黃艷萍，郭殊瑋，劉 微，廖萬忠，蔣偉哲，付書婕

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

復(fù)方夏枯草顆粒的處方來源于廣西壯要方醫(yī)院，由夏枯草、連翹、槐花、甘草四味藥組成，具有清肝明目、軟堅(jiān)散結(jié)、活血消癭之功效，多年的臨床應(yīng)用顯示該方劑對(duì)各類亞急性、慢性甲狀腺炎、淋巴結(jié)節(jié)、乳腺增生、痔瘡腫痛等具有良好療效。為方便患者服用，促進(jìn)中藥方劑的臨床應(yīng)用，擬將原方湯劑開發(fā)為復(fù)方顆粒劑，在早期研究對(duì)人甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞抑制作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，并依照顆粒劑的制劑工藝要求進(jìn)行成型工藝研究，以期為該傳統(tǒng)方劑進(jìn)一步的藥效及作用機(jī)制研究提供質(zhì)量穩(wěn)定的顆粒劑。

1 儀器與材料

1.1 儀器

酶標(biāo)儀（美國Biotek Synergy H1）；超凈工作臺(tái)（ESCO OptiMair）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo）；倒置熒光顯微鏡（Leica DMi8）；Agilent 1260 Infinity液相色譜儀和G1314F紫外檢測器；十萬分之一分析天平（Mettler-Toledo XS205DU）；超聲波清洗儀（上海冠特SG3300HPT）。

1.2 藥材、細(xì)胞與試劑

夏枯草（批號(hào)：200401）、連翹（批號(hào)：190901）、槐花（批號(hào)：200501）、甘草（批號(hào)：200301）均購于廣西藍(lán)正藥業(yè)；迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-202007，含量以98.1%計(jì)）；連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201816，含量以95.1%計(jì)）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gemini，批號(hào)：A15H74K）；CCK-8試劑盒（尚寶生物，批號(hào)：202104）；PBS、胰蛋白酶、青鏈霉素混合液均為Solarbio。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方夏枯草顆粒處方提取物對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP的抑制作用

2.1.1供試品溶液的配制 稱取處方比例藥材，分別用0%、20%、35%、50%、65%、80%乙醇回流提取2次，每次加12倍量溶媒回流1 h；合并兩次提取液，65℃減壓濃縮至一定稠度后，轉(zhuǎn)移放入烘箱，60℃干燥至干膏。刮取干膏，充分研磨成粉后密封儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)濃度的乙醇提取重復(fù)3次。

精密稱取各干膏粉約0.2 g，加入10 mL PBS，超聲30 min使充分溶解，過濾，吸取5 mL轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶內(nèi)，PBS定容，混勻。細(xì)胞給藥前用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，用完全培養(yǎng)基稀釋至1 mg/mL。

2.1.2細(xì)胞抑制率檢測 取處于對(duì)數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的B-CPAP細(xì)胞[1-2]，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/mL（通過細(xì)胞個(gè)數(shù)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)得出的最適細(xì)胞濃度），以100μL孔接種于96孔板中（為避免邊緣效應(yīng)，最外一圈不接種細(xì)胞，每孔加100μL PBS），置于37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加藥；每組設(shè)6個(gè)副孔，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加100μL已配制好的含藥培養(yǎng)基（1 mg/mL），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后取出，倒置顯微鏡下觀察后，吸棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8的無血清培養(yǎng)基100μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h后于酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測OD值。按下列公式計(jì)算抑制率：細(xì)胞生長抑制率=（對(duì)照組OD平均值-實(shí)驗(yàn)組OD平均值）/（對(duì)照組OD平均值-空白組OD平均值）×100%。通過抑制率大小來確定最佳醇提濃度，見表1、圖1。

由表1和圖1可知，不同濃度的處方醇提物分別處理B-CPAP細(xì)胞24 h和48 h后，35%和50%醇提物對(duì)細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，作用24 h時(shí)，抑制率分別為85.9%、86.05%；作用48 h時(shí)，抑制率分別為93.98%、93.32%。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可認(rèn)為在作用時(shí)間為24 h、48 h時(shí)，35%和50%醇提物對(duì)B-CPAP細(xì)胞的抑制作用相同。

圖1 不同濃度乙醇提取物對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞B-CPAP增殖的影響

表1 不同乙醇濃度提取物對(duì)人甲狀腺癌細(xì)胞增殖的抑制率 n=6

2.2 復(fù)方夏枯草顆粒處方提取物中指標(biāo)性成分的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～25 min，20%A→35%A；25～35 min，35%A→20%A；35～40 min，20%A）[3-4]，流速1.0 mL/min，檢測波長：278 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：5μL。

2.2.2溶液制備（1）混合對(duì)照品溶液制備：精密稱定迷迭香酸和連翹苷適量，分別置于兩個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成含迷迭香酸1.28 mg/mL含連翹苷1.60 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。再分別精密吸取上述兩種單標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成含迷迭香酸0.64 mg/mL、含連翹苷0.80 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液制備：精密稱定各提取物粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL的50%甲醇，稱定重量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱重，50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22μm濾膜，即得。（3）陰性樣品溶液制備：精密稱取缺夏枯草和連翹的陰性樣品1 g，制備方法同供試品溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按照“2.2.1項(xiàng)”下的色譜條件進(jìn)樣測定混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，色譜圖見圖2。結(jié)果顯示：迷迭香酸和連翹苷的保留時(shí)間分別約為16.5 min和19.1 min，陰性樣品無干擾，迷迭香酸和連翹苷與相鄰雜質(zhì)峰分離良好，理論塔板數(shù)按連翹苷峰計(jì)不低于3 000，按迷迭香酸峰計(jì)不低于6 000，均符合規(guī)定。

圖2 對(duì)照品和提取物供試品HPLC圖

2.2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2項(xiàng)”下的混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋成迷迭香酸（0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL、0.24 mg/mL、0.32 mg/mL、0.64 mg/mL）和連翹苷（0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL）的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.2.1項(xiàng)”下的色譜條件進(jìn)樣測定。以對(duì)照品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，迷迭香酸在0.04～0.64 mg/mL，連翹苷在0.05～0.80 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表2 回歸方程與線性范圍

2.2.5不同乙醇濃度提取物中指標(biāo)性成分的含量測定 按照“2.2.2項(xiàng)”下方法將“2.1.1項(xiàng)”下不同濃度乙醇提取的干膏粉制成供試品溶液，每組平行制備3份，以迷迭香酸和連翹苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，為最佳乙醇提取濃度的選擇提供參考，見表3。

由表3可知，50%醇提物中的迷迭香酸轉(zhuǎn)移率最高，其次是35%醇提物；連翹苷在高濃度醇提物中的轉(zhuǎn)移率更高，在35%和50%醇提物中的轉(zhuǎn)移率較低，但也達(dá)到了80%以上，這與對(duì)B-CPAP細(xì)胞的抑制率趨勢(shì)并不一致，說明在對(duì)甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞的抑制作用中，連翹苷并不是處方中最重要的有效成分，其可能與其它成分共同發(fā)揮抑癌作用。

表3 不同乙醇濃度提取物中迷迭香酸和連翹苷的轉(zhuǎn)移率

2.3 最佳乙醇提取濃度確定

由細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可知，35%和50%醇提物對(duì)B-CPAP細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，且二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過指標(biāo)性成分的含量測定發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸在50%和35%醇提物中的轉(zhuǎn)移率較高，而連翹苷的轉(zhuǎn)移率與對(duì)B-CPAP細(xì)胞的抑制率沒有顯著一致性。主要基于對(duì)細(xì)胞的抑制作用選擇，以及盡量減少提取溶劑中乙醇的含量，綜合考慮，選取35%乙醇作為復(fù)方夏枯草顆粒處方的最佳提取溶劑。

2.4 不同給藥濃度的35%醇提物對(duì)人甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖的抑制作用

精密稱取35%醇提物粉末20 mg，加入2 mL PBS，超聲溶解，過0.45μm微孔濾膜，備用；細(xì)胞給藥前用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，用完全培養(yǎng)基稀釋至1 mg/mL的母液，其它給藥濃度用此母液做梯度稀釋，補(bǔ)充溶劑為用PBS和完全培養(yǎng)基按1∶9稀釋的溶液。

由表4可知，隨著藥物濃度增大、作用時(shí)間延長，抑制作用越大，說明35%醇提物對(duì)人甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞有時(shí)間和濃度依賴性，表現(xiàn)出明顯的量—效和時(shí)—效關(guān)系，24 h、48 h的IC50分別為0.69 mg/mL、0.56 mg/mL。

表4 不同濃度35%醇提物對(duì)人甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞不同作用時(shí)間的OD值及抑制率 n=6

2.5 提取工藝研究

2.5.1浸泡條件考察 浸泡使藥材充分濕潤、膨脹，使其有效成分易于溶出，并可避免蛋白質(zhì)凝固及淀粉糊化。通過測定藥材吸水率，確定加水量及浸泡時(shí)間。吸水率=（藥材濕重-藥材干重）/藥材干重×100%。如圖3所示，0～30 min藥材吸水率增加最快，30 min時(shí)為168.2%，30 min后吸水趨勢(shì)減緩，60 min時(shí)為205.1%，即吸水量為藥材的2.05倍。為節(jié)約時(shí)間，增加效率，選擇浸泡30 min，加水量浸過藥材2 cm左右為宜，約為12倍量水。

圖3 藥材吸水率與浸泡時(shí)間關(guān)系

2.5.2提取工藝研究以35%乙醇為提取溶劑，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素。按處方比例稱取藥材，按正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算平均值[5-6]。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸轉(zhuǎn)移率和對(duì)細(xì)胞的增殖抑制趨勢(shì)較為一致，所以以迷迭香酸含量和綜合評(píng)分（綜合評(píng)分=迷香酸含量×0.4+連翹苷含量×0.4+干膏率×0.2）為分析指標(biāo)，選擇最佳提取條件，見表5、表6。

表5 正交試驗(yàn)因素水平

表6 正交試驗(yàn)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

極差可以反映各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度，由表7對(duì)各因素3個(gè)水平均值的極差分析可知，迷迭香酸組中，3個(gè)因素的影響程度為B＞A＞C，其中B因素中水平2的均值（B2）最高，A因素中A2最高；綜合評(píng)分組中，3個(gè)因素的影響程度為C＞B＞A，C因素中C3最高，各因素優(yōu)選兩個(gè)指標(biāo)中的極差較大者，則最佳提取條件為A2B2C3，即加入12倍量35%乙醇，提取3次，每次60 min。

表7 迷迭香酸含量和綜合評(píng)分的極差分析

2.6 最佳提取工藝驗(yàn)證

為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，保證工藝的穩(wěn)定可行，稱取處方量藥材按照選定的最佳工藝重復(fù)3次試驗(yàn)。根據(jù)3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，表明該工藝穩(wěn)定可行，見表8。

表8 工藝驗(yàn)證結(jié)果

2.7 成型工藝研究

本方的處方量藥材約為35 g，提取率約為20%，則每次干膏粉服用量為7 g，一般口服顆粒劑劑量為10～15 g/包，則輔料加入量控制在3～8 g（藥輔比1∶0.4～1∶1.1）為宜。

采用濕法制粒，制劑工藝步驟：中藥提取物（干膏粉）+適當(dāng)輔料→制軟材→制顆?！稍铩?。通過考察顆粒成型率、流動(dòng)性、吸濕性、溶化性等指標(biāo)對(duì)輔料進(jìn)行篩選。

2.7.1干膏粉的制備 按處方比例稱取藥材，根據(jù)優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行提取、濃縮、干燥，烘干成干膏后粉碎備用（易吸濕，干燥柜內(nèi)儲(chǔ)存）。

2.7.2輔料的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇潤濕劑（乙醇）的濃度分別為60%、70%、80%、90%，發(fā)現(xiàn)由于干膏粉含糖量較高，且易吸濕，黏性強(qiáng)，在用60%、70%、80%乙醇時(shí)，若用量少則較松散，加大用量則明顯變黏，制粒時(shí)易堵塞篩孔；90%乙醇制得的軟材較合適制粒，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度為90%。

取“2.7.1項(xiàng)”下干膏粉約20 g，分別與糊精、可溶性淀粉兩種常用輔料按照不同配比混勻，以90%乙醇作潤濕劑制備軟材，軟材的軟硬度標(biāo)準(zhǔn)為“手握成團(tuán)，輕壓即散”，篩選結(jié)果見表9。

表9 輔料種類及配比篩選結(jié)果

2.7.3成型工藝考察評(píng)價(jià)指標(biāo) 為優(yōu)選復(fù)方夏枯草顆粒的最佳輔料及其配比，實(shí)驗(yàn)在各組軟材質(zhì)量的基礎(chǔ)上，優(yōu)選第2、3、4號(hào)組軟材制粒，以成型率、流動(dòng)性、吸濕性、溶化性為指標(biāo)，考察最佳成型工藝，結(jié)果見表10。

表10 成型工藝指標(biāo)評(píng)價(jià)表

根據(jù)制得的軟材情況并結(jié)合表11的顆粒劑考察指標(biāo)可知，單用糊精、復(fù)合輔料淀粉∶糊精（1∶1）和（1∶2）時(shí)制得的軟材較易制備顆粒，通過比較3組顆粒的成型率、流動(dòng)性、吸濕性和溶化性，發(fā)現(xiàn)4號(hào)組的成型率及流動(dòng)性最好，3號(hào)組的吸濕性最大，各組都能在5 min內(nèi)全部溶化，且4號(hào)組所用的輔料量最少，藥輔比（1∶0.8）在1∶0.4～1∶1.1的合理范圍內(nèi)，綜合考慮最佳輔料選擇淀粉∶糊精（1∶2），乙醇濃度為90%。

2.8 放大驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最佳提取工藝和成型工藝，制備3批復(fù)方夏枯草顆粒，按處方比例稱取各味藥材共約1 200 g，浸泡、提取、濃縮、干燥、粉碎后得浸膏粉，與適量輔料淀粉∶糊精（1∶2）混勻，噴以90%乙醇制軟材，濕法制粒，過16目篩整粒，60°C干燥至恒重。

由表11可知，3批藥材的平均出膏率為21.24%，制得的平均顆粒劑量為532.81 g，損失較小，顆粒收率較高，可進(jìn)一步進(jìn)行中試生產(chǎn)。

表11 3批顆粒劑的制備

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基于體外藥效研究，發(fā)現(xiàn)35%和50%醇提物對(duì)人甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)；并通過HPLC法測定處方不同乙醇濃度提取物中指標(biāo)性成分的含量，發(fā)現(xiàn)50%和35%醇提物中迷迭香酸的轉(zhuǎn)移率較高，而連翹苷的轉(zhuǎn)移率與細(xì)胞抑制率趨勢(shì)無顯著關(guān)系，綜合分析，確定最佳提取溶媒為35%乙醇。傳統(tǒng)煎煮法為水提，不利于有效成分最大限度的溶出，本實(shí)驗(yàn)基于對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的抑制作用，篩選出活性最強(qiáng)的提取物，以優(yōu)化處方的提取工藝，增強(qiáng)處方的治療作用。

處方中的君藥夏枯草散結(jié)消腫、疏肝解郁，其主要成分迷迭香酸可抑制多種人源腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]，與本實(shí)驗(yàn)前部分的研究結(jié)果相契合，提取物中迷迭香酸的含量越高，對(duì)細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。連翹具升浮宣散之力，清熱解毒，軟堅(jiān)散結(jié)，其專屬性成分連翹苷、連翹酯苷具有顯著的生物學(xué)活性，各成分之間發(fā)揮協(xié)同作用而用于不同疾病的治療[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處方中連翹苷的含量與其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制沒有明顯的濃度依賴性，連翹苷是否是處方中抗甲狀腺癌的活性成分，還有待繼續(xù)研究。

本實(shí)驗(yàn)采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)的方法，將體外活性研究與指標(biāo)性成分的含量測定綜合考察，優(yōu)化中藥提取工藝以提高藥物療效，有利于篩選出中藥復(fù)雜成分中的重要活性成分。將原方湯劑改進(jìn)為方便攜帶服用的顆粒劑，在保證原有功效的基礎(chǔ)上，優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取條件為加入12倍量35%乙醇，回流提取3次，每次60 min，煎煮前浸泡30 min；最佳成型工藝為輔料淀粉和糊精（1∶2），藥輔比約1∶0.8，90%乙醇為潤濕劑，所制得的顆粒符合顆粒劑的各項(xiàng)檢查標(biāo)準(zhǔn)。