陰曉晴 李 瑞 裴 琪 盧子琦 趙銘欽

(河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州 450002)

美拉德反應是發(fā)生在羰基化合物和氨基化合物之間的復雜反應，最終產(chǎn)物包括吡嗪、呋喃、吡咯等香味物質(zhì)和大分子化合物類黑精[1-2]。美拉德反應廣泛存在于面包、肉類、酒類、飲料以及煙草的生產(chǎn)、加工、儲存等過程中[3-4]，賦予食品特殊的烤香、堅果香和焦糖香[5-7]，因此，美拉德反應產(chǎn)物被廣泛應用到食品加香中[8-10]?，F(xiàn)有研究側(cè)重于氨基酸的種類、還原糖的種類、反應溫度、反應時間和pH對美拉德反應香氣成分的影響[11-14]，而有關封閉或敞開體系對美拉德反應香氣成分的影響的研究較少。羅麗娜等[15-16]研究了丙氨酸和纈氨酸與還原糖在無氧密閉條件下的美拉德反應產(chǎn)物以及加香效果，結(jié)果表明雖然密閉條件阻礙了美拉德反應的進程，但仍產(chǎn)生較多的揮發(fā)性香味成分。

酪氨酸與葡萄糖在敞開體系下發(fā)生的美拉德反應產(chǎn)物呈顯著的焦甜香味[17-18]。目前，有關封閉或敞開體系下對酪氨酸美拉德反應產(chǎn)物香味成分的影響的研究較少。研究擬以酪氨酸/葡萄糖/木糖為反應體系，考察封閉或敞開環(huán)境對不同反應溶劑和不同反應溫度下的美拉德反應香氣成分種類和含量的影響，并探討封閉/敞開環(huán)境下活性氧和揮發(fā)性活潑中間體對美拉德反應進程和產(chǎn)物的影響，以期為食用香料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-酪氨酸(≥99.0%)、D(+)-木糖(≥99.0%)：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

D(+)-無水葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

氫氧化鈉：分析純，天津市大茂化學分析廠；

無水乙醇：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

甲醇：色譜純，河北四友卓越科技有限公司。

1.2 儀器設備

耐壓瓶：P160004DF型，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；

恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，河南省予華儀器有限公司；

電子天平：BS200S型，北京賽多利斯公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：N-1100D-WD型，日本東京理化；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：7890A/5975C型，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應產(chǎn)物制備 封閉體系下條件的設置參照文獻[19]，并稍作修改。將酪氨酸(906 mg, 5 mmol)、還原糖[木糖(1 501 mg, 10 mmol)或者葡萄糖(1 802 mg, 10 mmol)]和反應溶劑(30 mL水或者40%乙醇水溶液)依次加入到48 mL密閉的厚壁耐壓瓶中(敞開體系下，上述原料依次加入到48 mL的普通燒瓶中，其上安裝回流冷凝管和活塞，未嚴格密封[20])，用NaOH水溶液(6 mol/L)調(diào)節(jié)pH至7.5，在設定溫度條件下(80，100，120 ℃)反應4 h，反應結(jié)束后用冰水終止反應。過濾除去白色不溶物，在50 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干待用。

封閉體系和敞開體系條件下的試驗分別由1～12，1′～12′表示，其中1、2、3、1′、2′、3′為葡萄糖與酪氨酸在40%乙醇水溶液中分別于80,100,120 ℃下的反應；4、5、6、4′、5′、6′為葡萄糖與酪氨酸在水中分別于80，100，120 ℃ 下的反應；7、8、9、7′、8′、9′為木糖與酪氨酸在40%乙醇水溶液中分別于80,100,120 ℃下的反應；10、11、12、10′、11′、12′為木糖與酪氨酸在水中分別于80，100，120 ℃下的反應。其中，選擇40%乙醇水作為溶劑的原因為溶劑水分含量對Maillard反應速率有一定影響，加入乙醇使水活度降低，反應速率加快，生成物產(chǎn)率得到改善[12]。選擇NaOH而非磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH的原因為磷酸鹽緩沖溶液中的磷酸根離子對美拉德反應有催化作用[21]，進而影響美拉德反應產(chǎn)物，故根據(jù)文獻[22]用6 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)初始pH值。為了使敞開體系溫度達到120 ℃，在反應過程中采取了以下措施：① 增大反應燒瓶與油浴的接觸面積；② 在反應燒瓶上方加裝回流冷凝管，減少溶劑散失；③ 在反應瓶及油浴鍋上方加蓋一層鋁箔紙，減少熱量散失。

1.3.2 美拉德反應香味成分分析 根據(jù)文獻[23]修改如下：取0.1 g上述樣品溶于1 mL甲醇中，經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：HP-5MS熔融石英毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度300 ℃；進樣量1 μL；載氣為高純氦氣(純度99.999 9%)；流速1 mL/min；分流比20∶1；升溫程序為初始溫度40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 升到100 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的速率升溫到150 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的速率升溫到200 ℃，保持1 min；溶劑延遲3.5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，離子源溫度250 ℃，電離能量70 eV，傳輸線溫度200 ℃，質(zhì)譜掃描范圍30～400 amu。

1.3.3 美拉德反應產(chǎn)物的嗅香評價 參照文獻[24]。

1.3.4 顏色深度的測試方法 根據(jù)文獻[16]修改如下：取30 mg美拉德反應產(chǎn)物溶于5 mL蒸餾水中，以蒸餾水作參比液，在紫外分光光度計上分別測量280 nm和420 nm 處的吸光度，重復3次，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 定性分析采用氣質(zhì)工作站NIST14和Wiley譜圖檢索，以匹配度高于85%定性，并與文獻資料中圖譜解析結(jié)果進行比較。定量分析參照文獻[25]。采用Origin 8、Microsoft Excel 2020以及MATLAB軟件進行柱狀圖分析、顯著性分析(P<0.05)以及PCA主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 封閉/敞開條件對美拉德反應產(chǎn)物棕色化程度的影響

美拉德反應在280 nm處的紫外吸收(A280 nm)常用來指示美拉德反應的中間產(chǎn)物，而在420 nm處的可見吸收指示美拉德反應終期階段產(chǎn)物[26]。由圖1可知，葡萄糖/木糖與酪氨酸在封閉或敞開條件下均在A280 nm和A420 nm處表現(xiàn)較高的吸光度值，說明反應過程中均產(chǎn)生了活性中間體和棕色化產(chǎn)物；此外，除試驗5外，封閉條件下體系在280 nm處的吸光度值均大于或者等于敞開條件下體系相應的吸光度值，說明封閉體系更有利于無色中間產(chǎn)物和終期棕色化產(chǎn)物的積累，封閉與敞開條件最大的區(qū)別在于有無氧氣參與美拉德反應過程以及活性中間體的揮發(fā)性強弱，敞開條件下氧氣的參與以及揮發(fā)性活性中間體的揮發(fā)加速了反應過程中間產(chǎn)物的消耗，故敞開條件下280 nm處吸光度值較小。在280 nm處吸光度值較大的體系其在420 nm處的吸光度值也較大，說明美拉德反應過程中產(chǎn)生的大量無色中間產(chǎn)物為終期棕色化產(chǎn)物的前體物質(zhì)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 封閉/敞開條件對美拉德反應體系紫外可見光吸收的影響Figure 1 The effect of closed/open conditions on UV-vis absorbance of Maillard reaction products

2.2 封閉/敞開條件下美拉德反應香氣成分

將每個試驗的產(chǎn)物進行氣質(zhì)分析，并將產(chǎn)物按照官能團的差異分為醛類、酯類、酮類、醇類、呋喃類、吡喃類、芳香族類、酸類、其他類，分別計算各類產(chǎn)物的總含量。以上述9類產(chǎn)物含量為特征通過PCA來分析不同類別產(chǎn)物對封閉/敞開體系的貢獻率。由圖2可知，主成分1和主成分2的方差貢獻率分別為37.71%和33.85%，累計方差貢獻率達71.56%，說明主成分1和2包含了大部分試驗數(shù)據(jù)。主成分PC1單獨解釋了原始變量37.71%的信息，起主要作用的產(chǎn)物種類有：呋喃類、芳香族類，其次為酯類和吡喃類(見表1)；主成分PC2單獨解釋了原始變量33.85%的信息，起主要作用的是醇類，其次為酮類化合物(見表1)。此外，從PC1和PC2的得分散點圖可看出，封閉條件下的美拉德產(chǎn)物分布在PCA圖中的上半部分，而敞開條件下的美拉德反應產(chǎn)物主要分布在PCA圖中下半部分，且兩者之間存在較大距離，說明封閉與敞開條件對美拉德反應產(chǎn)物類型和含量有較大影響。

圓點表示封閉條件下葡萄糖/木糖與酪氨酸在水溶液中的反應產(chǎn)物，即試驗4,5,6,10,11,12；另外6個三角為敞開條件下葡萄糖/木糖與酪氨酸在水溶液中的反應產(chǎn)物，即試驗4′,5′,6′,10′,11′,12′圖2 對封閉/敞開條件下美拉德反應產(chǎn)物進行主成分分析的得分散點圖Figure 2 Plot of PCA analysis based on Maillard reactions under closed/open conditions

表1 對封閉/敞開條件下美拉德反應產(chǎn)物進行PCA分析的主成分貢獻度表Table 1 Contribution of principle componentsbased on Maillard reaction under closed/open conditions

封閉/敞開條件下葡萄糖與酪氨酸在不同反應溶劑和不同反應溫度下的美拉德反應產(chǎn)物主要有醇類、酮類、酯類、呋喃類、吡喃酮類化合物，其中乙酸異丙酯[27]呈水果香氣，稀釋后有蘋果香味；丙三醇[28]為常用食品添加劑，在食品工業(yè)中用作甜味劑、煙草劑的吸濕劑和溶劑?？啡27]有甜的類似面包的焦糖味，用于烤堅果香精?？反糩15]具有奶油焦糖香韻。呋喃酮[27]具有典型的焙烤焦糖香味；5-羥甲基糠醛具有甘橘花味，其含量與產(chǎn)物顏色具有相關性[29-30]。除了以上共同物質(zhì)外，封閉體系中產(chǎn)生的主要物質(zhì)還包括：丁酸丙酯、反式-1,2-環(huán)戊二醇、2-甲基-4,5-二氫-1H-咪唑、3,4-二羥基四氫呋喃等；敞開體系中產(chǎn)生的主要物質(zhì)還包括：丁酸甲酯、4,5-二甲基-1,3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮、環(huán)戊-4-烯-1,3-二醇等。這些結(jié)果說明封閉/敞開體系可在一定程度上影響反應路徑，最終影響產(chǎn)物種類及其含量。

由圖3(a)～圖3(c)可知，葡萄糖和酪氨酸在封閉條件下40%乙醇水溶液中反應時，酯類和酮類物質(zhì)含量在80，100 ℃條件下較高，而芳香族類和呋喃類化合物則在120 ℃條件下含量較高。這可能是因為較低溫度更有利于形成美拉德反應初級或者中級階段的反應產(chǎn)物，即還原酮裂解產(chǎn)生小分子醇醛酮，而在120 ℃高溫條件下可產(chǎn)生美拉德反應高級階段反應產(chǎn)物吡咯呋喃等雜環(huán)化合物。相同反應原料和溶劑的敞開體系中，呋喃類物質(zhì)含量在80，100 ℃下較高，而酮類物質(zhì)則在120 ℃下較高。在反應溫度為80，100 ℃時，封閉體系香氣成分總量>敞開體系香氣成分總量，且酯類、酮類、醇類的含量在封閉條件下較敞開條件下高，呋喃類、吡喃類和芳香族類含量在敞開條件下較封閉條件下高，說明加熱溫度較低時，敞開條件更有利于雜環(huán)物質(zhì)的產(chǎn)生；而在120 ℃時，敞開體系香氣成分含量>封閉體系成分含量，呋喃類、吡喃類、芳香族類的含量在封閉條件下較敞開體系下高，酯類、酮類、醛類含量在敞開條件下較封閉條件下高[圖3(c)]，原因可能是反應溫度較高時，封閉體系揮發(fā)性活性中間體損失較少，更有利于雜環(huán)化合物的生成。

由圖3(d)～圖3(f)可知，當水為反應溶劑時，葡萄糖/酪氨酸美拉德反應在封閉條件下醇類物質(zhì)含量較敞開條件下高，而酯類物質(zhì)含量較低，原因可能是在封閉體系且有大量水存在時美拉德反應過程中產(chǎn)生的醇類物質(zhì)與酸性物質(zhì)發(fā)生了可逆的酯化反應，酯類物質(zhì)水解進而使醇類物質(zhì)含量增加。此外，敞開條件下水溶液中吡喃類物質(zhì)含量較封閉條件下高，說明敞開體系中揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)可促進吡喃類前體物質(zhì)(比如還原酮)的產(chǎn)生和積累。

圖3 封閉/敞開條件下葡萄糖/酪氨酸美拉德反應產(chǎn)物對比Figure 3 Comparison of Maillard reaction products produced from glucose and tyrosine between closed and open conditions

由圖4可知，封閉/敞開條件下木糖與酪氨酸在不同反應溶劑和不同反應溫度下的美拉德反應產(chǎn)物主要有酮類、醇類、酯類、呋喃類、吡喃酮、芳香族類化合物，其中香味物質(zhì)有乙酸異丙酯(具有水果香氣)、正辛醛(具有甜橙香氣)、醋酸-2-辛酯(具有花香與清香的脂蠟香氣)、丁酸甲酯(具有甜的菠蘿香氣)以及甲基麥芽酚(具有焦香奶油香氣)。與葡萄糖為原料的美拉德反應產(chǎn)物相比，酮類、醇類以及芳香族類化合物的含量較高，且在香味成分總量上木糖>葡萄糖，這與文獻[31-32]中報道結(jié)果一致，可能是因為五碳糖的反應活性大于六碳糖。此外，以木糖為原料時，產(chǎn)物含量在不同條件的封閉/敞開體系中的差異與葡萄糖為原料時的變化趨勢基本一致，不同的是以木糖為原料時美拉德反應產(chǎn)物在3個反應溫度下香氣總量均為封閉>敞開，說明封閉條件更有利于木糖—酪氨酸美拉德反應的進行。

圖4 封閉/敞開條件下木糖/酪氨酸美拉德反應產(chǎn)物對比Figure 4 Comparison of Maillard reaction products produced from xylose and tyrosine between closed and open conditions

2.3 封閉/敞開條件下美拉德反應香氣類型

由表2可知，在封閉條件下產(chǎn)物顏色較敞開條件下深，說明封閉條件下棕色化反應進行的程度較高，與2.1中的結(jié)果一致。酪氨酸參與的美拉德反應產(chǎn)物的整體香味為焦甜香，但與敞開條件下的產(chǎn)物相比，封閉條件下的產(chǎn)物香味帶有明顯的甜味或者咖啡味(試驗6、11)，這可能與產(chǎn)物中含有較多的呋喃類和醇類物質(zhì)有關。除試驗6、6′、11、11′外，其余試驗條件下封閉/敞開體系香氣類型基本無差別。

表2 封閉與敞開條件美拉德反應產(chǎn)物香氣類型Table 2 Olfactory type of Maillard reaction products under closed and open conditions

2.4 封閉/敞開條件下主要香氣成分產(chǎn)生機理

封閉/敞開條件下以木糖/葡萄糖與酪氨酸為原料制備的美拉德反應產(chǎn)物中，甘油、甘油醛、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、甲基麥芽酚、糠醛、糠醇、5-羥甲基糠醛的含量較高，其產(chǎn)生機理如圖5所示。葡萄糖與酪氨酸縮合生成葡萄糖胺，經(jīng)Amadori重排生成Amadori化合物，再經(jīng)1,2-烯醇化和2,3-烯醇化生成還原酮或者脫氫還原酮。1,2-烯醇化和2,3-烯醇化反應過程與體系的pH有關，在堿性條件下，N原子上的電子流向葡萄糖上的C1原子，使得Amadori化合物更傾向于通過2,3-烯醇化降解生成1-氨基-1,4-脫氧-2,3-己二酮糖或者1-脫氧葡糖醛酮，后者經(jīng)2,5位環(huán)化最終生成呋喃酮，經(jīng)2,6位環(huán)化最終生成吡喃酮和甲基麥芽酚。而在酸性條件下，由于氨基質(zhì)子化，使得Amadori化合物更易通過1,2-烯醇化生成3-脫氧葡萄醛酮，再經(jīng)3,4位碳鍵斷裂生成丙酮醛和甘油醛，或者經(jīng)2,5位環(huán)化最終生成5-羥甲基糠醛[33-34]。一般情況下，隨著美拉德反應中有機酸的不斷積累，體系pH均逐漸降低[35]，反應后期體系更傾向于發(fā)生1,2-烯醇化。此外，研究[36]表明葡萄糖經(jīng)氧化脫二氧化碳可生成木糖和戊糖醇，木糖經(jīng)2,5位環(huán)化脫水最終生成糠醛，而戊糖醇經(jīng)3,6位環(huán)化最終生成糠醇。同時，葡萄糖可經(jīng)逆羥醛縮合反應生成羥乙醛和2,3,4-三羥基丁醛[37]，而后者可能發(fā)生氧化脫羧最終生成丙三醇。丙三醇可經(jīng)氧化生成1,3-二羥基丙酮[38]。對于木糖可發(fā)生類似的反應，生成以上美拉德反應產(chǎn)物。綜上，美拉德反應機理涉及氧化脫羧、環(huán)化脫水、小分子縮合、活性中間體碳鍵斷裂等一系列復雜過程，而封閉/敞開條件主要影響活性氧、活性中間體、揮發(fā)性小分子等物質(zhì)的含量，進而導致封閉/敞開條件下產(chǎn)物含量的差異。比如糠醇、糠醛、5-羥甲基糠醛的總含量為敞開>封閉，原因為這些物質(zhì)形成過程中均涉及氧化脫羧反應，而敞開條件更有利于氧氣的參與以及二氧化碳的釋放，故敞開體系中總含量較高；而2,3-二羥基丙醛和甲基麥芽酚的總含量為封閉>敞開，原因則可能為封閉條件下產(chǎn)生較多的活性中間體從而使得這類物質(zhì)含量較高。美拉德反應過程中產(chǎn)生的紫外吸收特性的活性中間體一般指還原糖與氨基酸通過親和加成形成的N-葡萄糖胺、重排后得到的Amadori化合物、Amadori化合物與第二個氨基酸或葡萄糖的加和產(chǎn)物、氨基酸經(jīng)Strecker降解產(chǎn)生的Strecker醛等，因為這些物質(zhì)是小分子二羰基化合物3-DG、丙酮醛、乙二醛的前體物質(zhì)，故它們的含量也可以反映小分子二羰基化合物的含量。這與2.1中描述的結(jié)論一致。

圖5 推測的主要香味物質(zhì)產(chǎn)生機理Figure 5 Proposed mechanisms of main flavoring products

3 結(jié)論

對封閉/敞開條件下酪氨酸與木糖/葡萄糖在不同反應條件下美拉德反應產(chǎn)物香氣成分進行的研究結(jié)果表明：醇類含量在封閉條件下更高，美拉德產(chǎn)物呈甜的焦糖香；而酯類、酮類含量在敞開條件下更高，總體美拉德反應產(chǎn)物呈焦甜香。該結(jié)果說明封閉/敞開條件對美拉德反應產(chǎn)物種類和含量均有較大影響。以往研究中揭示了氧氣對封閉/敞開體系美拉德產(chǎn)物的影響，該研究則表明除了氧氣，活性中間體以及揮發(fā)性小分子的產(chǎn)生和積累也是導致封閉/敞開條件香氣成分含量差異的原因。后續(xù)將研究封閉/敞開體系下特征香味成分的確定及在食品中的加香應用。