章瀾 楊媚 王晞 唐艷紅 宋思維 陳玉婷 王騰 黃從新

非編碼RNA(miRNA)參與調(diào)控基因表達(dá)，對(duì)心臟的發(fā)育、心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)收縮、心律的維持等起重要作用[1]。MiR-375 為高度保守的miRNA 之一，現(xiàn)有研究表明MiR-375靶向負(fù)調(diào)控Shox2[2-3]。Shox2被認(rèn)為是竇房結(jié)發(fā)育和功能維持過(guò)程中不可缺少的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[4]。近年來(lái)，利用Wnt信號(hào)通路在心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的雙相性作用，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)已被廣泛用于產(chǎn)生具有自發(fā)和節(jié)律性收縮能力的新生心肌細(xì)胞(CMs)，但其中竇房結(jié)起搏樣細(xì)胞占比相對(duì)較低[5-6]。筆者通過(guò)抑制miR-375敲低工作心肌細(xì)胞譜系特有的基因，探討其修飾的hiPSC 在向人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞(hiPSC-CMs)分化的過(guò)程中能否更高效地向竇房結(jié)起搏樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料

人尿路上皮細(xì)胞來(lái)源的hiPSCs U1細(xì)胞系(北京賽貝生物)，Corning Matrigel(Life Sciences)，m TeSR 培養(yǎng)基、糖原合成激酶3(GSK-3)抑制劑CHIR99021、β-catenin抑制劑(IWR-1-endo)IWR-1-endo ( 加拿大STEMCELL Technologies)，Knock Out-DMEM、RPMI1640 培養(yǎng)基、含胰島素B27、Versene 消化液、不含葡萄糖DMEM(美國(guó)Gibco)，L-抗壞血酸2-磷酸倍半鎂鹽水合物(Sigma)，人腎上皮細(xì)胞系293T 細(xì)胞、攜帶miR-375 inhibitor和GFP基因的慢病毒、GFP空載慢病毒(上海典君生物科技有限公司)，Shox2兔抗、Nkx2.5兔抗、HCN4鼠抗、Isl1兔抗、肌鈣蛋白T(c Tn T)抗體(美國(guó)Abcam 公司)，Carido Easy 人心肌細(xì)胞消化液Ⅰ、Ⅱ(北京賽貝生物)；Trizol試劑(Invitrogen)；倒置熒光顯微鏡(Olympus)，流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACSCalibur)，電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 hiPSCs培養(yǎng)及向hiPSC-CMs分化 將hiPSCs U1 細(xì)胞系接種于包被有胚胎干細(xì)胞專用基質(zhì)膠(Corning Matrigel)的6孔培養(yǎng)板，使用m TeSR培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(美國(guó)Thermo)，每天換液，當(dāng)細(xì)胞匯合至約90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將U1 細(xì)胞系接種于包被有基質(zhì)膠的12 孔培養(yǎng)板準(zhǔn)備分化，使用m TESR 培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度為90% ～100%時(shí)開(kāi)始分化，分化的前兩天在基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基(RPMI1640＋抗壞血酸＋不含胰島素的B27 ＋青鏈霉素)中加入10μmol/L GSK-3抑制劑CHIR 激活Wnt信號(hào)通路以促進(jìn)細(xì)胞向中胚層分化，分化2 d后更換基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，分化第3 d更換基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基并加入5 μmol/L IWR 抑制Wnt信號(hào)通路以促使中胚層細(xì)胞向心肌細(xì)胞富集分化，此后隔天更換基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基[7](圖1)。

圖1 hiPSCs向心肌細(xì)胞分化流程圖

1.2.2 U1 細(xì)胞系向hiPSC-CMs分化效率的檢測(cè)

于分化14 d后用CaridoEasy人心肌細(xì)胞消化液Ⅰ消化細(xì)胞4 min，再用消化液Ⅱ消化10 min，300 g離心10 min，棄上清后加入4%多聚甲醛混勻，室溫固定30 min。離心后棄上清，加入適量封閉液重懸，4℃過(guò)夜。向封閉液中加入適量偶聯(lián)熒光素的抗心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，c Tn T-PE)抗體為CM-c TNT 組，陰性對(duì)照組不加c TNT-PE，輕柔均勻吹打，室溫避光孵育1 h，離心后用400μL 的4℃預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACS Calibur)檢測(cè)，運(yùn)用FlowJo軟件分析c TNT陽(yáng)性率判斷hiPSC-CMs分化效率。

1.2.3 r LV-ZsGreen-Puro-hsa-mir-375 inhibitor慢病毒的構(gòu)建及擴(kuò)增 通過(guò)Bam H I和Eco RI雙酶切回收慢病毒骨架載體質(zhì)粒p LVX-sh RNA2-Puro，設(shè)計(jì)并合成miR-375-inhibitor DNA 片段，將miR-375-inhibitor退火產(chǎn)物與質(zhì)粒p LVX-sh RNA2-Puro回收大片段連接，得到目的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌株，平板挑菌，送陽(yáng)性克隆菌液去測(cè)序驗(yàn)證。將含有目的基因的慢病毒質(zhì)粒p LVXZsGreen-Puro-has-miR-375 inhibitor導(dǎo)入293T 細(xì)胞，產(chǎn)生含目的基因的高滴度的慢病毒[8]。

1.2.4 r LV-ZsGreen-Puro-hsa-mir-375 inhibitor慢病毒轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率 iPSC 開(kāi)始分化2 d后，分別以病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)＝0，10，20，50，80，100轉(zhuǎn)染攜帶r LV-ZsGreen-Puro-hsa-mir-375 inhibitor的慢病毒，加入基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基使總體積為1 ml，混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，感染24 h后，吸棄含病毒的培養(yǎng)液，繼續(xù)正常分化過(guò)程(基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基＋5μmol/L IWR)。感染后72、96 h通過(guò)熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica)觀察。96 h后將各感染細(xì)胞消化，用250 ul PBS重懸后于200目濾網(wǎng)過(guò)濾送檢，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞率。選取引起細(xì)胞狀態(tài)佳、死亡數(shù)目較少的最大MOI為最適MOI值。隨機(jī)將細(xì)胞分為miR-375 組、GFP 組和Null組，各組分別以最適MOI轉(zhuǎn)染攜帶miR-375抑制劑和綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒r LV-Zs-Green-Puro-hsa-mir-375 inhibitor(miR-375 組)和等量帶GFP的空載慢病毒(GFP 組)，Null組不進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。于倒置顯微鏡下觀察記錄轉(zhuǎn)染后每組細(xì)胞每分鐘搏動(dòng)次數(shù)并比較。

1.2.5 MiR-375、起搏細(xì)胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Shox2、Nkx2.5、Isl1)、起搏相關(guān)離子通道超極化激活環(huán)核苷酸門控通道4 型(HCN4)m RNA 的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染12 d 后細(xì)胞miR-375、Shox2、Nkx2.5、Isl1、HCN4 m RNA 的表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參。Trizol提取總RNA，分光光度計(jì)(TECAN)檢測(cè)RNA 的純度和濃度。cDNA 的合成體系：5×Reaction Buffer 4 u L，Oligo d T 1 u L，Enzyme Mix 1 uL，總RNA 1 ug，RNase free water加至20 u L；42℃30 min，85℃5 s；PCR 擴(kuò)增儀(杭州柏恒)。使用SYBR Green I PCR試劑盒于PCR儀(Life Technologies)進(jìn)行PCR，引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，58℃退火10 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 qRT-PCR 各引物名稱、序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.6 起搏相關(guān)蛋白的檢測(cè) 病毒轉(zhuǎn)染12 d后，行蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)，加入適量的細(xì)胞總蛋白提取試劑裂解，冰浴30 min，1 200 g離心5 min，上清即為各組細(xì)胞總蛋白溶液，二喹啉甲酸法(BCA)測(cè)定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2h。GAPDH(1∶10000)、Shox2(1：1000)、Nkx2.5(1∶1000)、Isl1(1∶1000)、HCN4(1∶1000)一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST 沖洗，用HRP 標(biāo)記的二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影。各條帶掃描后分析平均灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 GFP組和miR-375組Shox2及c TNT 表達(dá)的檢測(cè) 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒12 d后，將miR-375組和GFP組分化的心肌細(xì)胞消化后再接種于6 孔板制作細(xì)胞爬片，2～3 d后室溫下用4% 多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton X-100 破膜15 min，3%牛血清封閉30 min后分別加入Shox2或c TNT 的一抗(1∶200)4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，二抗室溫避光孵育1 h，滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室溫核染10 min后，用抗熒光淬滅封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 hiPSCs培養(yǎng)及向hiPSC-CMs分化觀察

傳代培養(yǎng)24 h后鏡下可見(jiàn)hiPSCs形成緊密的多細(xì)胞集落，具有清晰的邊界，細(xì)胞間緊密堆積，具有高核質(zhì)比，且核仁顯著；約3～4 d后細(xì)胞匯合至約90%，可進(jìn)行下一次的傳代(圖2)。hiPSC 成功向心肌細(xì)胞分化，在分化第7 ～9 d可在顯微鏡下觀察到細(xì)胞微弱的收縮搏動(dòng)，分化第14 d時(shí)可觀察到心肌細(xì)胞成片穩(wěn)定且明顯的自發(fā)收縮搏動(dòng)(圖2E、F)。

圖2 hiPSCs形態(tài)及向hiPSC-CMs分化的觀察

2.2 hiPSCs-CMs分化效率鑒定

hiPSC-CMs的c Tn T 陽(yáng)性率為(85.0±4.1)%，即調(diào)控Wnt通路所得分化心肌細(xì)胞純度接近90%(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hiPSC-CMs分化效率

2.3 病毒轉(zhuǎn)染效率

病毒轉(zhuǎn)染96 h后，在熒光顯微鏡下觀察，MOI＝50，80，100 綠色熒光較亮；MOI＝10，20 綠色熒光較暗(圖4)。當(dāng)MOI＝80時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較差，分化效率下降；MOI＝100時(shí)細(xì)胞大幅度死亡，難以繼續(xù)正常分化。結(jié)合流式檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率(表2)及病毒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響，最終選用MOI＝50為最適感染復(fù)數(shù)。于倒置顯微鏡下觀察記錄轉(zhuǎn)染后細(xì)胞每分鐘搏動(dòng)次數(shù)，每組細(xì)胞記錄6例，與GFP 組和Null組比較(P＞0.05)，miR-375 組搏動(dòng)頻率明顯升高[(96±7)次/分vs(63±2)、(67±4)次/分，P均＜0.05]。

圖4 轉(zhuǎn)染96 h后不同MOI值下綠色熒光蛋白的表達(dá)(×100)

表2 不同MOI值下病毒轉(zhuǎn)染效率/%

2.4 三組MiR-375、起搏細(xì)胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Shox2、Nkx2.5、Isl1)、起搏相關(guān)離子通道HCN4 m RNA 的檢測(cè)

三組miR-375、起搏相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Shox2、Nkx2.5、Isl1)及HCN4 m RNA 表達(dá)，GFP 組和Null組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，miR-375組Shox2、Isl1、HCN4表達(dá)水平明顯升高，miR-375和Nkx2.5表達(dá)明顯降低(P均＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組細(xì)胞miR-375及起搏相關(guān)基因m RNA 表達(dá)比較

2.5 三組起搏相關(guān)蛋白表達(dá)比較

三組起搏相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Shox2、Nkx2.5、Isl1)及HCN4蛋白表達(dá)，GFP組和Null組無(wú)差異(P＞0.05)，miR-375 組Shox2、Isl1、HCN4 表達(dá)水平明顯升高，Nkx2.5表達(dá)明顯降低(P均＜0.05)，見(jiàn)圖5及表4。

表4 三組細(xì)胞起搏相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖5 3組起搏相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.6 GFP組和miR-375組Shox2及c TNT 表達(dá)的比較

倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)miR-375 組Shox2 蛋白發(fā)出紅色熒光，而GFP組幾乎未見(jiàn)表達(dá)(圖6)。miR-375組及GFP組均可見(jiàn)c TNT 紅色熒光表達(dá)，約占細(xì)胞總數(shù)80%以上(圖7)。

圖6 GFP組和miR-375組Shox2蛋白表達(dá)(×400)

圖7 GFP組和miR-375組c TNT 蛋白表達(dá)(×400)

3 討論

iPSCs是由已分化的成體細(xì)胞經(jīng)重編程誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種干細(xì)胞類型，可以大量獲得且能避免倫理學(xué)問(wèn)題。運(yùn)用疾病特異性iPSCs可以在體外誘導(dǎo)分化成針對(duì)自體的治療細(xì)胞，目前已用于心血管疾病的藥物篩選、分子基礎(chǔ)模型研究、移植治療等。不少學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)hiPS細(xì)胞進(jìn)行特定的誘導(dǎo)可以使其分化為各類心肌細(xì)胞[9-10]。Wnt信號(hào)通路是心臟發(fā)育的重要信號(hào)通路，在心肌分化中具有典型的雙時(shí)相，經(jīng)典通路表現(xiàn)為“先促后抑”，而非經(jīng)典通路則在分化晚期通過(guò)抑制經(jīng)典通路發(fā)揮促心肌分化的作用[11]。筆者通過(guò)階段性調(diào)控Wnt信號(hào)通路以誘導(dǎo)iPSCs定向分化為hiPSC-CMs細(xì)胞，在體外模擬胚胎向心臟的發(fā)育過(guò)程，于此過(guò)程中提高起搏樣細(xì)胞占比以期望成功構(gòu)建生物起搏的細(xì)胞模型。

MiRNA 是一類非編碼小分子RNA，其與特定靶m RNA 結(jié)合后通過(guò)抑制翻譯或促進(jìn)降解在轉(zhuǎn)錄層面進(jìn)行基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)，多種miRNA 已顯示在心臟發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、心肌細(xì)胞特性、祖細(xì)胞分化遷移增殖和組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用[3]。慢病毒可以整合到宿主細(xì)胞的基因中，更穩(wěn)定的調(diào)控其靶點(diǎn)。本研究通過(guò)在中胚層時(shí)期轉(zhuǎn)染r LV-ZsGreen-Purohsa-mir-375 inhibitor慢病毒，初步探討了在體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中通過(guò)抑制miR-375表達(dá)能增加hiPSCs向起搏樣細(xì)胞的分化效率，觀察到轉(zhuǎn)染miR-375慢病毒后分化細(xì)胞搏動(dòng)頻率明顯加快，從而為利用hiPS構(gòu)建生物起搏的方案奠定基礎(chǔ)。

Shox2是miR-375的直接靶標(biāo)，其在心肌細(xì)胞中的表達(dá)具有較高的特異性，可以激活或參與多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而提高竇房結(jié)細(xì)胞基因譜的表達(dá)。Shox2對(duì)竇房結(jié)發(fā)育的調(diào)控涉及Nkx2.5、Isl1、HCN4等多種基因間的多重調(diào)控和相互作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-375組Shox2 m RNA 和蛋白表達(dá)明顯高于GFP組和Null組，GFP和Null組幾乎無(wú)Shox2蛋白表達(dá)。Nkx2.5是工作心肌細(xì)胞相關(guān)基因之一，Shox2通過(guò)抑制其表達(dá)使起搏細(xì)胞不向心肌方向分化，從而維持竇房結(jié)的正常形態(tài)和功能[6]。本實(shí)驗(yàn)顯示miR-375 組Nkx2.5 m RNA 和蛋白表達(dá)明顯低于GFP 組和Null組。Isl是竇房結(jié)早期發(fā)育的標(biāo)志蛋白之一，HCN4介導(dǎo)的起搏電流是起搏細(xì)胞4 期自動(dòng)去極化的基礎(chǔ)[12]。本實(shí)驗(yàn)證明miR-375組Isl1 和HCN4 表達(dá)明顯升高。綜上研究結(jié)果，起搏細(xì)胞在hiPSC 分化的心肌細(xì)胞中占比增加。另外筆者根據(jù)免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP 組和miR-375組的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物c TNT 蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯差異，且表達(dá)在80%以上，結(jié)合流式分析hiPSC-CM 分化效率大于80%及前期轉(zhuǎn)染病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明在合適的時(shí)間及MOI值下，慢病毒干預(yù)對(duì)iPSC正常分化為心肌細(xì)胞無(wú)明顯影響。

筆者的研究結(jié)果初步說(shuō)明通過(guò)抑制miR-375表達(dá)能使其修飾的hiPSCs在向hiPSC-CMs分化的過(guò)程中更高效地向起搏樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但筆者尚未進(jìn)行相關(guān)電生理檢測(cè)，并且未來(lái)還需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其構(gòu)建生物起搏的有效性及安全性。