張 帥 黃思詩 張榮昶 龔小妹

1.防城港市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 防城港 538021；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530000；3.廣西藥用植物園,廣西 南寧 530000

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的治療難題，作為慢性復(fù)雜類疾病之一，發(fā)病率和致死率都較高，其發(fā)病機制并不清楚，好發(fā)于中老年，生存周期短，生存質(zhì)量低[1-2]。目前對于肺纖維化最有效的方法就是肺移植，但是肺移植手術(shù)價格昂貴，肺供體稀缺，在臨床上推廣使用較少。臨床實踐和現(xiàn)代試驗表明中醫(yī)藥對防治肺纖維化具有一定的優(yōu)勢，可以改善患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)將肺纖維化歸于“肺痿”“肺痹”“肺脹”等范疇[3-5]。中醫(yī)認為肺間質(zhì)纖維化主要發(fā)病機制是氣虛血瘀、痰熱互結(jié)痹阻肺絡(luò)。通塞宣肺合劑由牛大力、黃芪、三七、芒果葉組成。牛大力、黃芪性溫而味甘，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有補氣潤肺之效；三七活血化瘀，芒果葉清熱祛痰止咳，全方共奏補肺益腎，止咳祛痰，活血化瘀之功。現(xiàn)代研究[6-7]表明黃芪、三七、芒果葉對肺纖維化都有一定的干預(yù)作用。本研究通過觀察通塞宣肺合劑對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的炎癥因子影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡昆明種雄性小鼠，體重18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。合格證號：scxk桂2016-0002。

1.2 藥物與試劑 注射用鹽酸博萊霉素(批號：210082，日本化藥株式會社)；乙醚(批號：ws20050411，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；黃芪(批號：130901)、三七(批號130902)、芒果葉(自采)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室覃文慧鑒定為正品。鹽酸(成都科龍化學(xué)試劑有限公司)；冰乙酸(AR)(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(批號：130608，廣州白云山天心制藥股份有限公司)。羥脯氨酸(HYP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-4、TNF-α試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 儀器 BX60顯微鏡(OLYMPUS)、TGL-16B和TGL-16C型高速臺式離心機、高速低溫離心機(Heraeus LG16-W)、全波長酶標(biāo)儀(Epoch Biotek公司)、TU-1901/1900 紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)、EL204電子天平( 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、GZX-DH·400型電熱恒干燥箱(上海躍進公司)、HH·B11·360型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進公司)、BX-60型研究級顯微鏡(OLYMPUS )、YQ-3勻漿器；德國Leitz1512型石蠟切片機；病理圖像分析儀(德國Leica公司)。

1.4 造模與分組 取6～8周健康昆明種雄性小鼠48只，隨機分為6組，每組8只，空白組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、陽性組(地塞米松)、通塞宣肺合劑制劑高劑量組、通塞宣肺合劑制劑中劑量組、通塞宣肺合劑制劑低劑量組。各組小鼠乙醚麻醉后，仰位固定，用手托住小鼠呈直立狀，配合小鼠呼吸，從鼻腔緩慢滴入無菌鹽酸博萊霉素溶液(6 mg/kg)，空白組滴入等量無菌生理鹽水，滴完后保持直立20 s，連續(xù)觀察14 d，小鼠出現(xiàn)咳嗽、乏力、冷顫現(xiàn)象，模型即建立完成。

1.5 實驗給藥 各組于造模14 d后開始相應(yīng)的藥物干預(yù)，空白組和模型組采用生理鹽水(NS)灌胃，陽性組給予地塞米松(1 mg/kg)灌胃，其余各組每天分別給予通塞宣肺合劑高劑量組(5.00 mg/kg)、通塞宣肺合劑中劑量組(3.30 mg/kg)、通塞宣肺合劑低劑量組(1.65 mg/kg)灌胃。

1.6 觀察指標(biāo) 各組小鼠分別于造模后第28天采集標(biāo)本摘眼球取血后靜置析出血清后，于4 ℃離心機以3000 rpm離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y定指標(biāo)用。打開小鼠胸腔，取出左側(cè)肺組織保存至-80 ℃冰箱，分別用 ELISA法檢測肺組織中白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子(TNF-α)含量水平，堿水解法測定肺組織中羥脯氨酸(HYP)的含量。操作按照試劑盒操作說明書進行。

肺右大葉固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟處理，分別用HE和Masson染色觀察肺組織病理改變以及肺纖維化程度。HE染色病理切片(Szapiel方法)分為4級。I級(0分)：無肺泡炎癥；II級(1分)：輕度肺泡炎癥，單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的30%，肺泡結(jié)構(gòu)一般正常；III級(2～3分)：中度肺泡炎癥，受累面積占全肺的30%～70%，近胸膜部比較嚴(yán)重；IV級(4分)：重度肺泡炎癥，受累面積大于70%，偶然會見到肺泡腔內(nèi)有單核細胞和出血造成的實質(zhì)性變化。

Masson染色病理切片，將肺纖維化程度分4級。I級(0分)：無肺纖維化；II級(1分)：輕度肺纖維化，受累面積小于20%；III級(2分)：中度肺纖維化，受累面積占全肺的20%～50%；IV級(3分)：重度肺纖維化，受累面積大于50%，肺泡結(jié)構(gòu)比較紊亂。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況 空白組小鼠皮毛健康無松散，具光澤，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)，未有咳嗽現(xiàn)象；模型組小鼠剛剛造模后會出現(xiàn)撓頭、躁動不安現(xiàn)象，隨著實驗的進行，體重會下降；精神萎靡不振；毛發(fā)松散，無光澤；呼吸困難、急促，偶有喘鳴聲，多有咳嗽；用藥組小鼠的一般狀況較模型組好。與空白組小鼠比較，模型組體重下降相對比較明顯(P<0.01)，其余各組小鼠的體重均呈現(xiàn)出了不同程度的減輕；陽性組、通塞宣肺合劑高劑量組小鼠體重較模型組增加(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組小鼠 體重比較

2.2 各組小鼠肺組織中HYP、IL-4 、IL-10、TNF-α的含量 通塞宣肺合劑高劑量組小鼠HYP、IL-4、TNF-α的表達水平顯著性地降低(P<0.01)，中、低劑量組有所降低(P<0.05)；IL-10含量表達顯著性的增高(P<0.01)，中、低劑量組有一定的效果(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肺組織中HYP、IL-4 、IL-10、TNF-α水平比較

2.3 各組小鼠肺組織中TGF-β1mRNA的表達水平 通塞宣肺合劑高劑量組小鼠TGF-β1mRNA的表達水平顯著性地降低(P<0.0 1)，中、低劑量組有所降低(P<0.05)，低劑量組有一定的效果(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠肺組織中TGF-β1mRNA的表達水平

2.4 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察，對照組肺結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮細胞、肺間質(zhì)血管上皮細胞未見或少見炎癥細胞浸潤，支氣管、肺泡、血管壁均未見膠原纖維明顯增生；肺泡炎癥與肺纖維化程度評分均為0分；模型組小鼠均有肺泡炎，表現(xiàn)為肺泡充血、水腫，部分肺泡有透明膜形成，肺泡上皮細胞有中至重度損傷，肺泡炎稍減輕；肺纖維化程度最重，多呈III級肺纖維化變化，膠原纖維組織增生、變厚，肺氣腫嚴(yán)重；肺泡炎癥與肺纖維化程度評分均為3分，與對照組比較，差異顯著(P<0.01)。各給藥組肺泡炎癥與肺纖維化程度均有明顯的改善，評分均為2分，與模型組比較，差異顯著(P<0.01)。肺組織病理學(xué)分析結(jié)果如圖1、圖2和表4所示。

表4 各組小鼠肺泡炎癥、肺纖維化程度比較

3 討論

肺纖維發(fā)病機理復(fù)雜，臨床對肺纖維化的治療仍然是一個難題，中藥復(fù)方對防治肺纖維化具有一定的優(yōu)勢。通塞宣肺合劑是按照肺纖維化氣虛、血瘀、痰熱的機理組成的經(jīng)驗用方，由牛大力、黃芪、三七、芒果葉組成，牛大力、黃芪性溫而味甘，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有補氣潤肺之效；三七活血化瘀，芒果葉清熱祛痰止咳，全方共奏補肺益腎，止咳祛痰，活血化瘀之功。

肺纖維化是由于細胞外基質(zhì)和成纖維細胞過度沉積而導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)異常修復(fù)的一類疾病[8-9]。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要有形成分，肺內(nèi)結(jié)締組織的成分絕大部分是膠原，它分布于肺泡壁、支氣管、胸膜和血管等所有肺組織中，因此膠原的異常沉積是肺纖維化的標(biāo)志性改變[10]。肺纖維化中由于細菌、病毒等多種致病因素的作用，導(dǎo)致肺泡炎癥細胞分泌多種生物活性物質(zhì)，誘導(dǎo)纖維母細胞合成、分泌大量的膠原成分，使得肺中膠原的合成速度大于降解速度，膠原纖維明顯增多，從而導(dǎo)致膠原的逐漸積累，以上構(gòu)成了肺纖維化的病理學(xué)基礎(chǔ)[11]。而 HYP 是膠原中的一種特有的氨基酸，在膠原蛋白中含量約占 13%～14%，在彈性蛋白中占極少量，在其它蛋白中則不存在，因此當(dāng)膠原代謝發(fā)生異常時，組織內(nèi) HYP 含量發(fā)生相應(yīng)的變化，在膠原蛋白水平檢測方面，HYP的含量可作為特異性的判斷纖維化程度的指標(biāo)[12-13]。

TNF-α是TH1細胞分泌的促炎癥因子，可加速中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的增殖， 加速炎癥反應(yīng)，加快肺纖維化的形成；TNF-α還能促進IL- 4的生成，激活成纖維細胞[14-16]。實驗結(jié)果表明，通塞宣肺合劑能夠降低IL-4的含量，同時減少IL-10的水平，與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。通過對各組小鼠一般狀態(tài)觀察分析，用藥組小鼠體重、精神狀態(tài)；毛發(fā)光澤和組織切片觀察HE染色、Masson染色觀察；呼吸狀況等方面較模型組好，從整體上反映出通塞宣肺合劑對肺纖維化小鼠有一定的治療作用。表明了通塞宣肺合劑能在一定程度地抑制炎性細胞浸潤，抑制膠原纖維的沉積，從而起到了防治肺間質(zhì)纖維化的作用，縮短了病變的進程，可以用于阻逆早期纖維化。