牛廣東

聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院 開(kāi)封院區(qū)，河南 開(kāi)封，475004

菊花為菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat.)的干燥頭狀花序，主產(chǎn)于安徽歙縣、屯溪、滁州、亳州，浙江桐鄉(xiāng)，江蘇射陽(yáng)，湖北麻城，山東嘉祥，河南武陟，河北安國(guó)等7個(gè)省10個(gè)縣(市)[1]。菊花的傳統(tǒng)加工炮制方式有蒸制、炒制、釀制、酒制、漿制、陰干、烘干，現(xiàn)代一般采用的加工方式是烘房干燥、熱風(fēng)干燥等[2]。按產(chǎn)地及加工方式的不同，菊花可分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”和“懷菊”五大品種。杭菊經(jīng)產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)期栽培，分化為杭白菊和杭黃菊兩種類(lèi)型。杭白菊產(chǎn)量大，有較強(qiáng)的保健養(yǎng)生功效；杭黃菊近年來(lái)種植很少[3-4]。杭菊道地產(chǎn)地浙江桐鄉(xiāng)主要栽培的杭菊為杭白菊，共有三個(gè)品種:湖菊(D.morifolium“Huju”)，小白菊(D.morifolium“Xiaobaiju”)，大白菊(D.morifolium“Dabaiju”)。小白菊的栽培最多，又被稱為“小洋菊”。

菊花始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》:“味苦平，主諸風(fēng)頭眩，腫痛目欲脫淚出，皮膚死肌，惡風(fēng)濕痹，久服利血?dú)?，輕身耐老延年”?，F(xiàn)代研究表明菊花中的活性成分包括黃酮、揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、三萜等[5-7]。本文以綠原酸、異綠原酸、木樨草苷為指標(biāo)，采用高效液相色譜方法對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的10批杭白菊藥材進(jìn)行檢驗(yàn)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器及試劑

高效液相色譜系統(tǒng)(LC-20AT 液相色譜輸液泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-20A 紫外檢測(cè)器、LCSolution色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津)，AB135-S電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，瑞士)，KQ-500DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。綠原酸(批號(hào)18071907，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，木樨草苷(批號(hào):19070302，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，異綠原酸(批號(hào):18121001，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，色譜純乙腈、甲醇、磷酸均為分析純。

1.2 樣品

菊花1號(hào)(產(chǎn)地:浙江桐鄉(xiāng)，批號(hào):200102，浙江良一藥業(yè)股份有限公司)，菊花2號(hào)(產(chǎn)地:浙江，批號(hào):20200108，泌陽(yáng)縣玉坡農(nóng)業(yè)專(zhuān)業(yè)合作社)，菊花3號(hào)(產(chǎn)地:浙江，批號(hào):190304010，湖南省博世廉中醫(yī)藥有限公司)，菊花4號(hào)(產(chǎn)地:浙江，批號(hào):A200203，湖北金貴中藥飲片有限公司)，菊花5號(hào)(產(chǎn)地:浙江，批號(hào):191250481，康美藥業(yè)股份有限公司)，菊花6號(hào)(產(chǎn)地:浙江，批號(hào):A200411，湖北金貴中藥飲片有限公司)，菊花7號(hào)(產(chǎn)地:浙江，批號(hào):A190507，湖北金貴中藥飲片有限公司)，菊花8號(hào)(產(chǎn)地:浙江，批號(hào):200202，亳州市張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司)，菊花9 號(hào)(產(chǎn)地:安徽黃山，批號(hào):190601)，菊花10號(hào)(產(chǎn)地:亳州中強(qiáng)，批號(hào):180701)。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取菊花粉末(過(guò)一號(hào)篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中；精密加入70%(v/v)甲醇25 m L，密塞，稱定重量；超聲處理(功率300 W，頻率45 k Hz)40 min，放冷，再稱定重量；用70%(v/v)甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、木樨草苷、異綠原酸對(duì)照品適量，用70%(v/v)甲醇制成綠原酸濃度為32 mg/L、木樨草苷濃度為25 mg/L、異綠原酸濃度為84 mg/L的對(duì)照品混合溶液。

2.3 色譜條件

采用Merk Purosher RP-18 e(4.6 mm×250 mm，5μm)測(cè)定方法，流動(dòng)相A 為乙腈，流相B 為0.2%(m/m)磷酸水溶液。梯度洗脫:0～10 min A為10%～15%；10～40 min A 為15%～25%；40～60 min A 為25%。流速0.8 m L/min，檢測(cè)波長(zhǎng)348 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10μL，理論塔板數(shù)不低于8 000。

2.4 含量測(cè)定

取菊花1號(hào)到10號(hào)樣品，分別按第2.1節(jié)中方法制備供試品溶液，按第2.3節(jié)中所記錄的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取第2.2 節(jié)中對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、5、10、15μL 注入高效液相色譜儀，根據(jù)第2.3節(jié)中所記錄的色譜條件測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積，以綠原酸、木樨草苷、異綠原酸進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程(見(jiàn)表1)。結(jié)果顯示:綠原酸在0.016～0.48μg范圍內(nèi)，峰面積和濃度有良好的線性關(guān)系；木樨草苷在0.012 5～0.375μg范圍內(nèi)，峰面積和濃度有良好的線性關(guān)系；異綠原酸在0.042～1.26μg范圍內(nèi)，峰面積和濃度有良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

3.2 精密度試驗(yàn)

取第2.2節(jié)中混合對(duì)照品溶液，精密吸取，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次；按第2.3節(jié)中所記錄的色譜條件測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積。計(jì)算得:綠原酸峰面積的RSD=0.2%，木樨草苷峰面積的RSD=0.5%，異綠原酸峰面積的RSD=0.9%?？芍?，實(shí)驗(yàn)所用儀器的精密度較好。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批菊花粉末供試品，按第2.1節(jié)中方式制備6份供試品溶液，按第2.3節(jié)中所記錄的色譜條件測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積。計(jì)算得:綠原酸含量的RSD=0.2%，木樨草苷含量的RSD=0.3%，異綠原酸含量的RSD=0.2%。可知，該方法的重復(fù)性較好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取第2.1節(jié)中同一供試品溶液，依次在0、2、6、12、18、24 h時(shí)向高效液相色譜儀中進(jìn)樣；按第2.3節(jié)中所記錄的色譜條件測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積。計(jì)算得:綠原酸峰面積的RSD=1.2%，木樨草苷峰面積的RSD=1.7%，異綠原酸峰面積的RSD=0.4%?？芍?，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取已知含量的同一供試品6份，分別精密加入混合對(duì)照溶液適量，精密吸取10μg，向高效液相色譜儀中進(jìn)樣，按“2.3”中所記錄的色譜條件測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積，計(jì)算綠原酸、木樨草苷、異綠原酸的平均加樣回收率，綠原酸的平均加樣回收率為99%、木樨草苷的平均加樣回收率為99%、異綠原酸的平均加樣回收率為99%，RSD 綠原酸為2.6%，RSD 木樨草苷為1.7%，RSD異綠原酸為1.2%，均在允許范圍內(nèi)，此方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.6 含量測(cè)定

取市售10批菊花樣品，分別按第2.1節(jié)中方法制備供試品溶液，精密吸取，注入高效液相色譜儀；按第2.3節(jié)中所記錄的色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可看出，10批菊花藥材中活性成分綠原酸的平均含量為0.29%、木樨草苷的平均含量為0.53%、異綠原酸的平均含量為1.37%?！吨袊?guó)藥典》2020版一部中[8]要求，菊花中所含綠原酸含量不得少于0.2%、木樨草苷含量不得少于0.080%、異綠原酸含量不得少于0.70%。市售的10批杭白菊藥材中，大多數(shù)菊花的綠原酸含量在0.2%～0.3%左右，8號(hào)和10號(hào)樣品中的綠原酸含量最高，分別為0.42%和0.45%；9號(hào)樣品的綠原酸含量最低，為0.18%，未達(dá)到《中國(guó)藥典》2020 版一部的要求，可判定為不合格藥材。木樨草苷的含量大多在0.25%～0.35%左右，10 號(hào)樣品中木樨草苷的含量最高(2.6%)；異綠原酸含量大多在0.8%～1.5%左右，8號(hào)和10 號(hào)樣品中的異綠原酸含量最高，分別為2.26%和2.6%，2號(hào)和3號(hào)樣品的異綠原酸含量最低，分別為0.82%和0.83%。綜上可看出:10批菊花中，除9號(hào)樣品外，其余廠家的菊花藥材中綠原酸、木樨草苷和異綠原酸均達(dá)到了《中國(guó)藥典》2020年版的要求。其中以亳州中強(qiáng)的10號(hào)樣品質(zhì)量最好，其次是浙江的8號(hào)樣品，其他樣品質(zhì)量相近。

表3 含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

不同柱溫、不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，本實(shí)驗(yàn)在20～40℃柱溫之間根據(jù)分離效果選擇了30 ℃柱溫為色譜條件；在200～400 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)之間根據(jù)色譜峰大小，選擇了348 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)為色譜條件，實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離度不符合要求，所以調(diào)整流動(dòng)相的組成和洗脫程序，確定乙腈-0.2%磷酸水溶液流動(dòng)相。