徐素云 李佳佳 方 偉 王艷萍 耿偉濤

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

紅茶菌是一種歷史悠久的民間傳統(tǒng)發(fā)酵茶飲料，是以糖、茶、水為原料，經(jīng)醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物共同自然發(fā)酵而成，口感宜人，富含茶多酚、有機(jī)酸等多種活性功能成分，營(yíng)養(yǎng)豐富[1]。目前紅茶菌發(fā)酵多使用天然混菌體系家庭式發(fā)酵，其菌相組成復(fù)雜，菌種差異較大，導(dǎo)致發(fā)酵后的紅茶菌品質(zhì)不穩(wěn)定[2]，發(fā)酵菌種的確定是關(guān)鍵因素。在菌相學(xué)分析方面，紅茶菌中可能出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括三大類：醋酸菌、酵母菌及乳酸菌[3]。其中又以醋酸菌和酵母菌更為常見(jiàn)，且不同產(chǎn)地來(lái)源的紅茶菌其菌相組成有所不同，代謝產(chǎn)物也不一樣，因此想要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，還需進(jìn)一步對(duì)菌種進(jìn)行基礎(chǔ)研究。

研究擬以河南濟(jì)源地區(qū)民間流傳的紅茶菌為原料，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)紅茶菌發(fā)酵液中可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分離鑒定，同時(shí)，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)紅茶菌菌相進(jìn)行測(cè)序和菌相組成分析，一方面可系統(tǒng)了解紅茶菌中微生物多樣性及菌相結(jié)構(gòu)，另一方面可為豐富微生物菌種資源庫(kù)及實(shí)現(xiàn)紅茶菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原輔材料與試劑

綠茶：杭州明杭茶葉有限公司；

蔗糖：河南金潤(rùn)食品添加劑有限公司；

DNA Marker Taq酶、dNTP、引物、瓊脂糖、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 菌種及培養(yǎng)基

紅茶菌母液菌種：河南中沃實(shí)業(yè)有限公司；

MRS培養(yǎng)基、Elliker培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基：天津市江天化工技術(shù)有限公司；

溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：HT-400B型，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Sorvall ST 8R型， 美國(guó)Thermo fisher Scientific公司；

凝膠成像采集分析系統(tǒng)：Gel Doc XR+型，美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司；

擴(kuò)增儀：ETC 811 PCR型，上海珂準(zhǔn)儀器有限公司；

顯微鏡：YS100型，日本 Nikon 公司；

超凈工作臺(tái)烘箱：HF safe 900型，杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan GO型，美國(guó)Thermo公司；

電泳儀：DYY-6D型，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅茶菌發(fā)酵液制備 將10 g綠茶放入剛煮沸的開(kāi)水中浸泡10 min，用紗布過(guò)濾后加入80 g蔗糖，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝于食品級(jí)玻璃瓶中，90 ℃水浴10 min。冷卻后按體積分?jǐn)?shù)8%接種量將紅茶菌母液接種于茶湯中，常溫發(fā)酵12 d，得到pH值為2.3～2.9的紅茶菌發(fā)酵液。

1.3.2 采用16S rDNA和ITS高通量分析紅茶菌中微生物組成 選擇紅茶菌發(fā)酵液作為樣品進(jìn)行微生物菌相探究，試驗(yàn)分為細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS測(cè)序，由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

(1) DNA 提取及擴(kuò)增：采用基因組提取試劑盒提取總DNA。以20～30 ng DNA為模板，細(xì)菌選擇V4～V5 區(qū)通用擴(kuò)增引物 341F 和806 R 的16S rDNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增[4]；真菌選擇引物 ITS1F和ITS2的ITS 區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)[5-7]，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

(2) 生物信息學(xué)分析：

① 序列處理與優(yōu)化：通過(guò) Illumina Miseq 高通量測(cè)序平臺(tái)整理原始數(shù)據(jù)，采用QIIME軟件檢查及剔除嵌合體序列[8]。

② Alpha多樣性分析：根據(jù)最低的測(cè)序深度，隨機(jī)重復(fù)提取OTU豐度矩陣中的所有樣本，并使用QIIME軟件計(jì)算每個(gè)樣本的生物多樣性，主要包括Shanno、Simpson、Chao1、Ace指數(shù)等[9]。

③ 分類信息分析：通過(guò)RDP classifier軟件對(duì)各樣品中OTU依次進(jìn)行門(mén)、綱、目、科、屬水平的分類統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 紅茶菌中醋酸菌、乳酸菌、酵母菌的篩選與鑒定

(1) 菌株初篩：參照王潔琛等[10-11]的方法略作修改。將紅茶菌發(fā)酵液依次稀釋為10-5，10-6，10-7濃度的樣品，涂布至不同分離培養(yǎng)基上，觀察菌落特征及菌株個(gè)體形態(tài)，初步區(qū)分菌種的差異和類別。在溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基上挑選有明顯菌落形態(tài)、革蘭氏染色陰性和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株，初步視為醋酸菌；在MRS及Elliker培養(yǎng)基上挑選有明顯菌落形態(tài)、革蘭氏染色陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性菌株，初視為乳酸菌；在YPD培養(yǎng)基上挑選具有明顯菌落形態(tài)特征，鏡檢個(gè)體較大的菌株，初步視為酵母菌。

(2) 分子生物學(xué)鑒定：參照陳寵等[12]的方法，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州基迪奧生物有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST在線比對(duì)分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS 16.0 和 Origin 8.5 軟件分析和處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅茶菌中細(xì)菌和真菌群落多樣性及其組成

2.1.1 細(xì)菌及真菌Alpha多樣性 由表2可知，紅茶菌中細(xì)菌及真菌的Coverage值均達(dá)到99.9%以上，表明樣本測(cè)序結(jié)果可以反映樣品的真實(shí)情況，即此次取樣是合理的。此外，紅茶菌中細(xì)菌的Shannon、Simpson、ACE、Chao1指數(shù)和OTU數(shù)量均極顯著大于真菌(P<0.01)，表明細(xì)菌群落豐富度與多樣性大于真菌，與徐偉等[4]的結(jié)果一致。

表2 Alpha多樣性?Table 2 Alpha diversity

2.1.2 細(xì)菌的微生物組成 由圖1(a)可知，在門(mén)水平下，從紅茶菌發(fā)酵液中共鑒定出5個(gè)細(xì)菌門(mén)，其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)相對(duì)含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度高達(dá)99.20%，其次為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，相對(duì)豐度為0.54%，其他菌門(mén)總體豐度為0.07%左右。因此，在門(mén)水平下，可以確定變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌。由圖1(b)可知，在綱水平下，共鑒定出5個(gè)細(xì)菌綱，其中豐度最高的是α-變形菌(Alphaproteobacteria)，相對(duì)豐度為99.20%左右，其次為芽孢桿菌綱(Bacilli)，相對(duì)豐度為0.50%，其他菌綱總體豐度在0.07%左右，表明α-變形菌綱為優(yōu)勢(shì)菌。由圖1(c)可知，在目水平下，共鑒定出5個(gè)細(xì)菌目，豐度最高的是醋酸菌目(Acetobacteralesc)，相對(duì)豐度為99.20%，其次是乳桿菌目(Lactobacillales)，含量占0.48%，還有少量的擬桿菌目(Bacteroidales)、梭桿菌目(Fusobacterium)和棲熱菌目(Thermales)(共占0.07%左右)，表明目水平下醋酸菌目及乳桿菌目為優(yōu)勢(shì)菌。由圖1(d)可知，在科水平下，共鑒定出6個(gè)細(xì)菌科，豐度最高的是醋酸菌科(Acetobacteraceae)占92.20%，其次是乳桿菌科(Lactobacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)，分別占0.45%，0.03%，還有少量的擬桿菌科(Bacteroidaceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、棲熱菌科(Thermaceae)(共占0.05%左右)，表明科水平下醋酸菌科和乳桿菌科為優(yōu)勢(shì)菌。由圖1(e)可知，在屬水平下，共鑒定出7個(gè)細(xì)菌屬，豐度最高的是駒形氏桿菌(Komagataeibacter)占97.85%，其次是醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)分別占1.23%，0.43%，還有少量的明串株菌屬(Leuconostoc)、擬桿菌屬(Bacteroides)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、亞棲熱菌屬(Meiothermus)(總體豐度為0.08%左右)，表明駒形氏桿菌屬、醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，與Xia等[2]結(jié)果相似。駒形氏桿菌多為專性好氧菌，可產(chǎn)生細(xì)菌纖維素，且產(chǎn)酸能力強(qiáng)，在工業(yè)上常用于生產(chǎn)醋酸[13]。醋酸桿菌對(duì)有機(jī)酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成至關(guān)重要。乳酸桿菌屬是紅茶菌發(fā)酵液中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌屬，能使紅茶菌口感更柔和飽滿，促進(jìn)揮發(fā)物質(zhì)酯類、酸類、醇類等物質(zhì)的產(chǎn)生[14]。因此，將紅茶菌細(xì)菌群落在門(mén)、綱、目、科、屬水平下的組成關(guān)系繪制成圖(見(jiàn)圖2)。

圖1 各水平下細(xì)菌群落的相對(duì)百分含量Figure 1 Relative percentage of bacterial community at each level

由圖2可知，紅茶菌發(fā)酵液的細(xì)菌菌落組成中，主要為駒形氏菌屬(97.85%)、醋酸菌屬(1.23%)和乳酸菌屬(0.43%)，其中駒形氏菌屬和醋酸菌屬均屬于變形菌門(mén)，并且是變形菌門(mén)的兩大主要菌屬；乳桿菌屬屬于厚壁菌門(mén)，在厚壁菌門(mén)中所占相對(duì)比例達(dá)79.6%。

圖2 細(xì)菌群落組成關(guān)系Figure 2 Microbial community composition of bacteria

2.1.3 真菌的微生物組成 由圖3可知，在門(mén)水平下，子囊菌門(mén)(Ascomycota)的豐度最高，占92.87%，為門(mén)水平下的優(yōu)勢(shì)菌。子囊菌門(mén)是真菌中最大的一個(gè)門(mén)，相對(duì)于其他真菌而言，子囊菌門(mén)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此稱為高等真菌；在綱水平下，酵母綱(Saccharomycetes)的豐度最高，占92.04%，其次為糞殼菌綱(Sordariomycetes)，占0.001%，表明酵母綱為優(yōu)勢(shì)菌；在目水平下，酵母目(Saccharomycetales)的豐度最高，占92.04%，其次為糞殼菌(Sordariales)占0.001%，可認(rèn)為酵母目為目水平下的優(yōu)勢(shì)菌。糞殼菌目多含有各種腐敗菌，可能是傳統(tǒng)自然發(fā)酵紅茶菌中不良的雜菌，可對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生不良影響，與王春龍[15]結(jié)果相似；在科水平下，豐度最高的是酵母科(Saccharomycetaceae)，占71.5%，其他未鑒定菌科總體豐度為20.55%左右；在屬水平上，豐度最高的是德克酵母屬(Dekkera)占42.1%，其次是接合酵母屬(Zygosacchaormyces)占29.42%，其他未識(shí)別的屬占20.74%，可認(rèn)為德克酵母屬、接合酵母屬為優(yōu)勢(shì)菌。釀酒酵母和接合酵母是傳統(tǒng)發(fā)酵制品中最常用的菌種，也是產(chǎn)生酒精及各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要菌種，在發(fā)酵過(guò)程中，兩種酵母均能夠產(chǎn)生酯類、高級(jí)醇類和酸類等揮發(fā)性化合物[16]。因此，將紅茶菌真菌群落在門(mén)、綱、目、科、屬水平下的組成關(guān)系繪制成圖(見(jiàn)圖4)。

圖3 各水平下真菌群落的相對(duì)百分含量Figure 3 The relative percentage of microorganisms at the various level

由圖4可知，傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵液的真菌菌落構(gòu)成中，德克酵母屬和接合酵母屬為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，且均屬于酵母菌綱。

圖4 真菌群落組成關(guān)系Figure 4 Microbial community composition of fungus

2.2 紅茶菌中優(yōu)勢(shì)菌的分離與鑒定

2.2.1 醋酸菌的篩選與鑒定 通過(guò)溴甲酚紫平板篩選試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、革蘭氏染色試驗(yàn)及菌落個(gè)體形態(tài)觀察，初步篩選出7株具有典型形態(tài)的菌株，其菌落特征和鏡檢形態(tài)觀察如圖5所示，特征描述見(jiàn)表3。

從左至右依次編號(hào)為1478，1480，1506，1508，1510，1512，1514圖5 各菌株的菌落及菌體形態(tài)Figure 5 Bacterial colonies and individual morphology of each strain

表3 醋酸菌的菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)的特征描述Table 3 The described of colony morphology and microscopic morphology of acetic acid bacteria

由圖6可知，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶均明亮單一，其片段長(zhǎng)度均為1 500 bp左右。將7株菌株的測(cè)序結(jié)果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 在線比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株1478與食糖駒形氏桿菌(Komagataeibactersaccharivorans)比對(duì)相似度為98%，菌株1480與腐爛蘋(píng)果醋酸桿菌(Acetobactermalorum)比對(duì)相似度為99%，菌株1506/1508/1512/1514與木駒形氏菌(Komagataeibacterxylinus)比對(duì)相似度均為100%，菌株1510與醋酸桿菌屬(Acetobacter)比對(duì)相似度為100%。結(jié)合醋酸菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)分析，參考細(xì)菌鑒定手冊(cè)，可以鑒定菌株1478為食糖駒形氏桿菌、1480為腐爛蘋(píng)果醋酸桿菌、1506/1508/1512/1514為木駒形氏菌醋酸菌、1510為醋酸桿菌屬。7株菌大致分為4個(gè)種2個(gè)屬，與高通量研究結(jié)果吻合，表明試驗(yàn)分離出的菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，其中1506/1508/1512/1514木駒形氏菌的產(chǎn)酸能力、產(chǎn)膜能力較強(qiáng)，1478食糖駒形氏桿菌的代謝糖能力強(qiáng)且能產(chǎn)生很多風(fēng)味物質(zhì)，1510醋酸桿菌經(jīng)常被用來(lái)釀造食醋[17-18]。

M為DNA Marker；1～8依次為菌株1478、1480、1506、1508、1510、1512和1514的擴(kuò)增產(chǎn)物圖6 PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 6 Electrophoresis of PCR products

2.2.2 酵母菌的篩選與鑒定 通過(guò)對(duì)紅茶菌發(fā)酵液中真菌的分離篩選，挑選出3株疑似酵母菌株，其菌落特征和鏡檢形態(tài)觀察如圖7所示，特征描述見(jiàn)表4。

從左至右依次編號(hào)為1482，1484，1486圖7 各菌株的菌落及菌體形態(tài)Figure 7 Bacterial colonies and individual morphology of each strain

表4 酵母菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)的特征描述Table 4 Cellular and colonial morphology of yeast

由圖8可知，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶均明亮單一，其片段長(zhǎng)度均為600 bp左右。將3株菌株的測(cè)序結(jié)果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 在線比對(duì)發(fā)現(xiàn)， 菌株1482、1484與拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)比對(duì)相似度均為100%，菌株1486與布魯塞爾德克酒香酵母(Dekkerabruxellensis)比對(duì)相似度為98%。結(jié)合酵母菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)分析，參考真菌鑒定手冊(cè)，可以鑒定篩選的目的酵母菌1482及1484為拜耳接合酵母、1486為布魯塞爾德克酒香酵母。分離出的3株菌大致分為接合酵母屬和德克酵母屬2個(gè)屬，與高通量研究結(jié)果相吻合，再一次證明了分離出的菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，其中菌株1482及1484為拜耳接合酵母，被應(yīng)用于各種發(fā)酵制品如酒類、醋類，其代謝能力強(qiáng)，菌株風(fēng)味好[19]；菌株1486釀酒酵母因代謝乙醇能力強(qiáng)，常被用作釀酒菌種[20]。

M為DNA Marker；1～3依次為菌株1482、1484和1486的擴(kuò)增產(chǎn)物圖8 PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 8 Electrophoresis of PCR products

2.2.3 乳酸菌的篩選與鑒定 從MRS及Elliker培養(yǎng)基中篩選能使溴甲酚紫—乳粉培養(yǎng)基變黃，革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫接觸酶陰性的菌株，初步篩選出一株菌落干燥，較小，圓形，邊緣整齊，低凸起，白色，鏡檢為短桿的菌株，其菌落特征和鏡檢形態(tài)觀察如圖9所示。

圖9 菌株1298的菌落、菌體形態(tài)圖Figure 9 Morphology of bacterial colonies and bacteria of strain 1298

由圖10可知，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶均明亮單一，其片段長(zhǎng)度均為1 500 bp左右。將菌株的測(cè)序結(jié)果上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 在線比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株1298與植物乳桿菌(Lactobacillus.plantarum)的同源性為99%。結(jié)合乳酸菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)分析，參考細(xì)菌鑒定手冊(cè)，可以鑒定篩選的目的乳酸菌1298為植物乳桿菌，與高通量研究結(jié)果相吻合，表明分離出的菌株為優(yōu)勢(shì)菌株。植物乳桿菌是紅茶菌發(fā)酵液常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌株，具有產(chǎn)乳酸、丁酸等特性[21-22]。

M為DNA Marker；1為菌株1298擴(kuò)增產(chǎn)物圖10 PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 10 Electrophoresis of PCR products

3 結(jié)論

采用16S rDNA和ITS高通量分析了紅茶菌發(fā)酵液中微生物組成。高通量測(cè)序結(jié)果表明：細(xì)菌群落豐富度與多樣性大于真菌。細(xì)菌中駒形氏桿菌(Komagataeibacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)和乳桿菌屬(Lactobacillus)為優(yōu)勢(shì)菌株；真菌中德克酵母屬(Dekkera)和接合酵母屬(Zygosacchaormyces)為優(yōu)勢(shì)菌株。通過(guò)傳統(tǒng)平板分離法得到醋酸菌7株，分別為食糖駒形氏桿菌1478(Komagataeibactersaccharivorans1478)、腐爛蘋(píng)果醋酸桿菌1480(Acetobactermalorum1480)、木駒形氏菌1506/1508/1512/1514(Komagataeibacterxylinus1506/1508/1512/1514)、醋酸桿菌屬1510(Acetobacter1510)；酵母菌3株，分別為拜耳接合酵母1482/1484 (Zygosaccharomycesbailii1482/1484)和布魯塞爾德克酒香酵母1486(Dekkerabruxellensis1486)；乳酸菌1株，為植物乳桿菌1298(Lactobacillus.plantarum1298)。后續(xù)需對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株性能進(jìn)行深入研究。