劉芳芳 燕 平 王 平 張 耀 武麗萍 李 娟 張 贊 郭曉峰 陶功定 李俊蓮*

1.山西中醫(yī)藥大學，山西 太原 030619；2.山西省中醫(yī)院，山西 太原 030001

隨著人們生活方式的改變，肥胖成為了全球日益嚴重的問題。根據WHO統計2015年全球成人已有23億達到超重，7億人口達到了肥胖標準[1]。中醫(yī)學認為肥胖形成的原因主要與過食肥甘厚味，內傷脾胃，濕從內生有關?！端貑枴て娌≌摗吩?“必數食甘美而肥也?！薄端貑枴ねㄔu虛實論》指出：“肥貴人，則膏粱之疾也。”單純性肥胖癥是現代社會中最常見的營養(yǎng)障礙性疾病，對于單純性肥胖的中醫(yī)證型可分為脾虛濕阻型、肝郁氣滯型、陰虛內熱型等多種[2]。目前臨床最為常見的是脾虛濕阻型單純性肥胖。本研究采用高脂飼料造成大鼠單純性肥胖模型，通過觀察記錄單純性肥胖大鼠一般情況、血清血脂、免疫指數的變化,探討脾虛型單純性肥胖模型大鼠體質量、宏觀癥候、血清生化指標、免疫指數等的影響。為建立脾虛濕阻型單純性肥胖模型提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物 種類：雄性Spargue-Dawley(SD),成年健康大鼠40只,SPF級,體質量(200±20)g。來源：中國維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.2 實驗儀器 流式細胞儀，美國BD公司。血生化分析儀BECKMAN COULTER AU5800；電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；低速離心機：鹽城市安信實驗儀器有限公司。

1.3 藥物及試劑 含60% kcal%脂肪的高脂飼料。蛋白質：26.2 gm%；20 kcal%碳水化合物：26.3 gm%；脂肪：34.9 gm%。 40 kcal%型號：D12492蛋白質，購于中國維通利華實驗動物技術有限公司。高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒 (蘇食藥監(jiān)械生產許2001-0367)；低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(蘇食藥監(jiān)械生產許2001-0367)；甘油三酯測定試劑盒(GPO-POD法)(蘇食藥監(jiān)械生產許2001-0367)；總膽固醇測定試劑盒(酶法)(蘇食藥監(jiān)械生產許2001-0367)；FITC偶聯抗大鼠的抗原CD3+抗體購于比歐聯科供應鏈管理(北京)有限公司，貨號:8051814；APC偶聯抗大鼠的抗原CD4+抗體購于比歐聯科供應鏈管理(北京)有限公司，貨號:8108554；PE偶聯抗大鼠的抗原CD8+抗體購于比歐聯科供應鏈管理(北京)有限公司，貨號:8116845。

2 實驗方法

2.1 實驗動物模型的制作 單純性肥胖模型制作文獻[3]，雄性SD大鼠40只,重量為(200±20)g,4～6周齡，每籠5只。適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組10只(普通飼料喂養(yǎng))與單純性肥胖模型組30只(高脂飼料喂養(yǎng))。高脂飼料喂養(yǎng)8周后，大鼠體重超過普通飼料喂養(yǎng)大鼠體重 20%作為實驗性營養(yǎng)肥胖大鼠，設為單純性肥胖大鼠組。

2.2 觀察項目 于造模前、后每日上午9：00定時稱量大鼠的體質量、進食量、飲水量,并記錄。每日觀察記錄每組大鼠的精神狀況、活動情況、毛色光澤度、皮膚黏膜及排泄物性狀,對宏觀癥候評定計分。

將鑒定為造模成功的大鼠腹主動脈取血，裝入離心管中，離心機離心，取上清液，倒入尖管內。血清、血脂四項生化分析。取脾組織，脾組織流式細胞檢測。

2.3 兩組大鼠免疫指標(脾細胞CD3+、CD4+、CD8+含量) 操作步驟：①取兩組大鼠脾臟，每組大鼠脾臟分別放置在5 mL無菌小燒杯中，先用無菌的玻璃注射器內塞輕輕研磨脾組織，研磨至脾組織成糊狀，加入適量無菌PBS液后，用無菌吸管反復進行吹打至均勻，使用漏斗將脾細胞混懸液在200目篩網中過濾后，進入10 mL無菌離心管中，將離心管平衡放入離心機中以1000 r/min，離心5 min；②倒掉上清液，分別加入CD3+、CD4+、CD8+抗體各10 μL混合液，4 ℃避光孵育20 min，行表面染色； ③配制工作液Ⅰ(洗滌液)：20次test[5X Perm/wash Buffer∶雙蒸水=1∶4]使用前先搖晃原液；④在兩組大鼠脾細胞1 mL混懸液中，分別加入2 mL工作液Ⅰ，1000 r/min,離心5 min；⑤配制工作液Ⅱ(破膜劑)：20次test[4X Fix/perm∶TF Diluent Buffer=1∶3]使用前請搖晃原液；⑥倒掉上清液，觀察細胞裂解程度，如有離心管內有絮狀物，則分別加入1 mL工作液Ⅱ混勻，4 ℃下避光孵育5 min；⑦分別加洗滌液1 mL，搖勻，1000 r/min，離心5 min，重復1次；⑧分別加入2 mL PBS洗滌液，震蕩混勻，1000 r/min，離心5 min,重復1次。加入200 ulPBS洗滌液;⑨分別加入2 mL流式染色緩沖液重懸細胞。將兩組細胞上流式細胞儀進行檢測，CELLQuest下獲取信號并分析。

3 結果

3.1 實驗大鼠實驗前體質量的比較 本實驗大鼠隨機分為對照組10只、單純性肥胖模型組30只,兩組間動物實驗前(適應性飼養(yǎng)7 d后)體質量的比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 實驗前各組大鼠體質量的比較

3.2 實驗大鼠體質量的變化 造模前,兩組間實驗大鼠體質量的比較差異無統計學意義(P>0.05), 單純性肥胖模型造模2周后單純性肥胖模型組大鼠體質量(351.77±20.56)較對照組(396.49±23.96)顯著升高(P<0.01)。單純性肥胖模型造模7周后單純性肥胖模型組大鼠體質量(539.22±40.15)較對照組(593.11±55.52)顯著升高(P<0.01)。單純性肥胖模型造模8周后單純性肥胖模型組大鼠體質量(606.85±54.06)較對照組(538.39±37.67)顯著升高(P<0.01)。見表2。

表2 造模期間2、4、6、7、8周兩組大鼠體質量的變化

3.3 大鼠宏觀證候表現 實驗前,各組大鼠精神狀態(tài)良好、活潑好動、皮毛光澤度好、皮膚黏膜紅潤、球形糞便干稀適中，逃避、反抗、咬人正常。

單純性肥胖模型組大鼠造模2周后個別大鼠出現抹嘴，瘙癢。3周后出現飲水量減少，鼠尾脫皮掉毛，多數大鼠出現抹嘴，瘙癢。4周后個別抹嘴，坐姿有變化，挺肚子坐；個別鼠尾脫皮；逐漸出現糞便軟、不成形,個別大鼠糞便甚至稀溏。在造模過程中，大鼠逐漸出現精神萎靡不振,扎堆,嗜睡,反應遲鈍,行動遲緩,毛色枯槁, 抓取時叫聲比較溫柔，情緒平穩(wěn)，尾皮鱗屑狀脫落，舌淡胖。逃避、反抗表現不靈敏，行動較遲緩。

3.4 實驗大鼠血清血脂四項生化分析 脾虛濕阻型單純性肥胖模型組大鼠血清血脂四項生化分析較對照組無顯著變化(P>0.05)。見表3。

表3 造模期間各組大鼠血清血脂四項生化分析

3.5 實驗大鼠脾組織流式細胞術分析 單純性肥胖模型組大鼠脾組織流式細胞術分析，所有淋巴細胞中CD3+、CD4+所占比率(20.79±1.96)較對照組(31.66±0.83)顯著降低(P<0.01)。所有淋巴細胞中CD3+、CD8+所占比率(31.27±1.65)較對照組(27.00±1.72)顯著升高(P<0.01)。見表4、如圖1所示。

表4 兩組大鼠CD3+、CD4+、CD8+T細胞表達情況

4 討論

本課題通過建立與人類高脂飲食結構相類似、肥胖相關指標明確的營養(yǎng)性肥胖大鼠模型，以傳統中醫(yī)基礎理論為依據，符合單純性肥胖病脾失健運，痰濕內停的病機。脾為后天之本，其氣主升，喜燥惡濕，脾主運化，主肌肉四肢，為氣血生化之源，是生命的動力源頭。當脾臟功能正常時，可以將機體攝入的飲食水谷轉化為精微物質，將其吸收并傳輸布散到全身，以維持人體正常的生理活動。脂肪的攝入過量，導致脾失健運，脾受濕困故出現大鼠進食量減少，體重減輕，喜蜷臥扎堆。脾氣虛弱，“升清”功能減弱，不能將水谷精微物質上輸于肺及頭目，則表現為精神萎靡，倦怠嗜臥。

中醫(yī)學認為機體各功能的正常運行及人體的適應能力、防御能力和康復能力主要有賴于人體正氣的旺盛。中醫(yī)經典著作《黃帝內經·素問·刺法論》曰：“正氣存內，邪不可干?！奔凑龤獬涫?，機體足以抵抗邪氣，不易發(fā)生疾??；反之“邪之所湊，其氣必虛”，當正氣不足，邪氣趁虛而入，往往會引起機體陰陽失調，從而產生疾病。當機體免疫功能下降時，會出現亞健康狀態(tài)，如濕邪停滯體內導致單純性肥胖的發(fā)病。濕邪阻滯氣機，會出現倦怠乏力，機體的活動度、靈活度下降。正氣存內可預防濕、痰等有形實邪的產生,上述正氣之效力與人體免疫系統有異曲同工之處。任何疾病的發(fā)生，都必然是臟腑、經絡、氣血功能的失調，病程久延，還會導致臟腑、經絡、氣血的損傷，即正氣虧虛；免疫功能是正氣的重要方面，即抗病能力，當人體免疫功能受損時,容易受到邪氣的侵襲而致病。

細胞免疫是機體抗外界免疫的主要手段，細胞免疫中T淋巴細胞在機體抗腫瘤免疫中起調控及免疫監(jiān)視作用。調節(jié)性T細胞最近幾年來研究比較多，在機體內起到免疫調節(jié)作用的T細胞亞群，對人體機體的免疫平衡狀態(tài)的維持起了重要作用,其數量或功能的異常往往與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展相關。目前認為Tregs主要有CD4+Treg和CD8+Treg等亞群，CD4+Treg細胞,在維持機體自身耐受和調控免疫應答水平中起重要作用[4-6]。CD4+Th1細胞也可分泌白細胞介素2 (Interleukin 2, IL-2)和γ干擾素 (Interferon γ, IFN-γ)，參與調節(jié)細胞免疫,輔助細胞毒性T淋巴細胞分化,介導細胞免疫應答[7]。CD8+T淋巴細胞又稱為細胞毒細胞，起免疫抑制作用，可以殺傷受感染的細胞，包括被HIV等病毒感染的CD4+T淋巴細胞[8-9]。正常狀態(tài)下，人體中 CD4+/CD8+的比值保持平衡，免疫功能相對比較穩(wěn)定[10]。對照組的脾細胞的免疫功能：在整個淋巴細胞中，CD3+與CD4+所占的比率為(31.66±0.83)%，CD3+與CD8+所占的比率為(20.79±1.96)%，單純性肥胖模型組脾細胞的免疫功能：CD3+與CD4+所占的比率為(27.00±1.72)%，CD3+與CD8+所占的比率為31.35%。單純性肥胖模型組脾細胞的免疫功能： CD3+與CD4+所占的比率為27.27%，CD3+與CD8+所占的比率為(31.27±1.65)%。單純性肥胖模型組CD3+與CD4+在整個淋巴細胞中所占的比率降低，CD3+與CD8+在整個淋巴細胞中所占的比率增高，由此提示單純性肥胖模型的大鼠的免疫功能受到很大影響。

研究結果顯示,造模前各組大鼠體質量差異無統計學意義。單純性肥胖模型組造模后,大鼠體質量明顯增加20%以上,與對照組比較有顯著差異。脾虛濕阻型單純性肥胖大鼠的一般情況包括體質量、精神狀態(tài)、飲水量、活動狀態(tài)、排泄物性狀等都較對照組有明顯改變。說明飲食自倍，腸胃乃傷。尤其是脾主運化水谷功能的失常。然而與對照組相比，單純性肥胖模型組血清血脂四項生化分析(包括總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)沒有顯著變化(P>0.05)。說明在體重增加后，短時間內血清血脂不會發(fā)生顯著變化。這也是臨床單純性肥胖病人血清生化指標檢測正常的原因，此時已是亞健康狀態(tài)，但血清生化指標尚未有大的變化的實驗依據。但造模成功后，免疫指標發(fā)生了顯著變化，單純性肥胖機體抵抗力明顯下降，說明免疫指標較血清生化指標更早提示機體病理狀態(tài)。