陳敏珊 王真史 李 平 陶 麗

(廣州薇美姿實業(yè)有限公司，廣東廣州 510665)

引言

根據2017年公布的第四次全國口腔健康流行病學調查結果顯示，我國中年人牙石和牙齦出血檢出水平較高，與10年前相比牙齦出血檢出率上升了10.1個百分點，牙周健康狀況有待提高[1]?？谇谎装Y被認為是宿主對入侵病原體保護作用的不良結果，口腔炎癥性疾病如牙齦炎、牙周炎等，不僅危害口腔健康而且與全身疾病有著密切關系，嚴重時可引起全身炎癥反應。牙周局部炎癥會破壞上皮的完整性，導致致病菌擴散到循環(huán)系統(tǒng)。同時牙周袋內含有大量的炎癥介質，尤其是與慢性炎癥相關的炎癥介質，如白細胞介素、腫瘤壞死因子α、以及前列腺素均會由牙周袋進入血液循環(huán)系統(tǒng)從而引起系統(tǒng)性炎癥反應?？谇谎装Y與全身系統(tǒng)性疾病，包括心血管系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[2-3]?？谇蛔o理用品作為一類日常必需品，在預防與減緩初期口腔炎癥有著重要的作用。因此如何研制出療效快、顯效好的抗炎功效成分并應用、開發(fā)出具有預防與減緩初期口腔炎癥的口腔護理產品是現階段口腔護齦領域的研究熱點?？谇蛔o理產品的抗炎驗證方法一直是行業(yè)中所面臨的難點。2009年3月，歐盟要求禁止對化妝品成分進行動物實驗，并且禁止對成品或者成分進行過局部/急性動物實驗的化妝品銷售。歐洲、美國、日本等地區(qū)或國家已成立動物實驗替代機構旨在積極推動替代方法進行更為系統(tǒng)而深入的研究，目前已順利完成相關技術儲備，并通過立法程序建立起相應的技術性貿易措施體系。我國現也已有和國際接軌的相關法律法規(guī)，以體外替代試驗方法取代傳統(tǒng)的動物試驗[4]。《醫(yī)療器械生物學評價第1部分：評價與試驗(GB/T16886-1)》提到：只要科學上證明能獲得與動物試驗同樣的信息，建議優(yōu)先采用體外模式。前期我司已經建立采用單層細胞建立了用于口腔護理產品的體外抗炎、修復損傷功效模型，即2D模型。在大量的應用數據中發(fā)現，經過2D模型測試的功效產品直接用動物模型或臨床實驗模型進行功效評價，結果存在著一定的局限性。本研究以正常的人體口腔黏膜生理結構和功能為基礎，構建了口腔黏膜體外三維細胞模型,即3D口腔模型。同時，立足于含救必應提取物的口腔護理產品的抗炎功效測試，對比2D模型、3D口腔模型、動物實驗和臨床實驗的相關性，探討了口腔黏膜體外三維細胞模型應用在口腔護理產品功效驗證中的可行性。一方面，可以尋找并建立更加快捷可靠的抗炎評價方法；另一方面，也是為口腔護理行業(yè)動物替代實驗進行探索，最終旨在為口腔護理產品開發(fā)及功效驗證提供一個新思路。

1 3D口腔粘膜模型介紹

1.1 口腔黏膜的結構與功能[5]

口腔黏膜覆蓋于口腔表面，正常的人體口腔黏膜生理結構包括固有層和上皮層。其中，上皮層為復層鱗狀上皮，主要由角質細胞構成，此外還有少數非角質細胞。固有層由致密的結締組織組成。固有層的基本細胞成分是成纖維細胞，有合成和更新纖維及基質的功能。固有層的纖維主要是Ⅰ型膠原纖維。口腔黏膜根據所在的部位和功能不同可分為三類，即咀嚼黏膜、被覆黏膜和特殊黏膜。

口腔黏膜具有的保護性功能主要體現在抵抗機械刺激和限制微生物和毒性物質的侵入。咀嚼期間口腔黏膜常常承受壓力、切力、牽拉力和磨擦力，黏膜的結構適應于承受這些力。例如硬腭和附著齦黏膜有角化層以抵抗磨擦，并且緊密附著于其下方的骨組織以抵抗切力和壓力；頰黏膜易于活動并富有彈性利于組織的擴展，從而可緩解牽拉力。口腔內有大量的微生物以及它們的毒性產物和其他潛在的有害物質，口腔黏膜上皮是限制它們進入機體的主要屏障。

口腔黏膜還有感覺功能，可對疼痛、觸動和溫度做出反應，還有特殊的感覺系統(tǒng)即味覺。在某些方面，感覺功能具有保護性，因為口腔黏膜的感受器能啟動吞咽、惡心和流涎等反射。因此口腔黏膜還與唾液的分泌以及某些藥物的滲透性吸收有關。

1.2 口腔炎癥

口腔炎癥是口腔疾病發(fā)病的早期征兆，最常見的口腔炎癥表現為牙齦發(fā)紅、腫脹、易出血，嚴重時牙齦緣可有潰瘍和假膜形成，并伴有疼痛感。細菌感染、外物刺激以及食物嵌塞是引起口腔炎癥的主要原因，其中最常見的是細菌感染?？谇皇侨梭w最復雜的生態(tài)微環(huán)境之一，約有700多種微生物?？谇晃⑸锱c宿主之間存在共生、競爭、拮抗及相互制約的特殊關系。一旦這種關系失調，特異性致病菌數量增多，細菌及其毒性產物就可啟動牙周的初期炎癥過程。即細菌及其毒性產物刺激上皮細胞通過受體介導產生細胞因子，同時釋放神經肽，引發(fā)局部血管舒張[6]。釋放的趨化因子引發(fā)第一道防線：免疫細胞離開血管，遷移到微生物入侵的地方，清除入侵的細菌，產生細胞因子和趨化因子，激活淋巴細胞介導的適應性免疫反應。在此階段口腔炎癥的臨床癥狀表現為出血、腫脹和牙齦發(fā)紅，即為牙齦炎[7]。若宿主防御功能旺盛并得到適當治療，初期口腔炎癥會被免疫細胞控制或清除。當宿主的防御功能與修復能力低下，無法抵御細菌微生物的侵襲時，細菌及其毒性產物會激活宿主的防御細胞產生并釋放更多的炎癥因子，使口腔炎癥進一步擴大及惡化(圖1)。當炎癥過程延長和轉化為慢性炎癥時，炎癥引發(fā)組織創(chuàng)傷，導致口腔軟、硬組織包括牙槽骨被破壞，臨床上表現為不可逆轉的牙周炎。目前，研究表明引發(fā)牙齦炎癥的致病菌多為G-厭氧菌，主要有牙齦卟啉單胞菌(P.g)、放線共生放線桿菌(A. a)、福賽斯類桿菌(B. f)[8,9]。

圖1 口腔炎癥的發(fā)生機理

1.3 口腔的體外模型

體外口腔模型有二維(2D)貼壁培養(yǎng)和三維(3D)培養(yǎng)兩類。

目前常用于評價口腔原料或口腔護理產品的2D炎癥模型有：脂多糖(LPS)誘導單核/巨噬細胞RAW264.7細胞的炎癥模型，脂多糖(LPS)誘導牙齦成纖維細胞(HGFs)的炎癥模型，或者牙齦卟啉單胞菌(P.g)誘導牙齦成纖維細胞(HGFs)的炎癥模型[10, 11]。二維細胞培養(yǎng)，即單一細胞系貼附于培養(yǎng)器皿表面或懸浮于培養(yǎng)液中生長，細胞分裂、繁殖、細胞數量増加的過程。2D培養(yǎng)過程簡單高效，為人類在科學研究方面提供了巨大的便利。然而，2D培養(yǎng)方法將生長于極復雜的生物體內的細胞離體并進行簡單化、均一化培養(yǎng)，因此2D細胞的生長環(huán)境與體內環(huán)境存在巨大差距，從而導致細胞生物學特征及細胞行為發(fā)生了巨大改變，進而造成2D細胞對產品的應答模式與體內存在顯著差距，這不利于產品的評價與開發(fā)[12]。

體外細胞培養(yǎng)的一個重要原則是需模擬體內細胞生長環(huán)境, 該模擬系統(tǒng)中最重要的核心因素是細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。不同于傳統(tǒng)的二維化單層細胞培養(yǎng), 三維細胞培養(yǎng)技術(3D) 是指將具有三維結構不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng), 使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長, 構成三維的細胞-載體復合物。三維細胞培養(yǎng)是將細胞培植在一定的細胞外基質中, 細胞外基質( Extracellularmatrix, ECM) 蛋白充當生長支架, 使得細胞能夠分化產生一定的三維組織特異性結構, 所創(chuàng)建的細胞生長環(huán)境, 則最大程度地模擬體內環(huán)境。3D作為體外無細胞系統(tǒng)及單層細胞系統(tǒng)的研究與組織器官及整體研究的橋梁,顯示了它既能保留體內細胞微環(huán)境的物質及結構基礎,又能展現細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。近幾年三維細胞培養(yǎng)技術在組織形成、血管發(fā)育和器官再造等發(fā)育生物學的分支領域得到了廣泛的應用；同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗方面, 利用三維培養(yǎng)獲得了和二維單層培養(yǎng)完全不同的結果, 引起了藥物學家的極大興趣[13, 14]?，F階段，國內外報道的三維(3D)培養(yǎng)技術應用于口腔炎癥的模型比較少，國內已報道的口腔黏膜模型只構建了口腔黏膜上皮層，并且以口腔黏膜鱗狀癌細胞為種子細胞，不能很好地反映人天然口腔黏膜結構。因此本研究旨在構建一種與人體口腔黏膜上皮組織的結構及功能高度相似的體外口腔黏膜上皮模型，探討其在口腔護理產品的抗炎功效的應用，填補我國在口腔黏膜體外三維細胞模型及在口腔護理產品中應用的空白。

2 用于口腔護理產品抗炎功效驗證的3D口腔粘膜模型建立

2.1 實驗材料和方法

2.1.1 試劑與儀器

人白介素6 ELISA試劑盒、人介素1β Elisa試劑盒(中國，武漢華美生物工程有限公司)，細胞毒性檢測試劑盒說明書(中國，Beyotime)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國，Gibco)，CO2培養(yǎng)箱(美國，Thermo)，Tecan Infinite M200 Pro酶標儀(瑞士，Tecan)。

2.1.2 細胞培養(yǎng)

人牙齦成纖維細胞株HGF-1(ATCC? CRL-2014TM, Rockville, MD, USA)細胞培養(yǎng)于含有20%牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，添加100 U/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素(美國Hyclone公司)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內。人口腔角質HOKs細胞 (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA)用特殊的培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體培養(yǎng)方法根據說明書。

2.1.3 菌株培養(yǎng)

在含有0.001%的氯高鐵血紅素和0.0001%的維生素K (THB-HK)的Todd Hewitt肉湯(BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)中厭氧培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌P.g (P.gingivalis ATCC 33,277)。

2.1.4 人口腔黏膜體外三維細胞模型的建立[15, 16]

將HOKs細胞種植在膠原包埋人齦成纖維細胞收縮而成的真皮層上，待HOKs細胞長至多層，氣提培養(yǎng)7 d，分成含基質層、棘層、肉芽層、角質層的人工皮膚?；讓拥呐渲茫喝ollagen I、DMEM培養(yǎng)基、FBS(牛血清)按照1∶2∶1比例混合，置于PET膜上，于25℃條件下靜置1 h，再移至37℃培養(yǎng)箱靜置1 h。固有層的配置：取Collagen I、DMEM培養(yǎng)基、FBS(牛血清)按照1∶2∶1比例混合，將混合液重懸HGF-1細胞，使其密度為1.5×105個/mL，置于基底層上，于25℃條件下靜置1 h，再移至37℃培養(yǎng)箱靜置1h。固化后，加入培養(yǎng)液Ⅱ浸泡固化后的固有層，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7天，得固有層。上皮層的配置：舍棄部分固有層培養(yǎng)基，使固有層表面沒有液體，以便于表皮細胞均勻附著在真皮層；取HOKs細胞(1.5×105個/mL)平鋪于所述固有層，于37℃孵育2 h使HOKs細胞完全附著在固有層上，加入口腔角質細胞的擴增培養(yǎng)培養(yǎng)液，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天；之后進行氣液界面培養(yǎng)，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3天后。將上皮培養(yǎng)基舍棄，加分化培養(yǎng)基進行氣液界面培養(yǎng)7天得成熟的全層3D口腔黏膜。

2.1.5 組織學切片[17]

2.1.5.1 取材：新鮮組織用固定液固定24 h以上。將組織從固定液取出在通風櫥內用手術刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應的標簽放于脫水盒內。

2.1.5.2 脫水浸蠟：將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水。脫水處理的步驟具體如下：

a)采用濃度為75%的酒精脫水處理4 h；

b)采用85%酒精脫水處理2 h；

c)采用90%的酒精脫水處理2 h；

d)采用95%的酒精處理1 h；

e)使用無水乙醇處理30min；

f)使用無水乙醇處理30min；

g)使用醇苯處理5-10min；

h)使用二甲苯處理5-10min；

i)使用二甲苯處理5-10min；

j)使用溫度為65℃的融化石蠟處理1 h；

k)使用65℃的融化石蠟處理1 h；

l)使用65℃的融化石蠟處理1 h。

2.1.5.3 包埋：將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟凝固之前將組織從脫水盒內取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對應的標簽。于-20℃凍臺冷卻，蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整蠟塊。

2.1.5.4 切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機切片，厚4 μm。切片漂浮于攤片機40℃溫水上將組織展平，載玻片將組織撈起，在烘箱內60℃的溫度下烤片。水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5.5 B.HE染色

a)石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ中20min、二甲苯Ⅱ中20min、無水乙醇Ⅰ中5min、無水乙醇Ⅱ中5min、75%酒精中5min，最后用自來水洗。

b)蘇木素染色：將上述切片置于蘇木素染液中染3～5min，用自來水清洗，采用分化液分化，再次清洗，返藍液返藍，最后用流水沖洗。

c)拍攝：正置光學顯微(日本尼康，Nikon Eclipse E100)在不同倍鏡下拍照。

2.1.6 體外2D模型評估產品的抗炎性能[18]

HGF-1細胞(5×104個/孔)接種于24孔板中暴露于稀釋后的口腔護理產品后用P.g(1.6×106CFU/mL)刺激。24h后, 收集離心上清液。取120μL上層清液進行細胞毒性檢測，操作根據細胞毒性檢測試劑盒說明書(Beyotime, Beijing, China)，如2.1.8。同時再取120μL上層清液進行抗炎檢測，白介素(IL)-6和IL-1β蛋白質分泌的含量檢測操作根據ELISA試劑盒說明書,如2.1.9。

2.1.7 體外3D模型評估產品的抗炎性能

將成熟的全層3D口腔黏膜連同Transwell小室轉移到裝有1.5mL培養(yǎng)基的6孔板中，將稀釋后的口腔護理產品和P.g(1.6×106CFU/mL)涂抹于口腔黏膜的上皮層上，孵育24h后，收集離心上清液。取120μL上層清液進行步驟2.1.8細胞毒性測試，再取120μL上層清液進行步驟2.1.9酶聯免疫吸附實驗。

2.1.8 細胞毒性測試

細胞毒性測試操作根據乳酸脫氫酶細胞毒性檢測劑盒說明書。

細胞毒性(%) =(受試組OD值-溶劑對照組OD值)/(細胞最大酶活性OD值-溶劑對照組OD值)×100

2.1.9 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)

IL-1β和IL-6是牙周炎癥中最突出的兩個炎癥因子，它可以調節(jié)其他細胞因子的作用，在發(fā)生炎癥時其表達水平增加。可通過ELISA方法檢測待測樣品對這些炎癥相關因子的影響從而了解其抗炎作用的機理。IL-1β和IL-6的含量檢測操作根據ELISA試劑盒說明書。

炎癥因子抑制率(%) =(模型組炎癥因子含量-受試組炎癥因子含量)/(模型組炎癥因子含量-溶劑對照組炎癥因子含量)×100

2.1.10 小鼠耳腫脹TPA致炎模型評估產品的抗炎性能[19]

取雄性昆明種小鼠，體重18～22g，小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，根據樣品數量隨機平均分組，每組4只，即TPA模型對照組、丁硼乳膏組(陽性對照組)、含復合物牙膏組。含復合物牙膏組每只動物的右耳里外兩面分別涂布適量膏體，每天早晚各1次，連續(xù)3天，該動物的左耳作為自身空白對照。陽性對照組處理方式同含復合物牙膏組，施加樣品為丁硼乳膏。末次涂含復合物牙膏及丁硼乳膏10min后，將小鼠右耳內外兩側涂10 uL TPA(25 μg/mL)，模型組同樣方式進行處理，6 h之后，脫臼處死動物，擦凈耳部所涂的膏體(左耳同樣進行擦洗操作)，沿耳廓基線剪下兩耳，用6.5 mm打孔器沖下左右兩耳同一部位的圓片，稱重(精確到0.0001g)，同一只動物左右耳的重量差即為腫脹度。

腫脹率(%) =(TPA組腫脹度—受試組腫脹度)/TPA組腫脹度×100

2.1.11 臨床測試評估產品的減輕牙齦炎癥性能[20]

進行隨機、雙盲、對照、平行的臨床研究。納入標準：

a)全身健康狀況良好、無全身系統(tǒng)性疾病、有20顆以上的完好牙齒；

b)年齡在18～70周歲；

c)如果為女性，不得處于妊娠期和哺乳期內；

d)改良Quigley-Hein菌斑指數≥1.5；

e)Loe-Silness齦炎指數≥1.0；

f)沒有同時參加其他類似試驗研究；

g)簽署知情同意書，能按要求完成臨床試驗。

排除標準：

a)戴正畸器具；

b)有部分義齒；

c)軟硬組織有腫瘤；

d)嚴重牙齦炎；

e)1個月內使用抗生素；

f)參加其他臨床試驗；

g)吸毒及酗酒。

共100名研究對象參加了臨床研究，隨機分為含復合物牙膏組(試驗組)與不含復合物牙膏組(對照組)，對全部實驗對象進行潔牙。給受試者統(tǒng)一發(fā)放各自相應的牙膏和軟質牙刷，要求受試者按規(guī)定一日刷牙2次(早、晚)，每次時間至少1min。要求實驗過程中不使用任何其他口腔衛(wèi)生用品。對飲食和抽煙不作限制。6周時補充實驗的牙膏和牙刷。在使用牙膏牙刷6周和12周時，對受試者牙菌斑和牙齦炎狀況按照基線檢查的程序進行再評估。

檢查指標(第三磨牙除外)：

菌斑指數(Quigley-Hein改良Turesky菌斑指數，PI)：檢查每個牙頰面及舌的近中，中及遠中面。

齦炎指數(改良Loe-Silness齦炎指數，GI)：檢查每個牙頰面及舌的近中，中及遠中面。

PI和GI由2位已經過自身校正合格的醫(yī)師檢查。在基線檢查PI后，所有牙面的菌斑用橡皮環(huán)和拋光膏去除。

2.1.12 數據統(tǒng)計與分析

每個實驗至少獨立重復3次，數據以均數±標準差(M±SD)表示，采用GraphPad計算機軟件對所得數據進行分析，組間比較采用ANOVA統(tǒng)計學分析，運用Newman-Keuls方法計算顯著性差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 實驗結果

2.2.1 3D口腔粘膜模型的構建過程和組織學切片

口腔黏膜體外三維細胞模型的構建過程如圖2所示。人體口腔黏膜模型的制備方法模擬人體口腔黏膜的生長發(fā)育過程，制備周期短，方法簡易，可控性強，原料易于獲取，可實現大規(guī)模產業(yè)化生產，保證維持口腔黏膜各層細胞生長的微環(huán)境，制備的全層口腔黏膜更接近于正常人體口腔黏膜結構，并具備相應的功能性，在體外條件下其功能和活性維持時間，能夠滿足相關口腔黏膜生物學檢測的需求。既彌補了傳統(tǒng)的使用單層黏膜組織模型的方法的缺陷，在縮短構建時間、降低成本的同時，又保證了模型的安全性與功效性。

圖2 口腔黏膜體外三維細胞構建的簡圖

為了能夠直觀地觀測到所得的人體口腔黏膜模型的結構，采用組織學切片分析方法，并將所構建的人體口腔黏膜模型置于光學顯微鏡下觀測。結果顯示，該3D口腔黏膜自上而下分別為由上皮細胞生發(fā)復層分化組成的上皮層，由成纖維細胞及其胞外基質組成的固有層組合(圖3)，表明該模型構建的有效性。

圖3 對構建的口腔黏膜體外三維細胞模型行組織學切片

2.2.2 牙齦卟啉單胞菌誘導3D口腔粘膜的炎癥模型的構建

評價牙齦卟啉單胞菌對細胞的毒性，采用LDH分析方法。結果顯示，P.g在濃度為1.6×103-1.6×106CFU/mL時無細胞毒性(表1)。將安全劑量范圍內的P.g涂抹于口腔黏膜的上皮層上，分別孵育；在P.g對3D口腔黏膜無毒性劑量范圍內，本研究檢測了它誘導3D口腔黏膜8、14和24小時后產生IL-1β和IL-6量。實驗結果如圖4所示，與空白對照組相比，1.6×104-1.6×106CFU/mL的P.g在8h和24h時能顯著地誘導3D口腔黏膜分泌IL-1β和IL-6量。并且濃度為1.6×106CFU/mL的P.g誘導3D口腔黏膜24h后，3D口腔黏膜分泌的IL-1β和IL-6量最多，所以選在P.g濃度為1.6×106CFU/mL，誘導時間為24h進行后續(xù)抑制炎癥的實驗。

圖4 P.g刺激3D口腔黏膜分泌IL-1β和IL-6量

表1 不同濃度的牙齦卟啉單胞菌的細胞毒性

數據以3個不同實驗的平均值±標準差表示。

不同濃度牙齦卟啉單胞菌(1.6×103-1.6×106CFU/mL)對誘導3D口腔黏膜炎癥的影響。每個實驗至少獨立重復3次，數據以均數±標準差(M±SD)表示。(*** P<0.001 vs. controlgroup)

2.2.3 口腔護理產品對卟啉單胞菌誘導的2D口腔細胞釋放IL-6和IL-1β的抑制作用

首先采用LDH分析方法評價口腔護理產品對HGF-1細胞的毒性。結果顯示在200ug/mL時，空白牙膏對照組、含救必應牙膏組和丁硼乳膏組顯示未有細胞毒性(表2)。因此在安全劑量下，采用ELISA分析方法檢測，其對P.g誘導的HGF-1細胞的IL-6和IL-1β的抑制作用。圖5顯示，空白牙膏對照組對IL-6和IL-1β的抑制率達到了57.2%和56.76%，與含救必應牙膏組和丁硼乳膏組未有顯著性差別?？梢娢醇庸π锏难栏嘁灿锌寡鬃饔茫崾敬?D口腔細胞不適合應用于產品的抗炎功效評價。

圖5 口腔護理產品刺激2D口腔細胞分泌IL-1β和IL-6量

表2 口腔護理產品對卟啉單胞菌誘導2D口腔細胞的細胞毒性

數據以3個不同實驗的平均值±標準差表示。

200ug/mL空白牙膏、含救必應牙膏和丁硼乳膏對P.g (1.6×106 CFU/mL) 刺激細胞24h后，IL-6和IL-1β產量的影響。每個實驗至少獨立重復3次，數據以均數±標準差(M±SD)表示。

2.2.4 口腔護理產品對卟啉單胞菌誘導的3D口腔黏膜釋放IL-6和IL-1β的抑制作用

采用LDH分析方法評價口腔護理產品對3D口腔黏膜的毒性。如表3所示，在20-1000ug/mL的濃度下，空白牙膏對照組、含救必應牙膏組和丁硼乳膏組顯示未有細胞毒性。并且如圖5顯示，空白牙膏對照組對IL-6和IL-1β未有抑制作用。在安全劑量下，相比于空白牙膏對照組，含救必應牙膏組和丁硼乳膏組對P.g誘導的3D口腔黏膜分泌的IL-6和IL-1β有顯著的抑制作用。500ug/mL的含救必應牙膏組和丁硼乳膏組對IL-1β的抑制率到達56.02%和84.96%，對IL-6的抑制率到達78.52%和90.86%。提示，此3D口腔黏膜模型可能適用于產品的抗炎功效評價。

表3 口腔護理產品對卟啉單胞菌誘導3D口腔細胞的細胞毒性

不同濃度空白牙膏對照組(200μg/mL～1000μg/mL)、含救必應牙膏組(200μg/mL～1000μg/mL)、丁硼乳膏組(200μg/mL～1000μg/mL)對卟啉單胞菌(1.6×106CFU/mL)刺激3D口腔黏膜24h后，IL-6和IL-1β產量的影響。每個實驗至少獨立重復3次，數據以均數±標準差(M±SD)表示。(# P<0.05 vs. controlgroup; * P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001 vs. LPSgroup)

圖6 口腔護理產品對卟啉單胞菌刺激3D口腔黏膜釋放IL-6和IL-1β抑制率的影響

2.2.5 口腔護理產品對小鼠耳腫脹TPA致炎模型的抗炎性能作用

為了驗證3D口腔黏膜模型對口腔護理產品的抗炎功效評價的有效性，本項目又進行了小鼠耳腫脹試驗。由表4中的數據可知，含救必應牙膏組和丁硼乳膏組對耳腫脹的抑制率分別達到36%和35%，且無顯著差異，兩款口腔護理產品具有較好的抗炎效果，同3D口腔黏膜模型驗證效果一致。

表4 小鼠耳腫脹TPA致炎模型評估含救必應提取物的口腔護理產品的抗炎性能

2.2.6 含救必應提取物的口腔護理產品的臨床測試

為更進一步驗證3D口腔黏膜模型對口腔護理產品的減輕牙齦炎癥的效果的準確性，本項目進行了臨床試驗。在100名受試者的測試中，86例受試者(實驗組43例，對照組43例)完成試驗。失訪的14例是因為個人和家庭原因，非試驗牙膏的不良反應。兩組在基線時的各項指標基本類似(表5)。

表5 完成研究人群的基線檢查結果

兩組試驗結果分別見表6。6周檢查結果：使用試驗牙膏與對照組比較，6周減少齦上菌斑和齦炎指數分別為1.97%與6.24%。組間均未顯示統(tǒng)計學意義的差異(P>0.05)。12周檢查結果：使用含復合物牙膏組(實驗組)較使用不含復合物牙膏組(對照組)減少齦上菌斑13.95%、含復合物牙膏組(實驗組)較不含復合物牙膏組(對照組)的齦炎指數減少13.77%。PI和GI在組間均顯示統(tǒng)計學意義的差異(P<0.01)。

表6 試驗前后受試者牙齦指數與菌斑指數變化情況

臨床研究表明，使用含復合物牙膏與使用不含復合物牙膏相比，具有控制牙菌斑、抑制牙菌斑的形成，降低齦炎指數，減輕牙齦炎的趨勢，具有改善牙齦健康的作用。12周組間具有統(tǒng)計學顯著性差異(P<0.05)，12周臨床研究未觀察到該牙膏的副作用。

3 討論與分析

本研究以正常的人體口腔黏膜生理結構和功能為基礎，成功開發(fā)了3D口腔黏膜模型。研究構建的3D口腔黏膜模型包括基底層以及固有層之外，還包括上皮層，從而高度接近人體口腔黏膜的上皮組織的結構。由于將成纖維細胞復合于生物支架材料內部，使生物支架材料模擬細胞外基質的作用，在細胞之間形成適宜的空間分布和細胞聯系，并且使上皮細胞在固有層表面接種，通過氣液面培養(yǎng)法使上皮細胞復層化，使該模型接近人體口腔黏膜的上皮組織的結構和功能。該3D口腔黏膜模型制備周期短，方法簡易，可控性強，原料易于獲取，可實現大規(guī)模產業(yè)化生產，保證維持口腔黏膜各層細胞生長的微環(huán)境，制備的全層口腔黏膜更接近于正常人體口腔黏膜結構，并具備相應的功能性。

為驗證所構建3D口腔黏膜模型能夠滿足相關口腔黏膜生物學檢測的需求，本研究立足于含救必應提取物的口腔護理產品的抗炎功效測試，對比2D模型、3D口腔模型、動物實驗和臨床實驗的相關性，探討了口腔黏膜體外三維細胞模型相對應用在口腔護理產品功效驗證中的可行性。一方面，可以尋找并建立更加快捷可靠的抗炎評價方法；另一方面，也是為口腔護理行業(yè)動物替代實驗進行探索，最終旨在為口腔護理產品開發(fā)及功效驗證提供一個新思路。研究結果發(fā)現，3D口腔模型相較于2D模型在口腔護理產品的抗炎功效評估過程中更具有可靠性和準確性。既彌補了傳統(tǒng)的使用單層黏膜組織模型的方法的缺陷，在縮短構建時間、降低成本的同時，又保證了模型的安全性與功效性。未來，3D口腔黏膜模型將成為首選的口腔體外抗炎評價工具。