓋進氣口進入，通過發(fā)生室底座側(cè)面出氣口排出，處理前需通氣2～3 min.

圖1 介質(zhì)阻擋放電裝置示意圖

1.4 CCK-8法檢測細胞活力變化

取對數(shù)生長期的細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿(3×105細胞/皿)，待細胞貼壁后加入草氨酸鈉處理24 h，再進行NTP處理；24 h后棄上清，加入800 μL含10% CCK-8溶液的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育30 min后取100 μL轉(zhuǎn)移至96孔板，酶標儀檢測450 nm下吸光值.

1.5 Annexin V-FITC /PI雙染法檢測細胞凋亡

NTP處理后12 h，消化細胞制備懸液，離心(4 ℃，1 000 r·min-1，5 min)后，棄上清，PBS重懸；再次離心(參數(shù)同上)后，棄上清.加入Annexin V-FITC /PI染料，避光染色15 min，流式細胞儀檢測(PI：激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為515 nm；FITC：激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為560 nm).

1.6 細胞內(nèi)ROS水平檢測

NTP處理后12 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗，加入含DHE的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育30 min.染色結(jié)束后，棄上清，酶解消化制備單細胞懸液，800 r·min-1離心5 min，PBS重懸，重復2遍，流式細胞術(shù)檢測(激發(fā)波長：518 nm，發(fā)射波長：606 nm).

1.7 線粒體膜電位(JC-1)檢測

JC-1工作液配制：取JC-1儲存液(50 μL, 200×)，加入8 mL超純水，避光條件下用渦旋儀渦旋20 s；再加入JC-1染色緩沖液2 mL，混勻即為JC-1染色工作液.洗滌液配制：將5×染色緩沖液用蒸餾水稀釋至1×即可.

NTP處理后4 h，酶解細胞制備懸液，離心(1 000 r·min-1, 5 min)，棄上清，PBS重懸；重復1次后，用DMEM培養(yǎng)基(500 μL)重懸.加入JC-1工作液(500 μL)，37 ℃避光孵育20 min.染色結(jié)束后離心(4 ℃，2 000 r·min-1, 5 min)，棄上清，洗滌液洗2遍，最后用1 mL洗滌液重懸，進行流式細胞術(shù)檢測(JC-1單體激發(fā)波長514 nm，發(fā)射波長529 nm；聚合體激發(fā)波長585 nm，發(fā)射波長590 nm).

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達變化

將細胞酶解制備懸液，離心(4 ℃, 1 000 r·min-1, 5 min)后用PBS洗滌1次，加入RIPA裂解液置于冰上裂解10 min，超聲破碎，離心(4 ℃, 14 000 r·min-1, 10 min)后BCA法定量，加入相應5×loading buffer，混勻后100 ℃煮沸10 min，置-20 ℃?zhèn)溆?

配置10%聚丙烯酰胺凝膠，加入蛋白樣后進行電泳(150 V, 55 min).電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜2 h，再用5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST清洗1遍，一抗(Beta-actin稀釋比例為1∶5 000，其他抗體稀釋比例1∶500)4 ℃孵育過夜.次日室溫復溫10 min，TBST洗3次，加入二抗(1∶500)室溫孵育2 h，TBST洗3次，雙色激光掃描儀掃描.

1.9 細胞能量代謝變化檢測

將待測細胞接種于Seahorse XFe24專用培養(yǎng)板中(4×104細胞/孔)，按操作手冊對細胞進行處理，上機運行程序，檢測細胞能量代謝相關(guān)參數(shù)的變化(NTP處理時間為30 s).

1.10 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0完成，作圖采用GraphPad Prism 8.0完成；樣本間數(shù)據(jù)顯著性分析采用Student’st檢驗.p<0.05表示兩樣本之間差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 草氨酸鈉促進NTP誘導的黑色素瘤細胞活力改變

取3種人黑色素瘤細胞(A375，MEL-RM，A875)，接種于35 mm培養(yǎng)皿(3×106細胞/皿)，細胞貼壁后使用不同濃度草氨酸鈉預處理24 h，再進行NTP暴露，24 h后檢測細胞活力變化，結(jié)果如圖2所示.

相較于NTP單獨處理組，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.圖2 不同濃度草氨酸鈉聯(lián)合NTP處理后，A375(a)、MEL-RM(b)和A875(c)細胞活力變化

如圖2(a)所示，在A375細胞中，在不同處理時間下，與2 mmol·L-1以上濃度的草氨酸鈉聯(lián)用可顯著降低細胞活力，如在NTP處理90 s時，聯(lián)用組細胞活力為40.6%±1.7% (2 mmol·L-1)，18.7%±2.4% (4 mmol·L-1)，15.8%±1.6% (6 mmol·L-1)和14.3%±2.0% (8 mmol·L-1)，均顯著低于NTP單獨處理組(74.7%±4.4%)；在MEL-RM細胞中，如圖2(b)所示，在不同處理時間下，使用20 mmol·L-1以上濃度的草氨酸鈉進行聯(lián)用可顯著降低細胞活力，如在NTP處理90 s時，聯(lián)用組細胞活力為9.2%±3.2% (20 mmol·L-1)和6.4%±0.5% (30 mmol·L-1)，均顯著低于NTP單獨處理組(21.2%±3.4%)；在A875細胞中，如圖2(c)所示，使用20 mmol·L-1以上濃度的草氨酸鈉進行聯(lián)用可顯著降低細胞活力，如NTP處理90 s時，聯(lián)用組細胞活力為52.6%±5.8% (20 mmol·L-1)和44.7%±3.7% (30 mmol·L-1)，均顯著低于NTP單獨處理組(75.9%±5.2%).

2.2 草氨酸鈉促進NTP誘導的黑色素瘤細胞凋亡

細胞凋亡由Annexin V/PI雙染法聯(lián)合流式細胞術(shù)檢測，結(jié)果如圖3(a)～(c)所示；線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, 簡稱MMP)的檢測結(jié)果如圖3(d)所示；Western Blot進一步檢測凋亡相關(guān)蛋白PARP,Caspase-3的表達，結(jié)果如圖3(e)～(f)所示.

(a)A375凋亡流式圖;(b)MEL-RM凋亡流式圖;(c)凋亡率量化結(jié)果;(d)A375,MEL-RM線粒體膜電位量化結(jié)果;(e, f)A375,MEL-RM凋亡相關(guān)蛋白檢測；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.圖3 草氨酸鈉聯(lián)合NTP處理后A375、MEL-RM細胞凋亡相關(guān)指標檢測

圖3(a)～(c)顯示，在A375細胞中，草氨酸鈉與NTP聯(lián)用組的細胞凋亡率為69.2%±6.2%(4mmol·L-1，90 s)和78.2%±5.3%(6 mmol·L-1，90 s)，顯著高于NTP單獨處理組(13.4%±1.6%)；在MEL-RM細胞中，草氨酸鈉與NTP聯(lián)用組的細胞凋亡率為29.2%±4.0%(20 mmol·L-1，90 s)和38.4%±4.2%(30 mmol·L-1，90 s)，顯著高于NTP單獨處理組(14.5%±2.8%).MMP下降是凋亡的早期事件之一，如圖3(d)所示，在A375和MEL-RM細胞中，單獨使用NTP或者草氨酸鈉處理，膜電位去極化作用較弱，與對照組無明顯差異；草氨酸鈉預處理后進行NTP暴露，線粒體膜電位去極化顯著增強.Western Blot檢測的凋亡相關(guān)蛋白PARP,Caspase-3的表達結(jié)果顯示(圖3(e)～(f))，在A375和MEL-RM細胞中，聯(lián)用組中凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3原帶顯著低于草氨酸鈉或NTP單獨處理組.雖然NTP單獨處理組和聯(lián)用組均出現(xiàn)cleaved-PARP，但聯(lián)用組cleaved-PARP條帶顯著增強.以上結(jié)果表明，草氨酸鈉與NTP聯(lián)合使用可顯著誘導凋亡.

2.3 草氨酸鈉聯(lián)合NTP處理對黑色素瘤細胞能量代謝的影響

如圖4所示，在A375細胞中，單獨使用草氨酸鈉處理，細胞氧耗量、基礎呼吸、最大呼吸和ATP產(chǎn)量均出現(xiàn)一定程度的下降.單獨使用NTP處理，細胞氧耗量、基礎呼吸、最大呼吸和ATP產(chǎn)量均無明顯變化.而聯(lián)用組中，細胞的氧耗量、基礎呼吸、最大呼吸和ATP產(chǎn)生量相較于兩者單獨處理組均顯著降低，表明草氨酸鈉與NTP聯(lián)合使用可進一步顯著抑制黑色素瘤細胞的能量代謝水平.

(a)氧耗率;(b)基礎呼吸;(c)最大呼吸;(d)ATP產(chǎn)量；*p<0.05，**p<0.01，*** p<0.001.圖4 草氨酸鈉聯(lián)合NTP處理顯著抑制黑色素瘤細胞的能量代謝

2.4 草氨酸鈉聯(lián)合NTP激活AMPK

在A375和MEL-RM細胞中，Western blot檢測AMPK及p-AMPK蛋白表達情況，結(jié)果如圖5所示.

(a)A375細胞中AMPK原帶及磷酸化帶;(b)MEL-RM細胞中AMPK原帶及磷酸化帶.圖5 草氨酸鈉聯(lián)合NTP處理顯著增強AMPK磷酸化

圖5顯示，在A375細胞中，AMPK原帶在各組均有明顯條帶，但只有聯(lián)用組出現(xiàn)p-AMPK條帶.在MEL-RM細胞中，AMPK原帶在各組均有明顯條帶，NTP單獨處理組和聯(lián)用組均有p-AMPK表達，但聯(lián)用組中p-AMPK條帶更強.以上結(jié)果提示，草氨酸鈉和NTP聯(lián)用能顯著促進AMPK的磷酸化.

2.5 草氨酸鈉聯(lián)合NTP導致細胞中ROS水平升高，引起AMPK磷酸化

草氨酸鈉處理細胞24 h后進行NTP暴露，ROS檢測結(jié)果如圖6(a)～(b)及(d)～(e)所示；為了進一步研究ROS的具體作用，在NTP處理前4 h使用ROS清除劑NAC預處理細胞，細胞活力及AMPK磷酸化檢測結(jié)果如圖6(c)，(f)及(g)所示.

(a, d)：A375，MEL-RM細胞內(nèi)ROS峰圖；(b, e)：A375，MEL-RM細胞內(nèi)ROS水平統(tǒng)計圖；(c, f)：NAC挽救A375，MEL-RM細胞活力實驗；(g)NAC預處理對AMPK磷酸化的影響；*p<0.05，**p<0.01，*** p<0.001.圖6 草氨酸鈉預處理促進NTP誘導的A375、MEL-RM細胞內(nèi)ROS水平升高，進而激活AMPK

圖6(a)～(b)及(d)～(e)顯示，在A375細胞中，盡管草氨酸鈉和NTP單獨處理組胞內(nèi)ROS較對照組有所升高，但聯(lián)用組胞內(nèi)ROS水平顯著高于NTP單獨處理組.在MEL-RM細胞中，草氨酸鈉單獨處理未顯著改變胞內(nèi)ROS水平，NTP單獨處理使胞內(nèi)ROS有所升高，但聯(lián)用組胞內(nèi)ROS水平較NTP單獨處理組顯著升高.圖6(c)及(f)顯示，在NTP處理前4 h使用ROS清除劑NAC預處理細胞可顯著提高聯(lián)用組細胞活力；另外，在A375細胞中，NAC處理使聯(lián)用組中p-AMPK帶明顯減弱(圖6(g)所示)，說明NAC處理對聯(lián)用組中AMPK磷酸化也有抑制作用，提示胞內(nèi)ROS水平上升導致了AMPK磷酸化.

3 討 論

ROS是細胞內(nèi)氧相關(guān)的代謝產(chǎn)物，外界刺激因素如紫外線、電離輻射、化療藥物可導致胞內(nèi)ROS水平顯著升高，發(fā)生氧化應激，損傷細胞內(nèi)功能分子，甚至導致細胞死亡[9].引起胞內(nèi)ROS升高是NTP殺傷腫瘤細胞的重要機制.癌細胞的代謝率較高，胞內(nèi)ROS的本底水平顯著高于正常細胞，且過氧化氫酶等表達顯著低于正常細胞.因此當發(fā)生氧化脅迫時，腫瘤細胞內(nèi)ROS水平比正常細胞更容易達到閾值，引起線粒體受損、DNA損傷，誘發(fā)細胞凋亡，從而達到選擇性殺傷癌細胞的效果[10].該研究中使用NTP處理黑色素瘤細胞后，細胞內(nèi)ROS水平顯著上升，與既往研究報道[4]一致.

小分子藥物草氨酸鈉是一種公認的LDH特異性抑制劑，近年來在癌癥治療方向被廣泛研究，體外實驗中它能夠有效抑制腫瘤細胞的能量供給、生長和遷移，動物實驗中抑制腫瘤細胞的成瘤能力，影響腫瘤相關(guān)巨噬細胞的極化，進而起到抗腫瘤的效果[11].國外有研究發(fā)現(xiàn)抑制LDH會引起胰腺癌細胞內(nèi)ROS爆發(fā)，從而起到抑制細胞生長甚至殺傷細胞的作用[19].國內(nèi)也有研究報道草氨酸鈉可與放射聯(lián)合使用，通過抑制細胞生長、DNA修復、增強細胞周期阻滯提高鼻咽癌、非小細胞肺癌的放射敏感性[12].筆者將草氨酸鈉與NTP聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合使用能夠顯著增強對黑色素瘤細胞A375，A875和MEL-RM的殺傷作用，初步探究其可能的機制，發(fā)現(xiàn)相對于對照組、藥物單獨處理組、NTP單獨處理組，聯(lián)用組能夠顯著增強細胞內(nèi)ROS，降低線粒體膜電位和能量代謝水平，顯著提高凋亡相關(guān)蛋白的表達和凋亡細胞比率.

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物，是生物體內(nèi)維持營養(yǎng)和能量平衡的傳感器，由負責催化的α亞基和負責調(diào)節(jié)的β和γ亞基組成異三聚體復合物，通過感知胞內(nèi)AMP/ATP或ADP/ATP比率變化來監(jiān)測細胞能量狀態(tài)[20].當細胞發(fā)生氧化脅迫如ROS升高時，能量代謝受阻，AMP相對含量升高，引起AMPK磷酸化，激活下游凋亡通路，導致細胞死亡[21].筆者研究發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉與NTP聯(lián)用能夠顯著增強AMPK的磷酸化水平，經(jīng)NAC處理后，聯(lián)用組細胞活力得到顯著回升，且AMPK磷酸化水平明顯減弱，表明ROS升高是AMPK活化的主要原因，兩者聯(lián)用共同參與對黑色素瘤細胞的促凋亡進程.

4 結(jié)束語

綜上所述，草氨酸鈉與NTP聯(lián)用能夠顯著增強對人黑色素瘤細胞的殺傷作用，其機制可能是通過提高胞內(nèi)ROS水平，引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損、能量代謝受阻，ADP/ATP比率升高導致AMPK磷酸化顯著增強，從而引起下游凋亡相關(guān)通路過度激活所致.該研究可為等離子體今后在癌癥治療方面的發(fā)展提供一定的理論基礎和指導.

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致謝：感謝中國科學院等離子體物理研究所程誠副研究員和奚文灝在等離子體處理方面給予的專業(yè)指導.