朱高翔 張美迪 宋曉飛 崔浩楠 李曉麗 朱雪云 閆立英

摘要：以黃瓜皺葉突變體 lc 及其野生型自交系樂亭白黃瓜為試材，研究其主要農(nóng)藝性狀、葉綠素含量、光合特性、表皮細(xì)胞形狀、葉肉細(xì)胞排列和遺傳規(guī)律。與野生型相比，突變體 lc 表現(xiàn)為葉片皺縮、葉形改變、葉基部沿凹陷處緊靠攏、株型緊湊、植株長勢正常。突變體葉綠素 a 含量顯著高于野生型，達(dá) 15.2%，而二者之間葉綠素 b、類胡蘿卜素 c和葉綠素 a/b 的含量均無顯著差異;皺葉突變體的 Pn和 Tr顯著高于野生型，分別提高 28.4%和 30.4%，Gs極顯著高于野生型，提高 38.6%，二者間 Ci差異不顯著。遺傳規(guī)律分析表明，皺葉突變表型由單隱性核基因控制，命名為 Cslc。

關(guān)鍵詞：黃瓜;皺葉;葉綠素含量;光合特性;遺傳分析

中圖分類號：S642.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-2871（2022）03-009-07

Abstract： In this study， a crinkled leaf mutant lc and its wild-type inbred line Laoting White cucumber were used as testmaterials to evaluate main agronomic traits， chlorophyll content， photosynthetic characteristics， epidermal cell shape，mesophyll cell arrangement and inheritance of the mutant. Compared with wild type， the mutant showed crinkled leaf，changed leaf shape， closed leaf base along the depression， compact plant and normal plant growth. The content of chloro phyll a in mutant was 15.2% higher than that in wild-type， but the content of chlorophyll b， carotenoid c and chlorophyll a/bhad no significant difference between the mutant and wild type. The net photosynthetic rate（Pn）and transpiration rate（Tr）of the mutant were 28.4% and 30.4% higher than those of the wild type. The stomatal conductance（Gs）of themutant was 38.6% higher than that of the wild type. Intercellular CO2 concentration（Ci）had no significant differencebetween the mutant and wild type. Genetic analysis suggests that the mutant phenotype of crinkled leaf is controlled by asingle recessive nuclear gene named Cslc.

Key words： Cucumber; Crinkled leaf; Chlorophyll content; Photosynthetic characteristics; Genetic analysi

黃瓜（Cucumis sativus L.）屬于葫蘆科甜瓜屬植物，是高產(chǎn)高效的世界性蔬菜，具有食用、保健、美容等功效，種植地域范圍廣，是我國主要栽培的蔬菜作物之一。黃瓜在河北省產(chǎn)業(yè)頗具規(guī)模，播種面積大、產(chǎn)量高，據(jù)河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳資料顯示，2018年河北黃瓜播種面積及產(chǎn)量均位于全省蔬菜品類第二，僅次于大白菜[1-2]。株型是與黃瓜產(chǎn)量密切相關(guān)的重要性狀，是植物器官生長狀態(tài)的表型結(jié)構(gòu)。葉形是構(gòu)成理想株型的重要組成部分[3-6]，直接影響黃瓜植株的光合效率，進(jìn)而影響果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量[7]。

葉片皺縮卷曲是“理想株型”的重要表現(xiàn)之一，影響植株的光合效率和蒸騰速率。迄今為止，在棉花、大麥、水稻和玉米等作物中均發(fā)現(xiàn)了葉片皺縮突變體，但是葉片皺縮的原因各不相同。1937 年Harland 在海島棉中發(fā)現(xiàn)一種“矮皺突變體”（crin kled dwarf），他認(rèn)為該性狀是葉肉與葉脈延展不平衡所致[8]。高陽[9]使用高通量測序技術(shù)，以突變體及其近等基因系的棉花莖尖為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序獲得 Unigene 序列，以此為參照序列進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜分析，篩選差異基因。通過數(shù)字表達(dá)譜分析、KEGG 分析等途徑從中挑選出 10 個(gè)相關(guān)基因，利 用 qRT-PCR 在葉皺小突變體根尖、莖尖中進(jìn)行驗(yàn)證，其表達(dá)量與數(shù)字表達(dá)譜結(jié)果一致。為了驗(yàn)證這10 個(gè)基因與葉皺小突變體的產(chǎn)生是否相關(guān)，進(jìn)一步利用 VIGS 技術(shù)抑制其在野生型中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在野生型中沉默掉 ABCB19 基因出現(xiàn)與葉皺小突變體相似的表型。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)葉皺小突變體的產(chǎn)生與生長素密切相關(guān)。

Jarvi 等[10]首次報(bào)道大麥籽粒皺縮自然突變體，并通過易位試驗(yàn)將大麥皺縮突變體 seg4 定位到 1號染色體上，但迄今為止大麥皺縮突變體 seg4 的分子機(jī)制尚不清楚;孫敏[11]通過對籽粒飽滿的 BM42（Bowman）和籽粒皺縮突變體 BM3 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有 SNP 數(shù)量最多的染色體是 6H，并進(jìn)一步對花后 3 個(gè)不同時(shí)期檢測到的 2087 個(gè)非重復(fù)的差異表達(dá)基因進(jìn)行 KEGG 通路富集分析、主成分分析、表達(dá)模式聚類分析及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，篩選出 12 個(gè)差異表達(dá)基因，推測這些基因可能與大麥皺縮突變有關(guān)。粘金沯[12]通過圖位克隆技術(shù)將水稻葉尖皺縮扭曲突變基因 LTR1 初步定位于第2 條染色體上，位于 RM6318 和 RM1920 標(biāo)記之間;進(jìn)一步擴(kuò)大群體，最終將 LTR1 精細(xì)定位在兩個(gè)標(biāo)記 STS-N12 與 CAPS-N20 之間、物理距離約 12.3kb 的候選區(qū)域內(nèi)，LTR1 基因是一個(gè)控制葉片形態(tài)發(fā)育的新基因，該基因與葉片表型之間的關(guān)系及其調(diào)控分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。李峰利[13]在陸地棉中獲得一個(gè)自然突變的棉花皺葉突變體 wr3，通過 BSA 方法和圖位克隆將 wr3 定位在 21 號染色體的 NAU3740 和 cgr5428 兩個(gè)標(biāo)記之間，遺傳距離分別為 4.8 cM 和 10.4 cM。周練等[14]用甲基磺酸乙酯（EMS）處理玉米自交系 Mo17 花粉得到一個(gè)葉片皺縮突變體 wl1;通過分析定位區(qū)間候選基因在玉米葉中的表達(dá)水平、全基因組測序以及與 7 個(gè)不同 玉 米 自 交 系 的 序 列 比 對 ，初 步 預(yù) 測Zm00001d027266 基因?yàn)橛衩装櫲~突變體 wl1 的候選基因，該基因 Zm00001d027266 CDS 序列第 797個(gè)堿基由 G 轉(zhuǎn)變?yōu)?A，導(dǎo)致該位點(diǎn)編碼的絲氨酸替換為天冬氨酸，這可能是 wl1 表型產(chǎn)生的原因。周世奇等[15]利用航天誘變方法獲得煙草品種 NC89 的突變體 NC89-M，與野生型相比，NC89-M 葉形呈寬橢圓，葉面褶皺，葉緣呈鋸齒狀。通過混合集團(tuán)分離法，確定 SSR 標(biāo)記 PT60795 與葉形性狀連鎖。利用已有的突變體基因組序列信息，開發(fā) InDel 標(biāo)記最終將突變基因 nc89m 定位于標(biāo)記 PT60795 與 In Del5 之間，遺傳距離分別為 2.9 cM 和 4.4 cM。在該 區(qū) 間 內(nèi) 發(fā) 現(xiàn) 在 葉 片 中 高 表 達(dá) 的 基 因 Nit ab4.50000008g0880.1 編碼區(qū)第 1294 個(gè)核苷酸發(fā)生突變，由腺嘌呤突變?yōu)榘奏?，其編碼氨基酸由酪氨酸突變?yōu)樘於彼幔虼藢⑵渥鳛?nc89m 的候選基因。

發(fā)掘和鑒定新的皺葉材料，開展皺縮突變基因的定位、克隆等對“理想株型”研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。河北科技師范學(xué)院黃瓜遺傳育種課題組前期在黃瓜地方資源樂亭白黃瓜自交系中發(fā)現(xiàn)了一份自然突變的皺葉突變體。與野生型相比，突變體葉片皺縮、葉形改變、葉基部沿凹陷處緊靠攏、株型緊湊、植株長勢正常。目前黃瓜葉片皺縮的原因及其分子機(jī)制尚不清楚。筆者以 lc 突變體及其野生型樂亭白黃瓜自交系為材料，對其苗期和結(jié)果期的主要農(nóng)藝性狀、葉綠素含量、光合特性、細(xì)胞形態(tài)及遺傳規(guī)律進(jìn)行了研究，為定位、克隆皺葉突變基因奠定材料基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

以黃瓜地方資源樂亭白黃瓜自交系及其皺葉突變體（lc）為試驗(yàn)材料。樂亭白黃瓜是河北科技師范學(xué)院對唐山地區(qū)地方種質(zhì)資源純化所得的優(yōu)良自交系;皺葉突變體是在樂亭白黃瓜自交系中發(fā)現(xiàn)的自然突變體。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征和主要農(nóng)藝性狀調(diào)查 試驗(yàn)于2021 年春季在河北科技師范學(xué)院施各莊試驗(yàn)基地進(jìn)行。在日光溫室中育苗，于 1 月 20 日播種，2 月16 日定植。雙行定植，株距 25 cm，大行距 80 cm，小行距 50 cm。野生型親本（P1）定植 29 株，突變體lc 親本（P2）定植 10 株，F(xiàn)1 定植 13 株，F(xiàn)2 定植 180株，常規(guī)田間栽培管理。在結(jié)果盛期對突變體 lc 及其野生型親本樂亭白黃瓜各選擇長勢基本一致的 6株植株進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀的調(diào)查。主要農(nóng)藝性狀的調(diào)查參照李錫香等[16]編著的《黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，并稍作改動(dòng)。

葉片長：結(jié)果盛期，主蔓中部最大葉片基部到葉先端的長度，單位 cm。

葉片寬：結(jié)果盛期，主蔓中部最大葉片最寬處的寬度，單位 cm。

葉面積：透明方格板法，單位 cm2。

葉柄長：結(jié)果盛期，主蔓中部最大葉葉柄的長度，單位 cm。

葉柄著生角度：結(jié)果盛期，最大葉葉柄與主蔓自然夾角的角度，單位（°）。

株高：結(jié)果盛期，地面至植株最高點(diǎn)的高度，單 位 cm。

株幅：結(jié)果盛期，植株葉片伸展的最大距離，單 位 cm。

節(jié)間長：結(jié)果盛期，植株主蔓中部最大葉所在節(jié)的節(jié)間長度。單位 cm。

節(jié)數(shù)：可見葉片，節(jié)間長大于 1 cm 的節(jié)數(shù)。

雄花花冠直徑：盛開當(dāng)天上午，雄花花冠的直徑，單位 cm。

雄花花瓣長：盛開當(dāng)天上午，雄花花瓣的長度，單位 cm。

雄花花瓣寬：盛開當(dāng)天上午，雄花花瓣的寬度，單位 cm。

瓜長：結(jié)果盛期，正常商品瓜瓜蒂至瓜頂?shù)拈L度，單位 cm。

瓜橫徑：結(jié)果盛期，正常商品瓜距瓜頂 1/3 處的橫徑，單位 cm。

把瓜比：結(jié)果盛期，正常商品瓜瓜把長/瓜長。

腔徑比：結(jié)果盛期，正常商品瓜中心腔直徑/瓜橫徑。

可溶性固形物含量：100 g 新鮮商品瓜瓜肉所含可溶性固形物的克數(shù)，單位%。

1.2.2 遺傳分析 試驗(yàn)于 2019 年春季在河北科技師范學(xué)院施各莊試驗(yàn)基地進(jìn)行。在日光溫室中育苗，于 3 月 22 日播種，4 月 9 日定植。雙行定植，株 距 25 cm，大行距 80 cm，小行距 50 cm。野生型親本（P1）、突變體 lc 親本（P2）、F1和 F1 反各定植 38 株， F2定植 226 株，常規(guī)管理。 苗期分別觀察統(tǒng)計(jì)野生型親本、突變體親本、F1、F1 反和 F2植株的葉片皺縮分離情況，并采用 SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件對調(diào)查結(jié)果進(jìn)行卡平方測驗(yàn)（χ2）檢測分離比適合度，分析黃瓜葉片皺縮性狀的遺傳規(guī)律。 1.2.3 葉綠素含量的測定 結(jié)果盛期，分別取皺葉突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜生長點(diǎn)以下第 4 片成熟新鮮葉，采用乙醇浸提法提取葉綠素[17]。雙親各選 3 株，每株設(shè) 3 次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)稱取0.1 g 葉片放入 10 mL 離心管中，加入 5 mL95%的乙醇溶液 5 mL，避光浸泡 96 h，浸泡過程中每天顛倒混勻 2 次，葉片完全脫色后使用上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)的 INESA765 型分光光度計(jì)測定消光度值，計(jì)算葉綠素 a、葉綠素 b 和類胡蘿卜素 c 的含量;以 95%乙醇溶液作為空白對照，溶液分別于波長為 665 nm、649 nm 和 470 nm 下進(jìn)行比色，所測的吸光度（OD）代入下列公式，得到葉綠素 a（Chla）、葉綠素 b（Chlb）、類胡蘿卜素 c（Caro）含量（mg·g-1）。

1.2.4 光合作用參數(shù)測定 在結(jié)果盛期利用德國Walz 公司生產(chǎn)的便攜式光合熒光測量系統(tǒng)——GFS-3000 于晴天 9：00—11：00，測定突變體 lc 及野生型樂亭白黃瓜的葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）與細(xì)胞間隙 CO2 濃度（Ci）等指標(biāo)。測定時(shí)儀器使用開放式氣路，測定光源為 LED紅藍(lán)光源，光強(qiáng)設(shè)為 1000 μmol·m-2 ·s-1）。皺葉突變體和野生型各選 3 株，每株在生長點(diǎn)下第 5 片真葉測定光合作用參數(shù)。

1.2.5 表皮細(xì)胞掃描電鏡觀察 選取突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜植株生長點(diǎn)下第 5 片葉片觀察表皮細(xì)胞形態(tài)。切取雙親相同部位的葉片（面積為3 mm×3 mm），放入青霉素小瓶中加入戊二醛固定液固定，抽真空處理，4 ℃過夜，脫水，噴金處理，通過掃描電鏡觀察葉片表皮細(xì)胞形態(tài)[18]。

1.2.6 石蠟切片觀察葉肉細(xì)胞 參照高東菊[8]的方法并作修改。選取黃瓜皺葉突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜植株新鮮葉片觀察葉肉細(xì)胞形態(tài)。切取相同部位的葉片，F(xiàn)AA 固定液固定，抽真空處理， 4 ℃過夜，用不同濃度乙醇∶二甲苯進(jìn)行脫水處理，石蠟∶二甲苯 60 ℃孵育，100%石蠟繼續(xù)孵育。脫 蠟、包埋、切片、染色、顯微鏡觀察葉肉細(xì)胞。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖，用 DPS9.01 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜皺葉突變體形態(tài)學(xué)調(diào)查

由圖 1 可以看出，與野生型植株相比，黃瓜皺葉突變體表現(xiàn)為葉片皺縮、葉基部沿凹陷處緊靠攏，花器官皺縮、株型緊湊，植株長勢正常且表型穩(wěn)定。

由表 1 可以看出，在結(jié)果盛期，突變體與野生型相比，葉長、葉寬差異不顯著，但葉面積差異顯著，突變體葉面積顯著大于野生型，達(dá) 21.10%。突變體與野生型節(jié)間長、葉柄長、節(jié)數(shù)差異不顯著，但株高差異顯著，突變體株高顯著低于野生型，達(dá)11.0%。突變體株幅、葉柄著生角度均極顯著小于野生型，分別達(dá) 16.0%和 60.10%。突變體雄花花冠直徑、雄花花瓣長、雄花花瓣寬極顯著大于野生型，分別達(dá) 14.80%、13.30%和 33.30%。野生型與突變體相比，把瓜比差異極顯著，瓜長、瓜橫徑、腔徑比和可溶性固形物含量差異均不顯著。

2.2 黃瓜皺葉突變體葉綠素含量測定

由表 2 可以看出，與野生型相比，皺葉突變體植株葉綠素 a 含量顯著增加 ，比野生型提高了15.2%，而葉綠素 b、類胡蘿卜素 c 和葉綠素 a/b 的含量差異不顯著，突變體葉綠素 b 和類胡蘿卜素 c含量較野生型分別提高 14.6%和 15.6%，葉綠素 a/b較野生型提高 0.32%。

2.3 黃瓜皺葉突變體光合參數(shù)測定

由表 3 可以看出，黃瓜皺葉突變體 lc 的 Pn和 Tr均 顯 著 高 于 樂 亭 白 黃 瓜 ，分 別 提 高 28.40% 和30.40%，表明突變體光合能力強(qiáng)、葉片蒸騰速度快;突變體 Gs極顯著的高于樂亭白黃瓜，高達(dá) 38.60%; Ci差異不顯著，表明突變體和野生型對 CO2的利用率差異不大。

2.4 表皮細(xì)胞掃描電鏡觀察結(jié)果

由圖 2 可以看出，皺葉突變體的表皮細(xì)胞與野生型相比也呈現(xiàn)皺縮狀態(tài)，野生型葉表皮氣孔處于閉合狀態(tài)，突變體葉表皮氣孔部分處于開放狀態(tài)，相同視野下突變體的氣孔開放數(shù)目比野生型多。

2.5 表皮細(xì)胞石蠟切片觀察結(jié)果

由圖 3 可以看出，皺葉突變體葉片未皺縮部位的葉肉細(xì)胞較野生型葉肉細(xì)胞相近。突變體皺縮部位葉肉細(xì)胞較野生型葉肉細(xì)胞相比，海綿細(xì)胞變少，表皮細(xì)胞數(shù)目不變，葉片變薄，其中突變體葉肉厚度約為 186.8 μm，野生型葉肉厚度約為274.2 μm。

2.6 黃瓜皺葉突變體的遺傳規(guī)律分析

為了分析黃瓜皺葉突變體的遺傳規(guī)律，以皺葉突變體 lc 和野生型樂亭白黃瓜為親本，雜交獲得 F1 和 F1 反，F(xiàn)1和 F1 反植株均表現(xiàn)為野生型表型，表明突變性狀由隱性核基因調(diào)控。F1 代自交構(gòu)建的 F2 代分離群體中，突變表型植株 52 株，野生型表型植株174 株 ，其分離比率為 3.35∶1（χ2=0.377<χ2（0.05，1）= 3.84），基本符合孟德爾遺傳規(guī)律的理想分離比 3∶1 （表 4），因此黃瓜皺葉突變基因?yàn)閱坞[性核基因，命 名 Cslc。

3 討論與結(jié)論

近年來，與植物葉片皺縮突變體相關(guān)的研究相繼被報(bào)道，目前已在多種高等植物中發(fā)現(xiàn)了葉片皺縮突變體，如煙草[15]、水稻[19- 20]、膏桐[21]、大豆[22]、甘 藍(lán)[23]、棉花[13，24]。

目前，黃瓜中皺葉突變體未見報(bào)道，但黃瓜超級緊湊或矮化突變體[25-26]、大豆葉片黃化新突變體[27]等均伴隨葉片皺縮表型。在本試驗(yàn)中，黃瓜皺葉突變體為自然突變材料，該突變體表現(xiàn)為葉片皺縮、株型緊湊且植株長勢正常。筆者發(fā)現(xiàn)了一份新的皺葉突變體材料，在生產(chǎn)上可以利用其株型緊湊的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行合理密植。同時(shí)，突變體 lc 的發(fā)現(xiàn)豐富了葉形突變體的種質(zhì)資源，也為黃瓜株型的改良提供了重要的材料。

葉片中葉綠素含量與凈光合速率密切相關(guān)[28]。在本試驗(yàn)中，皺葉突變體植株葉綠素 a 含量顯著高于野生型植株，突變體的葉綠素 a 含量比野生型提高了 15.20%，而葉綠素 b、類胡蘿卜素 c 的含量和葉綠素 a/b 的值在兩親本間無顯著差異，但突變體葉綠素 b 和類胡蘿卜 c 含量較野生型分別提高14.60%和 15.60%。葉綠素含量測定結(jié)果與光合指標(biāo)測定結(jié)果一致，黃瓜皺葉突變體 lc 的 Pn 顯著高于野生型，提高了 28.40%?？梢岳猛蛔凅w株型緊湊和光合速率高的優(yōu)點(diǎn)配制雜交組合，為后期進(jìn)行新品種選育奠定材料基礎(chǔ)。

不同物種中皺葉突變體已被廣泛研究，產(chǎn)生皺葉的原因也各不相同。本試驗(yàn)通過掃描電鏡和石蠟切片觀察野生型和突變體的葉片變化，發(fā)現(xiàn)皺葉突變體的表皮細(xì)胞與野生型相比也呈現(xiàn)皺縮狀態(tài)，野生型葉表皮氣孔處于閉合狀態(tài)，突變體葉表皮氣孔部分處于開放狀態(tài);皺葉突變體葉片未皺縮部位的葉肉細(xì)胞與野生型葉肉細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)相似，差異不大，但是皺葉突變體葉片的皺縮部位葉肉細(xì)胞比野生型薄，皺葉突變體的海綿層細(xì)胞數(shù)目比野生型少。突變體 lc 的葉片皺縮表型是海綿細(xì)胞數(shù)目變少導(dǎo)致的，這一研究結(jié)果與其他物種產(chǎn)生皺縮的原因不同[14，29-30]。

目前，國內(nèi)外尚未見到關(guān)于黃瓜皺葉突變體商品瓜性狀研究的相關(guān)報(bào)道，突變體 Cslc 的發(fā)現(xiàn)為研究黃瓜商品瓜性狀提供了良好的種質(zhì)材料。在本試驗(yàn)中，野生型與突變體相比，把瓜比差異極顯著，瓜長、瓜橫徑、腔徑比和可溶性固形物含量差異不顯著。但由于試驗(yàn)前期筆者關(guān)注更多的是生理指標(biāo)和光合指標(biāo)，因而沒有對商品瓜進(jìn)行測產(chǎn)。將在今后的試驗(yàn)中關(guān)注商品瓜產(chǎn)量，以期獲得更豐富的數(shù)據(jù)，進(jìn)而進(jìn)一步闡釋兩者間的差距。

現(xiàn)有研究表明，大部分作物中皺葉突變體是受一對隱性核基因控制的，如水稻[12]、玉米[14]、白菜[30]、棉花[13，31]等;但也有受不完全顯性核基因[32]、顯性基因控制的[9，33-34]。本試驗(yàn)中的黃瓜皺葉突變體為自然突變，遺傳分析表明，突變體受一對隱性核基因控制，這與大多數(shù)皺葉突變體的遺傳規(guī)律相一致。黃瓜基因組測序和相關(guān)功能基因注釋已完成，有助于推動(dòng)該基因的定位、克隆及其突變機(jī)制的進(jìn)一步研究。

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