崔小飛，朱博，李康路，黃漢記,3，盧德杰，趙勁民△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，南寧 530021；2.廣西組織器官再生生物醫(yī)學(xué)材料工程中心，南寧 530021；3.廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

骨肉瘤（OS）是青少年惡性骨腫瘤中最常見的原發(fā)性腫瘤之一，其特點(diǎn)是侵襲性強(qiáng)、早期全身轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移是其主要的死亡原因[1-2]。目前臨床上對OS患者原發(fā)腫瘤的常用治療方法是化療、手術(shù)治療和放療。然而，手術(shù)切除往往不能完全切除腫瘤，甚至在上述治療后仍經(jīng)常發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致高死亡率[3]。目前對OS的早期診斷比較困難，主要原因是缺乏敏感和特異的診斷標(biāo)記物，無法在早期監(jiān)測疾病，進(jìn)行預(yù)后分析。因此，需要新的診斷生物標(biāo)志物和更好的治療靶點(diǎn)來提高OS轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療效果[4]。

microRNAs是一組新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼小RNAs（miRNAs），負(fù)向調(diào)節(jié)3’非翻譯區(qū)（UTR）的靶蛋白編碼miRNA的穩(wěn)定性和翻譯[5]。異常表達(dá)的miRNAs參與調(diào)控不同類型人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展，并與細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)[6]。由此可見，miRNAs被認(rèn)為是在癌癥診斷、預(yù)后和治療效果方面具有潛力的生物標(biāo)志物[7]。研究表明，miRNAs與OS的發(fā)生和疾病的臨床病程調(diào)控密切相關(guān)[8]。而差異表達(dá)miRNAs通過負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)水平，為OS的早期診斷、臨床精準(zhǔn)治療以及預(yù)后評估提供了新的靶點(diǎn)，其變化與OS的分化程度、腫瘤分期及肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。本研究旨在觀察miR-499a-5p在OS中的表達(dá)，并探討miR-499a-5p的生物學(xué)功能、具有生存意義的典型通路及其在OS中的靶mRNA，以期為OS的診斷和治療提供潛在的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

骨肉瘤細(xì)胞系（143B，MNNG）和成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）均購買于深圳市豪地華拓生物科技有限公司（深圳）。hFOB1.19專用培養(yǎng)基購自普諾賽生命科技有限公司（武漢）。胎牛血清購自天杭生物科技股份公司（杭州）。提取RNA的試劑盒購買于美基生物科技有限公司（廣州）。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara生物技術(shù)公司（日本東京）。DMEM/F-12培養(yǎng)基購買于美侖生物技術(shù)有限公司（大連）。2×SYBR Green qPCR Mix購買于愛博泰克生物科技有限公司（武漢）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用hFOB1.19專用培養(yǎng)基培養(yǎng)hFOB1.19細(xì)胞，采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞系。完全培養(yǎng)基由DMEM/F-12培養(yǎng)基加入1%青霉素（100 U/mL）、1%鏈霉素（100 U/mL）和10%胎牛血清配制。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中進(jìn)行培養(yǎng)。各隔3 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%～95%時(shí)按1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 miRNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至90%～95%，按照miRNA提取試劑盒的說明進(jìn)行miRNA的提取，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用2×SYBR Green qPCR Mix和miR-499a-5p引物進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。采用2-△△CT法計(jì)算miR-499a-5p相對表達(dá)量，用U6作為內(nèi)參。

1.2.3 miRNA靶基因的預(yù)測 為了探索可能影響OS發(fā)生和發(fā)展的miRNA調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)，本研究從3個(gè)數(shù)據(jù)庫miRDB（http://mirdb.org/）、DIANATOOLS（http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php? r=microTCDS/ index）、Target Scan（http://www.targetscan.org/vert-71/）中預(yù)測miR-499a-5p的下游靶基因集，將這3個(gè)miRNA靶基因數(shù)據(jù)進(jìn)行交集分析，以維恩圖的形式顯示。利用Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）在線工具構(gòu)建維恩圖。

1.2.4基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 進(jìn)一步使用R語言“clusterProfiler”包對miR-499a-5p的靶基因進(jìn)行富集分析。運(yùn)用“org.Hs.eg.d b”軟件包進(jìn)行注釋轉(zhuǎn)換，最后通過R軟件包“ggplot2”繪制氣泡圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）篩選樞紐基因 利用string數(shù)據(jù)庫，將miR-499a-5p的靶基因進(jìn)行構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。并利用得到的PPI網(wǎng)絡(luò)信息，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件并使用“cytoHubba”插件篩選出top3基因作為候選基因。

1.2.6生存分析 通過GEPIA（http://gepia.cancerpku.cn/index.html）在線網(wǎng)站對篩選出top3關(guān)鍵候選基因進(jìn)行生存分析，篩選生存預(yù)后顯著差異的靶基因。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪制柱狀圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 miR-499a-5p在OS細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與人成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）比較，miR-499a-5p在人OS細(xì)胞系（143B及MNNG）中的表達(dá)降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-499a-5p 在人成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）及人OS 細(xì)胞系（143B及MNNG）中的表達(dá)

2.2 miRNA-499a-5p 靶向基因的預(yù)測及富集分析結(jié)果

通過3種在線預(yù)測工具對miR-499a-5p靶向的基因進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測到586個(gè)基因，DIANATOOLS數(shù)據(jù)庫預(yù)測到971個(gè)基因，Target Scan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到421個(gè)基因。對其預(yù)測的基因進(jìn)行交集，發(fā)現(xiàn)3個(gè)預(yù)測工具同時(shí)預(yù)測到181個(gè)潛在的靶基因，見圖2。并進(jìn)行GO和KEGG富集分析處理，其中，GO分析結(jié)果如圖3所示，生物過程（BP）富集最顯著的是RNA聚合酶Ⅱ促子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控，其次是正調(diào)控轉(zhuǎn)錄；細(xì)胞組成（CC）富集最顯著的是細(xì)胞核，其次是細(xì)胞質(zhì)；分子功能（MF）富集最顯著的是蛋白結(jié)合，其次是DNA結(jié)合。另一方面，KEGG富集分析結(jié)果表明，最顯著的是人類T細(xì)胞白血病病毒1感染信號(hào)通路（HTLV-I infection），其次是軸突引導(dǎo)通路（axon guidance pathway）、催產(chǎn)素信號(hào)通路（oxytocin signaling pathway）和T細(xì)胞激活信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway），見圖4。

圖2 miR-499a-5p調(diào)控的靶基因的預(yù)測

圖3 GO功能富集分析

圖4 KEGG通路的富集分析

2.3 miR-499a-5p調(diào)控的PPI構(gòu)建

由miR-499a-5p調(diào)控的181個(gè)候選靶基因，使用string數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)信息得到PPI圖，見圖5A，并將蛋白互作信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖并篩選得到top3基因分別是異質(zhì)核糖核蛋白C（HNRNPC）、真核翻譯起始因子4γ2（EIF4G2）和真核翻譯起始因子4A同工型2（EIF4A2），其中基因HNRNPC有14個(gè)節(jié)點(diǎn)，基因EIF4G2有8個(gè)節(jié)點(diǎn)，基因EIF4A2有7個(gè)節(jié)點(diǎn)，見圖5B。

圖5 miR-499a-5p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中靶基因的篩選

2.4 生存分析

通過GEPIA在線數(shù)據(jù)集對HNRNPC、EIF4G2和EIF4A2進(jìn)行生存分析。HNRNPC、EIF4G2和EIF4A2的生存分析結(jié)果顯示其P值分別為0.01、0.61和0.38。其中只有HNRNPC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即OS標(biāo)本中HNRNPC基因高表達(dá)組較低表達(dá)組預(yù)后較差（P＜0.05），見圖6。

圖6 Top3關(guān)鍵基因的生存分析曲線圖

2.5 構(gòu)建miR-499a-5p 調(diào)控HNRNPC 進(jìn)而影響OS進(jìn)展的模式圖

通過前述的分析，推測低表達(dá)的miR-499a-5p可能通過調(diào)控HNRNPC的高表達(dá)，最終加快OS的增殖和轉(zhuǎn)移，見圖7。

圖7 miR-499a-5p調(diào)控HNRNPC進(jìn)而影響OS進(jìn)展的模式圖

3 討論

OS常見于青少年，但可以在任何年齡發(fā)展。診斷年齡是OS的一個(gè)預(yù)測因素，但其分子基礎(chǔ)仍不得而知[9]。越來越多基于公共數(shù)據(jù)庫的研究，如GEO和TARGET數(shù)據(jù)庫，被運(yùn)用于探求新的OS生物標(biāo)志物[9-10]。在基因表達(dá)調(diào)控過程中，miRNAs有著重要作用，結(jié)合靶mRNA后會(huì)致使后者的裂解或抑制后者的翻譯機(jī)制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平下降[7]。多種信號(hào)通路，包括細(xì)胞凋亡均被miRNAs調(diào)節(jié)[11]。先前的研究已經(jīng)揭示了miR-499a-5p在許多癌癥中的作用，包括乳腺癌[12-13]、肺癌[14]、肝癌[15]、結(jié)直腸癌[16]和黑素瘤[17]以及在心肌梗死的抗細(xì)胞凋亡作用[18]和線粒體裂變等作用[19]。然而，關(guān)于miR-499a-5p與OS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)報(bào)道很少。本研究結(jié)果表明，與普通成骨細(xì)胞比較，miR-499a-5p在OS細(xì)胞143B、MNNG中表達(dá)顯著降低。此外，本研究通過3種miRNA靶基因預(yù)測軟件獲得181個(gè)miR-499a-5p下游靶向基因，利用string數(shù)據(jù)庫和Cytoscape3.8.2軟件結(jié)合分析找到了HNRNPC、EIF4G2和EIF4A2 3個(gè)最為關(guān)鍵的基因。KEGG富集分析揭示其靶基因主要富集于人類T細(xì)胞白血病病毒1感染信號(hào)通路、軸突引導(dǎo)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路和T細(xì)胞激活信號(hào)通路。已有相關(guān)文獻(xiàn)指出，人類T細(xì)胞白血病病毒1感染信號(hào)通路具有干擾細(xì)胞增殖和T細(xì)胞轉(zhuǎn)化[20]，并促進(jìn)神經(jīng)酰胺和Fas配體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[21]，形成宿主對抗癌癥發(fā)展的障礙[22]；軸突引導(dǎo)通路上有豐富的OS驅(qū)動(dòng)基因[23]，并在OS轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[24]；催產(chǎn)素信號(hào)通路可調(diào)節(jié)新皮質(zhì)的生長，影響抗炎、抗氧化的進(jìn)程[25]；T細(xì)胞激活信號(hào)通路在多種生物學(xué)進(jìn)程中都有參與，經(jīng)常在人類癌癥中異常激活[26- 27]。越來越多的證據(jù)顯示，KEGG主要富集的這4種信號(hào)通路在骨組織中經(jīng)常被過度激活[28]，參與了腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程[29-30]。為了進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵預(yù)后基因，本研究通過GEPIA在線數(shù)據(jù)集對關(guān)鍵基因HNRNPC、EIF4G2和EIF4A2進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示僅有HNRNPC具有顯著意義的差異基因，HNRNPC過表達(dá)組預(yù)后不良的發(fā)生率明顯高于HNRNPC低表達(dá)組，最終篩選出HNRNPC作為miR-499a-5p在OS中具有影響預(yù)后意義的關(guān)鍵基因。HNRNPC屬于目前已知的一種RNA連合蛋白，在RNA剪接、穩(wěn)定和表達(dá)方面起著重要的作用[31-32]。這一參與可變剪接的基因與腫瘤的進(jìn)展、治療抗性有著密切的關(guān)系，且在腫瘤甲基化方面的研究已有報(bào)道[33]，可增強(qiáng)多種類型腫瘤的惡性程度，包括乳腺癌[34]、前列腺癌[35]和結(jié)腸癌[32]。除此之外，經(jīng)過生物信息學(xué)方法證明，HNRNPC基因的表達(dá)與患有多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、口腔鱗狀上皮癌的患者預(yù)后情況呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[33-36]。因此，HNRNPC被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)基因，很可能在OS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-499a-5p在OS細(xì)胞系中的表達(dá)低于成骨細(xì)胞系，通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-499a-5p下游調(diào)控靶基因以及靶基因的生存分析獲得關(guān)鍵預(yù)后基因?yàn)镠NRNPC，由于HNRNPC在OS中與生存預(yù)后相關(guān)，因此我們推測miR-499a-5p很可能通過調(diào)控HNRNPC的表達(dá)，從而影響OS的發(fā)生發(fā)展。